LINC01876作为诊断肝癌的分子标志物的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及linc01876作为诊断肝癌的分子标志物的应用。

背景技术：

原发性肝癌(primarycarcinomaofliver，以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一。据20世纪90年代统计，我国肝癌的年死亡率为20.37/10万，在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位，在城市中仅次于肺癌；农村中仅次于胃癌。由于血清甲胎蛋白(afp)的临床应用和各种影像学技术的进步，特别是afp和超声显像用于肝癌高危人群的监测，使肝癌能够在无症状和体征的亚临床期作出诊断，加之外科手术技术的成熟，以及各种局部治疗等非手术治疗方法的发展，使肝癌的预后较过去有了明显提高。

原发性肝癌的临床病象极不典型，其症状一般多不明显，特别是在病程早期。通常5cm以下小肝癌约70％左右无症状，无症状的亚临床肝癌亦70％左右为小肝癌。症状一旦出现，说明肿瘤已经较大，其病势的进展则一般多很迅速，通常在数周内即呈现恶病质，往往在几个月至1年内即衰竭死亡。临床病象主要是两个方面的病变：①肝硬化的表现，如腹水、侧支循环的发生，呕血及肢体的水肿等；②肿瘤本身所产生的症状，如体重减轻、周身乏力、肝区疼痛及肝脏肿大等。

在世界任何地区都同样发现，任何原因导致的慢性肝病都可能在肝癌发生和发展过程中起着重要的作用。流行病学和实验研究均表明病毒性肝炎与原发性肝癌的发生有着特定的关系，目前比较明确的与肝癌有关系的病毒性肝炎有乙型、丙型和丁型3种。其中以乙型肝炎与肝癌关系最为密切，近年hbsag阴性肝癌数增加与丙型肝炎有关，而前苏联则以丁型为多。我国肝癌患者中约90％有乙型肝炎病毒(hbv)感染背景。其他危险因素包括酒精性肝硬化、肝腺瘤、长期摄入黄曲霉素、其他类型的慢性活动性肝炎、wilson病、酪氨酸血症和糖原累积病。

目前常用的用于肝癌诊断的方法包括如下方式：

1、实验室检查

(1)肝癌标志物的检测近年来用于肝癌检测的血清标志物主要有：①甲胎蛋白(afp)及其异质体；②各种血清酶，如γ谷氨酰转肽酶同工酶ⅱ(ggt-ⅱ)、碱性磷酸酶同工酶ⅰ(alp-ⅰ)、醛缩酶同工酶a(ald-a)、岩藻糖苷酶(afu)、抗胰蛋白酶ⅰ(aat)、5’核苷酸磷酸二酯酶同工酶v(5’-npd-v)、丙酮酸激酶同工酶(m2-pyk)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)等；③异常凝血酶原；④铁蛋白与酸性铁蛋白。其中afp的诊断价值最大。对于afp阴性肝癌的诊断，以上几种血清标志物联合应用，具有一定的诊断价值。

2、其他辅助检查

(1)超声检查；(2)计算机x线体层扫描(ct)；(3)磁共振显像(mri)；(4)肝动脉造影；(5)放射性核素显像；(6)肝穿刺活体组织检查。

但是利用血清标志物诊断肝癌的缺陷是不敏感，利用其它辅助检查诊断肝癌的缺陷是不能在疾病早期作出诊断，耽误病情。要想提高肝癌的治愈率关键在于在发病早期即可作出精确的诊断，为此本申请研究的目的是在基因水平上寻找能够用于肝癌诊断的早期分子标志物。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于诊断肝癌的长链非编码rna标志物。本发明利用芯片和qpcr实验证明linc01876在肝癌组织中的表达水平明显高于在癌旁组织中的水平，因此可以将linc01876作为诊断肝癌的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码rna表达的试剂在制备肝癌辅助诊断或预后预测产品中的应用；所述长链非编码rna的编码基因geneid：101929378。

本发明的长链非编码rna在ncbi中的命名为linc01876。属于基因id：101929378编码产物的linc01876转录本包括：nr_110249.2(1773bp，对应的dna序列是seqidno.1)；nr_110250.2(1823bp，对应的dna序列是seqidno.2)。

进一步，所述试剂包括利用sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01876表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明提供了一种用于肝癌辅助诊断或预后预测的产品，所述产品包括检测linc01876表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01876表达量时使用的pcr扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肝癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的rna表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的rna表达谱，容易分析出哪个rna的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知linc01876表达异常与肝癌相关也属于linc01876的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测linc01876表达量的试剂，所述试剂包括与linc01876或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括sybrgreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测linc01876表达量时使用的pcr扩增引物。

所述芯片包括检测linc01876表达量的试剂，所述试剂包括与linc01876或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01876表达量的探针。

所述试纸包括检测linc01876表达量的试剂，所述试剂包括与linc01876或其dna序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测linc01876表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括linc01876的抑制剂。

进一步，所述抑制剂不受限制，只要是可以抑制linc01876表达水平或抑制linc01876功能活性即可。

所述抑制剂包括sirna、shrna、抑制型mirna、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素c、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干bcg、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维a酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的长链非编码rna在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断肝癌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中linc01876的表达水平；

(3)将测得的linc01876的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，linc01876的表达水平显著升高，则该受试者被判断患有肝癌、或判断该受试者患有肝癌的风险高、或者肝癌患者被判断为复发、或者肝癌患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种肝癌的治疗方法，所述方法包括抑制linc01876表达量或者抑制linc01876的调节活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量linc01876的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当linc01876的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

在本发明的上下文中，“诊断肝癌”包括判断受试者是否已经患有肝癌、判断受试者是否存在患有肝癌的风险、判断肝癌患者是否已经复发与转移、判断肝癌患者对药物治疗的反应性、或者判断肝癌患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断肝癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在肝癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

附图说明

图1显示利用qpcr检测linc01876的差异表达情况的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达非长链编码rna

1、取材：

5例原发肝癌患者的手术切除癌组织和癌旁组织作为实验样本。所有癌组织均术后病理证实为肝癌。全部原发肝癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。全体患者均签署了知情同意书。

2、步骤：

(1)使用trizolreagent提取组织标本总rna，并用rnaseyminikit纯化提取的rna；

(2)使用quickamplabelingkit，one-color(agilentp/n5190-0442)合成、标记双链cdna；

(3)标记的双链cdna纯化后杂交于arraystar公司的human8x60klncrnaexpressionarrayinformation芯片；

(4)杂交漂洗之后由agilentmicroarrayscanner(agilentp/ng2565ba)扫描仪进行扫描分析；

(5)原始数据分析由agilentfeatureextractionsoftware软件完成，差异基因的筛选使用配对随机方差模型的方法，差异基因的标准为癌组织中变化表达2倍以上及p值≤0.05。

3、结果

测序结果显示：与癌旁组织相比，肝癌组织中差异表达lncrna为478个，其中上调的为301个，下调的为177个。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达lncrna

基于前期芯片测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择linc01876进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集肝癌组织及其对应的癌旁组织各30例。

2、在mrna水平上进行验证

试剂：反转录试剂盒(ddr037a)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(real-time)定量pcr(polymerasechainreaction)所用的sybrpremixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒为日本takara公司生产。

2.1提取组织rna

步骤同实施例1。

2.2逆转录

以提取的总rna(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：buffer4μl，rtenzymemix1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，以无rna酶的ddh2o将反应体积补足为20μl。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cdna。该cdna可用于lncrnareal-timepcr检测。

2.3qpcr

按照日本takara公司的premixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒说明书进行操作。

反应体系：sybrpremixextaq^tm(2×)25μl，roxreferencedye(50×)1μl，pcr上游引物(10μm)1μl，pcr下游引物(10μm)1μl，cdna4μl，灭菌ddh2o18μl。

反应程序：95℃20s预变性，按95℃10s变性、51℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得ct值。

结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

引物设计：根据linc01876转录本序列，通过ncbi的引物设计工具(primerblast)设计引物，引物序列如下所示：上游引物：5’-ggtcagaacacataataca-3’(seqidno.3)；下游引物：5’-agaggcattccaataatc-3’(seqidno.4)。

根据gapdh(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-ctctggtaaagtggatattgt-3’(seqidno.5)；5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.6)。

3、结果

结果显示，30例癌组织中有27例癌组织中linc01876水平显著高于癌旁组织。统计结果如图1所示，与癌旁组织相比，肝癌组织中linc01876水平明显升高，差异具有统计学意义(*p<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>山东省千佛山医院

<120>linc01876作为诊断肝癌的分子标志物的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1773

<212>dna

<213>人源(homosapiens)

<400>1

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<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>18

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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