一种牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的构建方法与流程

本发明属于重组腺病毒载体技术领域，尤其涉及一种牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的构建方法。

背景技术：

mir-145和mir-143来自于基因组中比较靠近的位置，共同形成mir-143/145簇。这些暗示了它们在生物学过程中可能发挥相关联的功能。mir-143是第一个被发现的与调控脂肪分化的mirna。2012年，有研究表明mir-145能够通过抑制胰岛素受体基质1(insulinreceptorsubstrate1,irs1)的表达进而抑制前体脂肪细胞分化。mirnas表达谱数据显示mir-145的表达水平在脂肪分化期间呈下调趋势。综上，mir-145被认为是一个潜在的脂肪分化调控者。为了研究mir-145基因的功能，过表达该基因的手段是非常必要的。腺病毒表达载体系统能够产生稳定的病毒颗粒，装载量大，安全性高，相比于非病毒表达载体更容易转染原代细胞。

技术实现要素：

鉴于mir-145潜在的研究前景和腺病毒表达载体的优势，本发明的目的在于，提供一种牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的构建方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案予以实现：

一种牛mir-145过表达重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，以含有牛mir-145基因序列(mirbase:mi000475)的质粒做模板，设计引物并克隆牛mir-145基因；

步骤二，将克隆得到的牛mir-145基因，经测序验证后重组到表达载体psb50上，转化进入感受态细胞，获得表达质粒psb50-bta-mir-145；

步骤三，表达质粒psb50-bta-mir-145经admax腺病毒系统包装成重组腺病毒载体pad-bta-mir-145；

步骤四，将重组腺病毒载体pad-bta-mir-145加入到hek293细胞，进行扩增、纯化；

步骤五，用高浓度的重组腺病毒载体pad-bta-mir-145感染牛前体脂肪细胞，实时荧光定量pcr检测牛mir-145的表达量。

根据本发明，所述引物序列为：

primer1(f)：

gcatggacgagctgtacaagtgatccatggcaactgaagcg；

primer2(r)：

tccagaggttgattatcgattggttcaaccactgctcaac；

pcr产物大小为634bp。

进一步地，所述pcr以含有牛mir-145基因序列的质粒做模板，用primestar高保真dna聚合酶扩增牛mir-145基因，pcr反映体系为：

模板：1μl，引物f/r：各1μl，primestar酶0.5μl，5×buffer(withmg2+)10μl，dntp：4μl，h2o：32.5μl；

pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃终止反应10min。

进一步地，所述牛mir-145基因序列为：mirbase:mi000475。

本发明的牛mir-145过表达重组腺病毒载体的构建方法，带来的优点及积极效果在于：

通过构建牛mir-145基因的重组腺病毒，为mir-145在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能研究做准备。

经测序验证，克隆获得的牛mir-145基因与数据库mirbase收录的基因序列一致，将牛mir-145基因与表达载体psb50重组并用admax腺病毒包装系统进行包装，获得重组腺病毒pad-bta-mir-145，其滴度为7.27×10¹⁰(pfu/ml)。重组腺病毒pad-bta-mir-145侵染牛前体脂肪细胞后，牛mir-145的表达水平比对照组高68倍。从而能够持续稳定地表达该基因。为研究该基因在牛前体脂肪细胞中过表达后，对细胞分化的影响提供实验基础。

通过构建牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体，为检测mir-145基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的作用奠定实验基础。

附图说明

图1是pcr扩增目的基因片段；

图2是工具载体图谱；

图3是多克隆位点酶切图谱；

图4是终载体图谱；

图5是菌落pcr鉴定图(挑取的4个转化子)；

图6是牛mir-145基因过表达重组腺病毒(pad-bta-mir-145)包装后拍照检测结果；其中左侧三张图为白光组，右侧三张图为荧光组；

图7是牛mir-145重组腺病毒(pad-bta-mir-145)滴度结果图片(100×),从上至下依次为稀释度10^-5，稀释度10^-6，稀释度10^-7，稀释度10^-8。

以下结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明。

具体实施方式

为了使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，应当理解，以下的实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本实施例给出一种牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体构建方法，包括以下步骤：

步骤一，以含有牛mir-145基因序列的质粒做模板，设计引物，并克隆牛mir-145基因；

步骤二，将克隆得到的牛mir-145基因，经测序验证后重组到表达载体psb50上，转化进入感受态细胞，获得表达质粒psb50-bta-mir-145；

步骤三，表达质粒psb50-bta-mir-145经admax腺病毒系统包装成重组腺病毒载体pad-bta-mir-145；

步骤四，将重组腺病毒载体pad-bta-mir-145加入到hek293细胞，进行扩增、纯化；

步骤五，用高浓度的重组腺病毒载体pad-bta-mir-145感染牛前体脂肪细胞，实时荧光定量pcr检测牛mir-145的表达量。

所述引物序列为：

primer1(f)：

gcatggacgagctgtacaagtgatccatggcaactgaagcg；

primer2(r)：

tccagaggttgattatcgattggttcaaccactgctcaac；

pcr产物大小为634bp。

所述的pcr是以含有牛mir-145基因片段的质粒为模板，用primestar高保真dna聚合酶扩增牛mir-145基因，pcr反映体系为：

模板：1μl，引物f/r：各1μl，primestar酶：0.5μl，5×buffer(withmg2+)：10μl，dntp：4μl，h2o：32.5μl；

pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃终止反应10min。

所述牛mir-145基因序列为：mirbase:mi000475。

以下是具体的实施例。

1、牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的构建

1.1牛mir-145基因扩增：

根据数据库mirbase的查询，牛mir-145基因序列为：mirbase:mi000475(http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl？acc＝mi0004756)，以含有牛mir-145基因序列的质粒做模板，并设计引物克隆牛mir-145基因，设计的引物如附表1所示，基因合成由上海生工生物科技有限公司完成。

附表1

pcr扩增目的片段见图1。经测序验证，克隆获得的牛mir-145基因与数据库mirbase收录的基因序列一致。

1.2同源重组：

用clai和bamhi-hf对表达载体(psb50)(见图2)进行酶切，回收4661bp载体片段(见图3)。

将扩增得到的牛mir-145基因片段和线性化的表达载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应，获得重组载体(见图4)，命名为psb50-bta-mir145。混匀后在42℃孵育30分钟，然后转移到冰上。放置2-3分钟后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

取一支感受态细胞(每管100μl，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。每管加900μl的lb培养液(市售)，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。取恰当量的转化菌液涂布于lb琼脂平板上(含表达载体相应的抗生素)。倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

1.3阳性克隆鉴定和抽提：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl的lb培养液中，从中取1μl做模板进行菌落pcr鉴定(图5)。接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。阳性克隆测序结果分析：阳性克隆测序结果表明，和预期的目的基因序列一致。

2、牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的包装

2.1包装过程：

转染前一天，将细胞接种10cm细胞培养器皿中，控制细胞转染时的密度为70-90％。转染前一小时取出细胞培养器皿，去除原有细胞培养基，加入10ml的opti-memi减血清培养基(市售)，将细胞送回培养箱。

制备转染试剂和质粒的复合物，取1.5ml的ep管一支，加入待转染的病毒载体质粒，用opti-memi培养基补齐到500μl，轻轻混匀；取1.5ml的ep管一支，加入trans-ez溶液，用opti-memi培养基补齐到500μl，轻轻混匀；将trans-ez稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20分钟，使dna和trans-ez充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养板，将上面得到的dna-trans-ez复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱。6h后吸去培养基，pbs洗一次，加入10ml新鲜生长培养基培养，如有大量细胞漂起，则不去上清，加入6ml完全培养基(市售)，37℃过夜培养，次日换液。三天换一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，等待病变后纯化。重组腺病毒转染后第11天时观察，hek293细胞大量飘落，细胞已经完全病变(见图6)。

2.2牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的收获：

待大部分细胞出现典型的病变，且有50％的细胞脱壁，收集细胞，-70℃与37℃反复冻融3次，收集病毒上清于-70℃保存。

2.3牛mir-145基因过表达重组腺载体的小量扩增：

当培养的hek293细胞达80～90％汇合时，弃培养液，陈留少许覆盖细胞表面；用移液枪将10μl的上述病毒液加入10cm²的盘中，混匀，放入37℃，浓度5％的co2培养箱中；2h后补加10ml培养液，放入培养箱培养；4～5天后待培养的hek293变圆，脱壁，一些细胞漂浮，并且其颜色从橙色变为黄色时即表明细胞已病变，可以用移液枪收集，-70℃保存备用。

2.4牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的大量扩增及梯度离心纯化：

采用hitt等人(1998)的经典氯化铯梯度离心方法和30×150mm培养皿中富集病毒的方法。准备细胞，对于30×150mm培养皿：当所有被感染的细胞变圆并且部分漂浮，刮净培养皿，然后将细胞和上清转入50ml离心管中，750g，离心10分钟。用15ml的0.1m的tris-hcl(ph8.0)重悬。-80度保存。溶解样品，每15ml细胞溶解物加入1.5ml的浓度5％的脱氧胆酸钠，混匀室温孵育30分钟。这个结果是相对澄清的，高粘度的悬浮液。每15ml的细胞溶解物加入150μl氯化镁和75μl的dnaseⅰ溶液，混匀，37度孵育30-60分钟，每隔10分钟混匀一次。粘稠度应该减小，仅仅比水的稍微粘稠些。使用高速台式离心机，4℃，高速离心15分钟。同时，准备氯化铯梯度(用sw41转子的超纯管子，用于5ml的样品)：每个管子中加0.5ml的1.5g/cc的氯化铯溶液，轻轻的在上面铺上3ml的1.35g/cc的氯化铯溶液，轻轻的再铺上一层3ml的1.25g/cc的氯化铯溶液。加好之后不可以打乱梯度。每个梯度的管子加入第4步中得到的上清5ml。用sw41转子，4℃，35000rpm离心，1小时(加速和减速设置1)收集病毒条带(应该在1.25g/cc和1.35g/cc之间)。

将得到的牛mir-145基因过表达重组腺病毒条带转移到sw50.1转子配套的无菌管子中，用1.35g/cc溶液加满管子)，混匀。用sw50.1转子，4℃，35000rpm，离心16-20小时。用尽可能小的体积收集牛mir-145基因过表达重组腺病毒(通常是0.5-1ml)，转入透析袋中，4℃，500倍体积(或者更大)的10mmtris-hcl，ph8.0透析，至少24小时，之间更换2到3次溶液。透析之后，纯化的牛mir-145基因过表达重组腺病毒分装小份-80℃保存。

2.5检测牛mir-145基因过表达重组腺病毒滴度：

检测采用titer-ez腺病毒滴度检测试剂盒(microbix公司)，按照说明书的步骤进行。

选取状态良好的hek293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5.0×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、浓度5％的co2培养。准备好10倍梯度稀释的牛mir-145基因过表达重组腺病毒样品，然后依次将10^-5至10^-8稀释的牛mir-145基因过表达重组腺病毒液加入24孔板中，每孔加入100μl，每一稀释度占用一个孔。37℃、浓度5％的co2感染48小时。轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃固定20min(枪头不要接触到细胞)。使用pbs轻轻的冲洗细胞3次，每次5min(切忌将细胞冲起)。加入0.2ml(浓度1％的bsa)37℃封闭1小时。加入0.2ml的一抗溶液至每个孔中，37℃孵育1小时。使用pbs轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。然后加入0.2ml的二抗至每孔，37℃孵育1小时。使用pbs轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。加入0.2ml工作液至每孔，室温孵育5-10min(孵育时间不要超过10min)。弃工作液，使用pbs清洗2次，每孔加入1mlpbs。每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数(见图7)。计算每孔阳性细胞的平均个数和牛mir-145基因过表达重组腺病毒滴度。

2.6结果计算：

计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。计算24孔板中每孔视野的个数。

计算滴度参考文献：bewig,b.,andw.e.schmidt(2000)acceleratedtiteringofadenoviruses.biotechniques28：870-873。

重组腺病毒载体pad-bta-mir-145滴度结果如下：

在显微镜下5个视野中计算的阳性细胞平均数为9.2，此孔牛mir-145基因过表达重组腺病毒稀释了10⁷倍，牛mir-145基因过表达重组腺病毒滴度为7.27×10¹⁰(pfu/ml)。

本实施例构建的admax腺病毒表达载体，能够在基因的功能研究中广范应用，对进一步其在牛原代前体脂肪细胞分化过程中的作用机制具有重要意义。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种牛mir-145基因过表达重组腺病毒载体的构建方法

<160>

<210>1

<211>40

<212>引物primer1（f）序列

<213>dna

<220>

<400>

gcatggacgagctgtacaagttgagttgctggatgtcgcc

<210>2

<211>39

<212>引物primer2（r）序列

<213>dna

<220>

<400>

tccagaggttgattatcgatagcctcacaggatgttgcg

<210>3

<211>22

<212>引物primer3（f）序列

<213>dna

<220>

<400>

catggtcctgctggagttcgtg

<210>3

<211>20

<212>引物primer4（r）序列

<213>dna

<220>

<400>

gaaatttgtgatgctattgc