本发明涉及微生物工程
技术领域：
，具体涉及一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法。
背景技术：
：藻类生物燃料是全球可再生资源系统的重要组成部分。微藻中的油脂作为生物燃料的主要形式，是利用微藻中的油脂在催化剂条件下进行反应所制备的生物柴油，与传统的生物燃料相比，藻类生物燃料具有更多的优势。其中有些微藻最大的可利用之处在于其干细胞中富含微藻油70％以上，是亚临界生物技术合成生物柴油的最佳原料，是理想的可再生能源。目前提取微藻内部油脂的技术主要有传统上的机械粉碎、超声波、胶体磨等物理方法和生物酶解方法等，该类方法都是主要将微藻外层的细胞壁破坏，然后加入萃取剂进行离心分离，最后蒸馏得到微藻内部的油脂。但是对于微藻外侧细胞壁的破坏并不是上述方法中说的简单。传统上的机械粉碎、胶体磨破坏细胞壁都需要将微藻冷冻成粒，然后研磨破碎，此类方法破坏细胞壁的效果极差，经过后续操作提取的油脂很低。单纯的酶解法需要大量的生物酶经过长时间的处理，不仅增加了制备周期，而且增加了成本，而超声波处理的的微藻虽然加快了制备周期，但是提取的油脂率很低，无法实现大量提取。专利号为cn105296137a的发明公开了一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，步骤是：a、在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌并加热；b、酶催化降解反应完毕后，将反应体系调整ph值，将酶催化降解液温度提高并维持温度；c、待反应完毕后，将酶催化降解体系的温度降低，向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取，再加入破乳剂后通过离心进行分层；d、将分离获得的油相经减压蒸馏或者薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂。该虽然方法易行，操作简便，针对产油微藻尤其是光合自养型产油微藻的高效破壁提油，降低了微藻提油过程的能量输入，提高了微藻能源的能效比，进而大大降低了微藻生物质能源的综合生产成本；但是整个提取油脂的周期过长，而且加入的复合酶含量不能过低，否则难达到所述的有益效果，这无形中也增加了生产成本。因此，发明一种能解决上述问题的生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法是一项有待解决的技术问题。技术实现要素：(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法。(二)技术方案本发明通过以下技术方案予以实现：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量微藻放在固体培养基中培养10-15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并通过离心处理分离得到高纯度微藻；2)将高纯度微藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度微藻质量0.5％的蛋白酶，搅拌反应体系并加热至45-50℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至50-60℃，并加入重量为高纯度微藻质量0.6％-1％的复合酶反应0.5-2h，然后采用超声波对复合酶反应后的溶液处理10min-20min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液60％-80％的萃取剂，并在6000-8000rpm的转速下离心3-5min后，取上油脂层进行蒸馏得到微藻油脂。优选地，所述步骤1中培养温度为25℃，光照强度为4000-6000lx。优选地，所述步骤1中离心处理的转速为1200-2000rpm，处理时间为10-20min。优选地，所述步骤2中的蛋白酶的酶活性为30000-40000u/g。优选地，所述步骤3中的复合酶为纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成的复合物，其质量比为2：1：1：1：1。优选地，所述步骤3中的超声功率为120-140w。优选地，所述步骤4中的萃取剂为正己烷、甲醇、氯仿、乙醚中的一种或几种组成。优选地，所述步骤4中蒸馏为在10kpa-100kpa的压强下进行减压蒸馏，其蒸馏沸点为45-65℃。优选地，所述微藻为小球藻、绿藻、轮藻、甲藻、金藻或硅藻其中的一种。(三)有益效果本发明先加入蛋白酶，并在该酶的最佳温度下有效的将微藻细胞壁上以及内部的的蛋白质高效分解，然后高温煮沸使得蛋白酶活性丧失，同时沸腾的溶液产生的微型气泡会进入微藻细胞，使得微藻细胞的细胞壁结构松动，再降温至复合酶的最佳温度下进行纤维素、糖类的分解，使得整个细胞壁基本瓦解，而此时失活的蛋白酶也不会影响复合酶的活性，极大的提高了酶的生物活性，减少了生物酶的需求量。最后通过短暂的超声波处理，加快了整个微藻细胞的分解，同时也使得分解产物脱离微藻上的油脂，方便后续油脂的萃取，不仅提取微藻内部油脂率高，而且减少酶的使用量，缩短了提取周期，极大的降低了提取成本。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5500lx的条件下培养13天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为35000u/g，搅拌反应体系并加热至45℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至50℃，并加入重量为高纯度小球藻质量0.8％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用130w超声波对复合酶反应后的溶液处理15min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在8000rpm的转速下离心3min后，取上油脂层在50kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。实施例2：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为40000u/g，搅拌反应体系并加热至50℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至55℃，并加入重量为高纯度小球藻质量1.0％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用130w超声波对复合酶反应后的溶液处理15min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在10kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。实施例3：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为35000u/g，搅拌反应体系并加热至48℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至55℃，并加入重量为高纯度小球藻质量0.8％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用120w超声波对复合酶反应后的溶液处理10min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在20kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。实施例4：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为40000u/g，搅拌反应体系并加热至48℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至55℃，并加入重量为高纯度小球藻质量1.0％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用140w超声波对复合酶反应后的溶液处理20min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在20kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。实施例5：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1200rpm的转速离心处理分离20min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为35000u/g，搅拌反应体系并加热至45℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至50℃，并加入重量为高纯度小球藻质量0.6％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用130w超声波对复合酶反应后的溶液处理15min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在20kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。对比组1：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将500g的高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为35000u/g，搅拌反应体系并加热至48℃，反应0.5h后继续升温至100℃煮沸10min；3)将煮沸后的反应溶液快速降温至55℃，并加入重量为高纯度小球藻质量0.8％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h；4)向步骤3得到的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在20kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。对比组2：一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，包括以下步骤：1)取适量小球藻放在固体培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为5000lx的条件下培养15天，然后从固体培养基表面刮取微藻放入温水中，并以1500rpm的转速离心处理分离15min得到高纯度小球藻；2)将高纯度小球藻放入纯净水中，然后加入体积为纯净水体积5％的磷酸盐缓冲液和重量为高纯度小球藻质量0.5％的蛋白酶，其中蛋白酶的酶活性为35000u/g，搅拌反应体系并加热至48℃，反应0.5h；3)向上述溶液中加入重量为高纯度小球藻质量0.8％的由纤维素酶、淀粉酶、酯酶、甘露聚糖酶以及果胶酶组成复合酶，其各酶的质量比为2：1：1：1：1，反应1h，然后采用130w超声波对复合酶反应后的溶液处理15min；4)向超声处理后的溶液中加入体积为溶液80％的氯仿萃取剂，并在6500rpm的转速下离心4min后，取上油脂层在20kpa压强下进行蒸馏得到小球藻油脂。为对比本发明的有益效果，测量实施例1至对比组2中最终蒸馏得到的油脂重量，并记录数据如下表1：表1实施例/脂肪比油脂重量/g小球藻重量/g油脂提取率/％实施例16.5850.013.16实施例26.6350.013.26实施例36.3750.012.74实施例46.7450.013.48实施例56.4250.012.84对比组14.8650.09.72对比组25.7150.011.42从表1可以看出，小球藻使用实施例1至实施例5的提取方法，其油脂提取率高达13％，而没有使用超声处理的小球藻中的油脂提取率仅为9.72％，没有经过高温煮沸处理的小球藻中的油脂提取率仅为11.42，因此可以看出本发明的油脂提取率更佳。从以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12