本发明属于疾病诊断研究领域,更具体地,本发明涉及乳腺癌高风险基因检测试剂盒及其应用。
背景技术:
乳腺癌是世界女性最常见的恶性肿瘤之一,占女性癌症发病总数的23%,占女性癌症死亡人数的14%。乳腺癌转移复发是患者重要的致死原因,转移后中位生存时间不足2年。在我国,近年来乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。从90年代以来,中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多,城市地区尤为显著。以北京和上海为例,乳腺癌已经连续20年位于女性恶性肿瘤第一位,现在年发病率已达到40/10万以上,并且每年仍以2-3%的速度上升,有逐步接近欧美发达国家水平的趋势。另外,与欧美发达国家女性相比,中国乳腺癌患者绝经前患者占一半以上(欧美不足30%),并且发病年龄高峰较西方女性早5到10年。由于这个年龄段的女性是家庭和社会的中坚力量,进一步突显了乳腺癌对我国社会和家庭带来的巨大危害。同时,上海是中国人口最多的城市,也是乳腺癌发病率最高的城市之一,海市乳腺癌发病趋势代表了未来20年中国城市化进程中的疾病趋势。
乳腺癌的致病原因至今没有完全了解。乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史、较晚的月经初潮年龄、较高的精神压力、较高的身体质量指数(bodymassindex,bmi)及肿瘤家族史等被认为是罹患乳腺癌的重要诱因。乳腺癌的病因从遗传角度而言也有了较多的突破,brca1,brca2,tp53,pten,stk11/lkb1,cdh1,chek2,atm,mlh1,msh2等一系列乳腺癌易感基因的突变也被证明与乳腺癌相关。
但是,本领域仍然需要进一步地优化乳腺癌的诊断试剂或试剂盒,以更未便捷的技术实现更为精密的检测。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供乳腺癌高风险基因检测试剂盒,以及该试剂盒的应用。
在本发明的第一方面,提供一种用于检测乳腺癌患病风险或对乳腺癌进行预后的试剂,所述的试剂是引物对,选自下组:
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在一个优选例中,所述的引物所扩增的基因是包括选自下组的基因:tp53,pten,stk11,cdh1和palb2。
在本发明的另一方面,提供所述的试剂的用途,用于制备混合检测试剂;或用于制备含有该混合检测试剂的试剂盒;或用于制备检测乳腺癌患病风险或对乳腺癌进行预后的试剂盒。
在本发明的另一方面,提供一种用于检测乳腺癌患病风险或对乳腺癌进行预后的试剂盒,所述的试剂盒中含有选自前述的一种或多种引物对。
在一个优选例中,所述试剂盒种含有10~44种引物对;更佳地为20~44种或30~44种引物对。
在本发明的另一方面,提供一种用于检测乳腺癌患病风险或对乳腺癌进行预后的试剂盒,其中含有混合检测试剂,所述的混合检测试剂由表2中10~44种引物对;更佳地为20~44种或30~44种引物对混合而成。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还含有:pcr扩增试剂。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还含有:核酸提取试剂。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还含有:核酸序列分析软件。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还含有:使用说明书。
在本发明的另一方面,提供一种确定待测核酸样品中是否存在乳腺癌相关基因的方法,所述的方法包括:(1)利用前述的引物对待测核酸样品中进行pcr扩增,获得扩增产物;(2)分析(1)扩增产物的基因序列。
在一个优选例中,步骤(2)中,采用测序仪进行基因序列的分析。
在另一优选例中,所述的方法为体外方法。
在另一优选例中,所述的方法为不是以获得疾病诊断结果为目的的方法。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,选择了乳腺癌相关的具有代表性的多个基因,基于所选择的这些基因进行适于扩增的引物设计。所述引物经过合理的设计、优选而获得,针对本发明感兴趣的基因的所有外显子和外显子内含子连接区域序列,并且,用于pcr扩增时特异性良好,且扩增效率高。本发明的方法可进行乳腺癌多基因检测。所述多基因检测的意义远不限于基于个体和其家族进行的临床建议,更能推动癌症筛查和(或)癌症预防的临床建议的优化。
乳腺癌诊断相关的基因及引物
本领域中,认为与乳腺癌相关的基因种类繁多,例如列举于表1中的基因,另外还有较多未列举到但已被本领域人员的基因。
本发明人选择了具有代表性的多个乳腺癌相关基因,基于所选择的这些基因进行适于扩增的引物设计。所述的基因是包括选自下组的基因:tp53,pten,stk11,cdh1和palb2。
表1
本发明人在研究中发现,检测本发明的各个基因突变时,利用一般的引物进行pcr扩增时特异性较差,扩增效率不高。因此,需要设计和筛选特异性好的引物。经过大量的实验和比较,本发明人找到了相对较为理想的44对引物。经验证,所述引物获得的扩增产物包含了具有代表性的序列片段,且特异性非常好,pcr扩增成功率接近100%,特别适用于复杂体系的pcr扩增。各引物的核苷酸序列如实施例中表2所示。
获得扩增产物的方法及应用
可以采用多种技术来检测本发明的各个基因。作为本发明的优选方式,是用特异的引物进行pcr扩增,然后对扩增产物进行序列测定,从而判断是否存在所述基因和/或其存在量。该检测技术既可以针对cdna,也可以针对基因组dna。
本发明人提供了一种优化的从核酸样品中获得本发明的各个基因扩增产物的方法,所述的方法包括:以核酸样品为模板,利用选自表2的引物对进行pcr扩增,获得扩增产物。
利用所述的引物,采用常规的pcr扩增方法即可获得较为理想的扩增结果。一种优选的pcr扩增方法中,pcr热循环步骤如下:(a)98±1℃进行15±2秒;(b)60±2℃进行4±1分钟;重复步骤(a)-(b)18±2次。进行pcr热循环前的模板变性步骤可采用本领域常规的方法。较佳的方法为:95±1℃进行4±1分钟;更佳的是95±0.5℃进行4分钟。
除了采用本发明的引物,本发明对pcr扩增体系中其它各成分及其终浓度没有特别的限制。本领域人员可根据常规建立pcr体系时采用的一般成分及其浓度来建立pcr扩增体系。用于pcr扩增的模板(如基因组dna)也可采用本领域的常规方法提取获得。
采用本发明获得本发明的各个基因扩增产物的方法,扩增效率和特异性均非常理想,且特别适合于复杂体系的pcr扩增,例如以血液基因组dna作为pcr模板的扩增。
本发明还提供了一种确定待测核酸样品中是否存在本发明的各个基因及其存在量的方法。所述的方法包括:采用前述的方法从待测核酸样品中扩增本发明的各个基因片段,获得扩增产物;以及分析扩增产物中本发明的各个基因片段的存在情况以及存在量。
通过判断本发明的各个基因的存在情况以及存在量,可进一步得知受试者的患病风险,从而达到早期监测早期防治的目的。
基于本发明人所选择的各个基因与乳腺癌的密切相关性,可以对乳腺癌的患病人群进行易感性分析、风险性分析或疾病预后分析,还可以对相关人群的患病风险进行早期评估。
在本发明的较佳实施例中,本发明人采用二代测序的方法,利用多重pcr扩增来富集感兴趣基因的所有外显子和外显子内含子连接区域序列,进行深度测序,检测胚系突变。
试剂盒
本发明还提供了用于检测乳腺癌患病风险或对乳腺癌进行预后的试剂盒,该试剂盒包括:前面所述的特异性引物对;或包括混合检测试剂,所述的混合检测试剂由所述的10~44种引物对;更佳地为20~44种或30~44种引物对混合而成。
所述的试剂盒中还可含有:核酸抽提试剂(如核酸抽提液);和/或聚合酶链反应试剂(如dntp,taq酶)。例如,可含有:(a)各种pcr反应用试剂,例如但不限于:taq酶,pcr缓冲液,dntp,dna聚合酶等;或(b)各种提取dna或rna(即制备pcr反应模板)所需的试剂,例如但不限于:酚、氯仿、异戊醇、nacl等;或(c)提取dna或rna的试剂盒。
作为一种优选方式,所述的试剂盒中还可含有:核酸序列分析软件。
此外,所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、pcr扩增及乳腺癌基因检测
步骤一基因组定量
基因组定量非常重要,采用
步骤二靶区域扩增
分别以panelmixa、panelmixb为引物,按照下面所列反应体系和扩增条件进行第一轮pcr扩增,得到2管扩增产物。
pcr为25μl反应体系,其中:
pcr程序:
步骤三pcr产物纯化
分别利用ampurexpbeads纯化磁珠对2管pcr产物进行纯化。该纯化可有效的富集目标区域片段,减低非特异性扩增浓度。
1.向pcr反应液/酶促反应液加入0.5倍体积ampurexpbeads(30μl体系加15μl),用移液器上下吹打,使扩增产物与ampurexpbeads充分混匀,室温静置2分钟。
2.用强力磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。
3.用移液器小心吸取上清至新的ep管子/96孔板中(保留上清),小心避免吸到磁珠。该步骤中的磁珠可抛弃。
4.向上清液中加入0.6倍原始pcr体积ampurexpbeads(如pcr体系为30μl,则加18μl磁珠),用移液器上下吹打,使扩增产物与ampurexpbeads充分混匀。室温静置2分钟。
5.用强力磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。用移液器小心吸取上清,抛弃上清,保留磁珠。
6.加入40μlbw10,悬浮磁珠,室温静置2min。用强力磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清,抛弃上清,保留磁珠。
7.加入100μl70%乙醇,用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤。
8.用磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清,避免吸到磁珠。
9.室温放置,直至乙醇完全挥发。本步骤亦可将磁珠放于50℃烘箱5分钟,快速蒸干乙醇。此步绝不可省略,否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
步骤四第二轮pcr
分别对2管回收产物进行第二轮pcr扩增。本步骤主要目的是引入测序相应接头与barcode。
pcr为20μl反应体系,其中:
pcr程序:
步骤五pcr产物回收
利用ampurexpbeads纯化磁珠对2管pcr产物进行纯化。
1.pcr产物中加0.8倍体积ampurexpbeads(30μl体系加24μl)用移液器上下吹打,使回收产物与ampurexpbeads充分混匀。室温静置2分钟。
2.用强力磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。
3.用移液器小心吸取上清,抛弃上清,保留磁珠。
4.加入40μlbw07磁珠悬浮液,涡旋均匀。
5.用磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清,避免吸到磁珠。
6.加入100μl70%乙醇,用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤。
7.用磁铁或磁力架吸附磁珠,直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清,避免吸到磁珠。
8.室温放置,直至乙醇挥发干净。本步骤磁珠亦可放于50℃烘箱5分钟左右,快速蒸干乙醇。
9.加入20μlelutionbuffer,充分悬浮磁珠,室温静置2min以洗脱dna。将磁珠用磁铁吸附,所得到的上清dna溶液吸至新的1.5/0.5/0.2ml离心管/96孔pcr管。elutionbuffer为10mmtris-hcl,ph8.0-8.5,也可以用te代替。
10.分别对a、b两管纯化产物进行dna浓度测定,根据测定浓度等比混合两管纯化产物,混合产物可直接用于上机测序或置于-20℃保存。
表2
利用本发明的上述检测试剂以及检测方法,对临床20例患者进行检测以及长期跟踪观测,结果发现,本发明的检测方法准确性理想。
应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海产业技术研究院;上海人类基因组研究中心
<120>乳腺癌高风险基因的诊断试剂盒及其应用
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<213>引物(primer)
<400>59
accagctgacagagacaaagatg23
<210>60
<211>30
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>60
gagccttcaaatgatgaaaattatccttgt30
<210>61
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>61
ggcaaatggctgcaaagatctc22
<210>62
<211>29
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>62
catacttatgctttgcataaaacagcact29
<210>63
<211>30
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>63
ccaaatctgtttttctgaatctgtttacca30
<210>64
<211>25
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>64
gggtaatgcaggcagacattataca25
<210>65
<211>30
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>65
gaaatcatatcaaagaaacacgtcaaacca30
<210>66
<211>29
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>66
cacccattgagtcattcacttttaaagaa29
<210>67
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>67
cagctcctggcatgtgtttcta22
<210>68
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>68
cagaagttgctggacgaacttg22
<210>69
<211>27
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>69
agactgagtctttcaaatgagcaagtt27
<210>70
<211>27
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>70
ttctaccaggaaaatcacatcccaaaa27
<210>71
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>71
ccgtctttgtatgctggctttg22
<210>72
<211>28
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>72
tacctgatgaagactttggacctcttaa28
<210>73
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>73
tggtttttctgagcaggacttca23
<210>74
<211>30
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>74
gattgtctgttttgttgggttttgttacta30
<210>75
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>75
acacttggccctgtcacttttta23
<210>76
<211>24
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>76
tagcctgtcgattgttaacaggtc24
<210>77
<211>24
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>77
cgtgctgatatttgtgtgaggtga24
<210>78
<211>26
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>78
caaccaagttcaagaacctctcagaa26
<210>79
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>79
gcgggagagctgactttagtta22
<210>80
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>80
tccaattgccagaggaaagtagc23
<210>81
<211>28
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>81
ttcttgacatccaaatgactctgaatga28
<210>82
<211>30
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>82
ggaatgaaaatcttcaggaaagtgagattc30
<210>83
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>83
gttgcttccaggctaagactctt23
<210>84
<211>26
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>84
actgtctctacagataacctccttgt26
<210>85
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>85
gggcagttggccacttttactta23
<210>86
<211>28
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>86
caaccagaaaaaggtgttgatacattcc28
<210>87
<211>22
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>87
ctgtagtcgccctggtgaaatt22
<210>88
<211>23
<212>dna
<213>引物(primer)
<400>88
tgtctttggcactgattcactca23