用于HSV1病毒颗粒数检测的方法和试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及用于hsv1病毒颗粒数检测的方法和试剂盒。
背景技术：
：使用溶瘤病毒进行肿瘤治疗是一种新型的肿瘤治疗方法。溶瘤病毒是一类具有嗜肿瘤特性的病毒，可以选择性地在肿瘤细胞中增殖从而导致肿瘤细胞溶解和死亡，而在正常细胞内的增殖则受到限制。同时它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。目前，研究最深入的溶瘤病毒包括腺病毒和i型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus,hsv)等。单纯疱疹病毒hsv属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。在性病医院临床上根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。1型主要由口唇病灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50—90％，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。溶瘤型i型单纯疱疹病毒(hsv-1)因所使用的病毒载体具有基因容量大、复制周期短、感染效率高、可插入多个治疗基因等优势，成为国内外基因工程肿瘤治疗药物的首选。随着使用hsv1型病毒载体的临床研究越来越多，本领域中迫切需要开发特异性好、灵敏度高、精准便捷的hsv1病毒颗粒数检测方法，以便以满足临床研究的需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于hsv1病毒颗粒数检测的方法和试剂盒。在本发明的第一方面，提供了一种检测hsv1病毒颗粒数的引物对，所述的引物对选自下组：seqidno.:1和seqidno.:2所示的引物对；和seqidno.:1和seqidno.:4所示的引物对。在另一优选例中，所述的引物对选自下组：seqidno.:1和seqidno.:4所示的引物对。在另一优选例中，所述引物对用于实时荧光定量pcr。在另一优选例中，所述实时荧光定量pcr为sybrgreen荧光定量pcr.本发明的第二方面，提供了一种检测hsv1病毒颗粒数的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对。在另一优选例中，所述试剂盒还包括：taq酶、dntp、和/或mg2+。在另一优选例中，所述试剂盒还包括dna提取试剂。在另一优选例中，所述试剂盒还包括sybrgreenmix。本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的引物对、或本发明第二方面所述的试剂盒的用途，用于hsv1病毒颗粒数的检测。在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的的。在另一优选例中，所述检测为荧光定量pcr检测。本发明的第四方面，提供了一种检测hsv1病毒颗粒数的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测样本，并从所述待检测样本中提取dna；(2)使用本发明第二方面所述的试剂盒检测步骤(1)提取得到的dna，从而获得所述待检测样本中的hsv1病毒颗粒数。在另一优选例中，所述方法为荧光定量pcr检测方法。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1a-图1d显示了各个引物对pcr检测hsv-1病毒dna特异性确证电泳图谱(m:marker,1:gm-csfp,2:gm-csfg,3:vero基因组dna,4:达安试剂盒(强阳性质控),5:抽提病毒dna(批号：20170301),6:空白水)；图1a:hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2、图1b:hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2、图1c:hsv-1up3-down1&hsv-1up3-down2、图1d:hsv-1up4-down4。图2显示了引物对(hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2)pcr检测hsv-1病毒dna特异性确证电泳图谱(m:marker,1:gm-csfp,2:gm-csfg,3:vero基因组dna,4:达安试剂盒(强阳性质控),5:抽提病毒dna(批号：20170301),6:空白水)。具体实施方式本发明人通过广泛而深入的研究，经过设计和大量筛选验证获得了根据hsv-1的衣壳糖蛋白g(envelopeglycoproteing)设计的特异性检测hsv-1病毒dna的上下游引物，采用sybrgreen的荧光定量pcr法，进行病毒颗粒数检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。本发明还提供了用于hsv-1病毒颗粒数检测的试剂盒。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。进而对pcr进程进行实时检测。pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，并依此定量。编码病毒颗粒的衣壳蛋白的dna序列均是单拷贝序列，可以根据该序列进行特异性引物设计。因此，本发明的特异性引物选择hsv-1病毒基因组的衣壳糖蛋白g(envelopeglycoproteing)的核酸序列为模板进行设计。首先对设计引物的检测特异性进行确认，只能在hsv-1病毒dna上扩增到目标条带，而在gm-csf以及vero细胞基因组dna上不得有扩增条带；接着将目标扩增片段构建至t载体上建成标准定量质粒，根据标准质粒的拷贝数为基准，进行荧光pcr标准曲线绘制，根据标准曲线对待测hsv-1核酸提取样本进行拷贝数检测。本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。实时荧光定量pcr方法对引物特异性和灵敏度有极高的要求。本发明人经过深入的研究和大量的检测验证，最终获得了在检测hsv1病毒颗粒数时同时具备高灵敏度和高特异性的引物对，从而能准确而灵敏地检测产品，例如重组hsv-1病毒原液中hsv-1病毒颗粒数含量，或者血液样本、组织样本中是hsv-1病毒颗粒数含量。表1中显示了本发明中较佳的引物对。表1本发明还提供一种检测hsv1病毒颗粒数的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对以及探针等实施pcr所需的其它成分，例如taq酶、dntp、mg2+等等。在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到10fg/μl。在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测hsv1病毒颗粒数的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对待测样品进行pcr，并检测pcr扩增产物。在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种pcr试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的根据本发明的引物对；和/或探针。在具体的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产物的pcr方法。本发明的主要优点在于：本发明获得的一段能够用于hsv1病毒颗粒数检测的引物对和探针，对目标dna进行实时荧光pcr检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。材料和方法本发明的hsv1病毒颗粒数检测是基于实时荧光定量pcr的方法，dna提取试剂盒为qiagen公司的dneasyblood&tissuekit，检测试剂为toyobo公司的sybrgreenrealtimepcrmastermix。整个病毒颗粒数检测方法包括dna样品提取、标准曲线确认、pcr反应体系确认等，方法建立完成后还对检测结果进行确认，包括提取稀释体系确认以及提取回收率确认。最终，本发明建立了针对重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒颗粒数的检测方法。病毒颗粒数检测方法的建立利用根据hsv-1的衣壳糖蛋白g(envelopeglycoproteing)设计的特异性检测hsv-1病毒dna的上下游引物，采用sybrgreen的荧光定量pcr法，进行病毒颗粒数检测。实验原理是在pcr扩增过程中，荧光信号的积累与dna拷贝数成正相关，在pcr扩增的指数时期，扩增ct值和模板的起始目标dna拷贝数存在线性关系。利用梯度稀释的已知拷贝数的标准质粒进行扩增检测，绘制定量标准曲线，并根据标准曲线对未知的扩增样品进行拷贝数定量检测。在颗粒数检测过程中，利用qiagendneasyblood&tissuekit对hsv-1溶瘤病毒的dna进行提取，对dna提取过程进行优化，对dna提取和检测回收率进行确认。样品信息样品名称批号备注hsv-1病毒原液20161201-70℃保存，conc.:127.96μg/mlhsv-1病毒原液20170301-70℃保存，conc.:130.25μg/mlhsv-1病毒原液20170603-70℃保存，conc:124.86μg/ml关键试剂及耗材仪器设备实施例1根据文献，确定hsv-1gg基因序列(genbankid:nc_001806.2)，设计了数十条引物，检查引物3’末端，尤其是最后一个碱基尽可能严格地与模板互补配对。与hsv-2gg、gm-csf基因序列进行比对，将设计的引物在blast网站，与除天然hsv-1基因组外的基因序列进行对比，确认引物设计的特异性。经过初步筛选和上下游引物的组合测试，初步获得的7条引物如seqidno.:1-7所示。引物序列如下：荧光pcr反应25μlpcr反应体系：pre-mixpcr酶12.5μl、上游引物及下游引物(10μm)各1μl、dna提取液1μl/5μl、无菌水9.5μl/5.5μl。pcr反应：95℃预变性10min；95℃30s，60℃30s，72℃30s共30～40个循环；72℃延伸5min。标准质粒的构建胶回收扩增的片段连接pmd-18t载体，转化入e.coli菌株，挑选若干菌落，测序合格的菌落进行质粒抽提。重组质粒接种液体培养基，37℃培养，离心收集菌体。t载体连接参照t载体说明书标准操作进行。感受态细胞转化取100μl感受态细胞于1.5mlep管中，将t载体与样品的连接产物加入，轻弹混匀，冰浴15min；热击42℃45s；冰浴2min；加入无抗生素培养基(2yt)500μl，将ep管放入37℃摇床震荡25min后，5000rpm，离心1min，移去多余液体，ep管中留约200μl培养基即可，将剩余液体转移至氨苄抗性培养基，涂匀，于37℃生化培养箱中过夜培养。质粒测序挑取8个菌落于2ml氨苄抗性培养基中，37℃振摇3h后，进行菌液pcr，将pcr产物进行核酸电泳鉴定(1.5％琼脂糖凝胶电泳，125v35min)，由此筛选需测序的菌液，取50μl于5-8ml氨苄培养基中，37℃振摇过夜，各取1ml测序。质粒抽提选取测序合格的菌液进行质粒抽提，参照试剂盒进行操作。用nanodrop进行浓度测定，根据已知标准质粒的物质的量计算质粒拷贝数。溶瘤病毒dna提取hsv-1溶瘤病毒dna提取完全按照dneasyblood&tissuekit(50)的使用说明进行操作。dna提取方法1.取100μl/1ml/1.5ml原液，加入100μ1bufferatl,20μ1proteinasek，混匀后加入200μ1bufferal，混匀后于56℃干式恒温器，温育10min。2.加入200μl无水乙醇，于振荡器上混匀，将混合液转移至spincolumn中(含2mlcollectiontube)，8000rpm，离心1min，弃去收集管及滤液。3.更换新的收集管，加入500μlbufferaw1，8000rpm，离心1min。弃去收集管及滤液。4.更换新的收集管，加入500μlbufferaw2，14,000rpm，离心3min。弃去收集管及滤液。5.将spincolumn转移至新的1.5mlep管中，于spincolumn膜中央加入200μlbufferae，于37℃干式恒温器中温育5min后，9000rpm，离心1min，收集滤液，即得到dna产物。加标样品dna提取以及加标回收率计算试剂盒建议提取时的样品取样体积为100μl，实际采用100μl、1ml、1.5ml进行提取，加标量为100μl样品中加标5e8个标准质粒，考察不同提取体积对颗粒数检测及回收率的影响。加标回收率的计算：其中，加标样品的理论颗粒数＝未加标样品的实际颗粒数+加入的标准质粒数实验结果引物特异性确认利用设计合成的各对引物对各个模板进行扩增，进行引物扩增特异性确认，待扩增的模板包括gm-csfp(来源于质粒的gm-csf片段，不含verodna源性成分)、gm-csfg(来源于vero细胞生产病毒颗粒的gm-csf片段，含有verodna源性成分)、vero细胞dna、达安试剂盒强阳性质控样品、hsv病毒颗粒提取dna(批号：20170301)，阴性对照(pcr检测用空白水)。该实验采用primestar酶，循环数为40个循环。各对引物特异性检测结果如图1a-图1d所示，显示了各个引物对pcr检测hsv-1病毒dna特异性确证电泳图谱(m:marker,1:gm-csfp,2:gm-csfg,3:vero基因组dna,4:达安试剂盒(强阳性质控),5:抽提病毒dna(批号：20170301),6:空白水)，图1a:hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2、图1b:hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2、图1c:hsv-1up3-down1&hsv-1up3-down2、图1d:hsv-1up-4-down。引物对特异性扩增确证的工作目标是该引物对只在抽提病毒dna样品中能够扩增到目标条带，而在其余的检测样品中没有目标条带的扩增。说明该对引物的扩增只特异性识别hsv-1病毒基因组，而不能识别gm-csf基因、vero基因组dna等。这是hsv-1病毒颗粒数检测工作开展的前提。由上述结果可以发现，所设计的引物对hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2的抽提病毒dna(批号：20170301)样品中扩增出明显的目标条带，而其他各个组分dna样品中则几乎没有出现明显的扩增条带，一些非特异性扩增以及弥散的条带很可能是模板量较大，以及循环次数较多而造成的非特异性扩增。除了hsv-1up1-down1和hsv-1up1-down2这2对引物之外，其余引物对的扩增特异性较差，无法特异性扩增或识别抽提hsv-1病毒dna。在上述工作基础上，进一步对hsv-1up1-down1和hsv-1up1-down2的引物扩增特异性进行确证，采用primestar酶，适当调整待扩增模板至0.1ng/反应，pcr扩增循环数调整至30循环，对同样的样品进行pcr扩增并检测，电泳图谱见图2。该结果可以确认引物对hsv-1up1-down1和hsv-1up1-down2的扩增特异性较好，pcr特异性扩增hsv-1病毒dna，而不会扩增gm-csf以及vero细胞dna片段。综合2次hsv-1up1-down1及hsv-1up1-down2的特异性扩增结果，选择更佳的hsv-1up1-down2作为基于sybrgreen荧光定量pcr检测方法用特异性引物，检测hsv-1病毒颗粒数。引物对hsv-1up1-down2特异性扩增hsv-1病毒的衣壳糖蛋白g(envelopeglycoproteing)，扩增片段145bp，如下：actcacctcaaagggacgacccttggttccgacgcctcaacataccccgctgttctcgttcctcactgcctcccccgccctggacaccctcttcgtcgtcagcaccgtcatccacaccttatcgtttttgtgtattggtgcgatg(seqidno.:8)图2显示了引物对(hsv-1up1-down1&hsv-1up1-down2)pcr检测hsv-1病毒dna特异性确证电泳图谱(m:marker,1:gm-csfp,2:gm-csfg,3:vero基因组dna,4:达安试剂盒(强阳性质控),5:抽提病毒dna(批号：20170301),6:空白水)。特异性引物确认后，构建定量用标准质粒，将目标片段hsv-1gg连接至pmd18-t载体中，通用引物测序确证，抽提质粒，并对抽提得到的质粒dna进行电泳和定量分析。标准质粒制备完成后，根据待测hsv-1溶瘤病毒的病毒颗粒数的理论范围约10e8～10e9个/ml，选择5个标准定量曲线点的拷贝数范围能够覆盖10e8～10e9个/ml。5个标准定量曲线点的目标片段拷贝数分别是：3e10个/ml、3e9个/ml、3e8个/ml、3e7个/ml、3e6个/ml。在正式进行待测样品定量检测前，需要对基于cybrgreen法荧光定量pcr实验本身的重复性和稳定性进行确认。取标准曲线样品点的5个不同拷贝数点样品，利用hsv-1up1-down2引物对，独立进行3次荧光pcr检测，每个点双复孔分析，根据ct值及拷贝数的对应关系线性拟合绘制标准曲线。首先对标准曲线扩增后的熔链曲线进行确认，可以发现各个标准曲线样品点的熔链曲线均在同一位置出现单个峰，阴性空白水则没有出现，说明扩增条带是单一的。接着根据标准曲线各个点拷贝数和ct值绘制标准曲线。将3次独立标曲各个拷贝数点对应的ct值汇总，并对批内以及批间的cv％进行统计，可以看到3次独立实验的各个拷贝数点的批内检测ct值以及批间检测ct值的cv％均满足不高于20％。实验结果表明，基于标准质粒建立的sybrgreen荧光定量pcr方法的定量曲线是稳定的，可用于支持实际待测样品的病毒颗粒数分析。综上，基于hsv-1病毒颗粒单拷贝衣壳糖蛋白gg基因进行引物设计，设计时重点排除vero基因组dna以及插入片段gm-csf序列的干扰。引物设计完成并确证引物特异性后，基于该引物进行sybrgreen荧光定量pcr方法开发，完成标准质粒的制备。最终，建立用于检测重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒人巨噬细胞集落刺激因子(hsv-1/gm-csf)产品的病毒颗粒数检测方法。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海博威生物医药有限公司<120>用于hsv1病毒颗粒数检测的方法和试剂盒<130>000000<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1actcacctcaaagggacga19<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccatcgcaccaatacaca18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttccgacgcctcaacata18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4catcgcaccaatacacaa18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tccgacgcctcaacatac18<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agaagttgctgatcgacctgtgt23<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cagggtcatggattggctatg21<210>8<211>145<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8actcacctcaaagggacgacccttggttccgacgcctcaacataccccgctgttctcgtt60cctcactgcctcccccgccctggacaccctcttcgtcgtcagcaccgtcatccacacctt120atcgtttttgtgtattggtgcgatg145当前第1页12