本发明属于微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种从发酵液中提取腺苷的方法。
背景技术：
：腺苷，又称“腺嘌呤核苷三磷酸”，简称“atp”。腺苷是一种杂环分子，分子量为267.25，由腺嘌呤、核糖和三个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。人体肌肉中储藏多种能源物质，其中腺苷是主要成分，是人体循环系统疾病的药物。因为腺苷有促进冠状血管扩张及心肌代谢的机能，扩张血管，增加冠状血管血量的药理作用，因此可以用于冠状血管障、狭心症、动脉硬化症及高血压症等疾病的治疗。此外，腺苷及其衍生物可以作为抑制血液凝固药物使用，用腺苷来保藏血液效果很好。同时也可以用于食品、保健品添加剂，有很好的市场前景。目前，工业上主要以糖质原料发酵来进行腺苷的生产，虽然其发酵产量仍有较大提高空间，但发酵法制备腺苷已经很成熟，可通过育种和发酵条件改善来提高产量和降低成本。在整个腺苷生产过程中，提取精制工序是非常重要的一环，决定了产品品质。中国专利技术“cn104762347a”公开了一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，该方法主要包括以下步骤：啤酒酵母的冷冻处理、发酵提转化酶、板框压滤、微滤、发酵合成三磷酸腺苷、纳滤除盐、树脂吸附、树脂洗涤洗脱、超滤除蛋白和热源、乙醇沉淀、干燥等。该方法收率最高可达到81.2%，纯度最高为98.2%，但是该方法操作流程繁琐，使用了树脂吸附，成本较高，而且耗水量较大，对环境造成较大的污染，不符合节能减排的要求。技术实现要素：为了解决常规提取工艺导致产品收率低下、品质不好以及操作方索等技术问题，本发明提供了一种从发酵液中提取腺苷的方法。本发明方法能够有效的分离出腺苷、杂酸、盐分等杂质，降低成本，减少水资源浪费，减少环境污染。本发明是通过如下技术方案来实现的：一种从发酵液中提取腺苷的方法，其包括如下步骤：步骤1）陶瓷膜过滤，步骤2）浓缩，步骤3）粗结晶，步骤4）离心，步骤5）吸附，步骤6）板框过滤，步骤7）二次浓缩结晶，步骤8）离心、烘干。进一步的，所述方法包括如下步骤：步骤1）陶瓷膜过滤：将腺苷发酵液升温至90-100℃，自然降温至40℃以下，通过陶瓷膜过滤，获得滤液和截留物；步骤2）浓缩：将步骤1）得到的滤液，进行浓缩，浓缩2-3倍，收集浓缩液；步骤3）粗结晶：将步骤2）得到的浓缩液移至结晶罐进行粗结晶，获得浓缩液粗结晶；步骤4）离心：将步骤3）获得的浓缩液粗结晶，通过离心机以1000-2000rpm的转速离心，获得粗品；步骤5）吸附：将步骤4）获得的粗品在溶解罐中加入4-8倍纯水重溶，获得重溶液，并加入占重溶液质量1.5-3%的吸附剂；步骤6）板框过滤：将步骤5）重溶液通过板框过滤，获得滤液和吸附剂；步骤7）二次浓缩结晶：将步骤6）获得的滤液再次浓缩2-4倍后，再次进入结晶罐结晶，降温至0℃，转速为5-10r/min，时间为10-30min，获得浓缩液结晶；步骤8）离心、烘干：将步骤7）获得的结晶经离心、烘干、粉碎、检测、包装后获得成品腺苷。优选地，所述吸附剂按照如下工艺制备而得：（1）将硅藻土进行研磨，然后过200目筛，收集筛下物，然后置于浓度为2m的盐酸溶液中超声波分散处理30s，然后静置30min，再以500rpm的转速离心3min，收集沉淀，烘干，得到改性硅藻土；（2）将改性硅藻土、石墨烯以及水按照9:1:5的质量比添加到搅拌机中，1000rpm搅拌3min，然后投入到造粒机中进行造粒，控制颗粒的粒径为500-1000微米，然后置于700℃的条件下，煅烧10min，取出，冷却至室温，即得。优选地，所述陶瓷膜孔径20-50nm，工作温度50-80℃。优选地，所述粗结晶的参数为：控制温度为2℃，转速为10-20r/min，时间为10-30min。优选地，所述板框过滤参数为：过滤压力0.35mpa，通过孔径10微米，水流量为4t/h。优选地，所述超声波频率为30khz。优选地，所述硅藻土和盐酸溶液的比例为1g:2ml。与现有技术相比，本发明取得的有益结果主要包括但是并不限于以下几个方面：1、采用了陶瓷膜过滤去除菌体蛋白，能够100%的过滤菌体，并且菌体蛋白可以回用，避免了资源的浪费。2、采取二次结晶的方法提取腺苷，第一次粗结晶可以去除大部分杂质，二次结晶有效除去剩余杂质，减少能量消耗，从而降低生产成本。3、本发明不使用有机化学物质，避免了对产品的污染，并且节约了成本。4、本发明避免使用常规的活性炭吸附剂，使用特殊吸附剂，比表面积大，不会破碎，减少了吸附剂残留，并且吸附剂经过煅烧还可以再生，节约了成本。5、本发明吸附剂制备过程中，首先对硅藻土进行研磨和盐酸改性，提高了表面活性基团的数目；石墨烯强度大，韧性高，具备独特的层状结构和比表面积，能够吸附剂对色素和金属离子的吸附能力，吸附效果优于常规的活性炭，并且可以再生。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种从发酵液中提取腺苷的方法，其步骤如下：1）将腺苷发酵液升温至90℃，自然降温至40℃以下，通过陶瓷膜过滤，获得滤液和截留物；其中陶瓷膜孔径20nm，工作温度60℃。2）将步骤1）得到的滤液，通过旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩3倍，收集浓缩液；蒸发出去的蒸馏水可以回用；3）将步骤2）得到的浓缩液移至结晶罐进行粗结晶，控制温度为2℃，转速为20r/min，时间为20min，获得浓缩液粗结晶；4）将步骤3）获得的浓缩液粗结晶，通过离心机以1000rpm的转速离心，获得粗品；5）将步骤4）获得的粗品在溶解罐中加入4倍纯水重溶，获得重溶液，并加入占重溶液质量1.5%的吸附剂；6）将步骤5）重溶液通过板框过滤，获得滤液和吸附剂；板框过滤参数为：过滤压力0.35mpa，通过孔径10微米，水流量为4t/h；7）将步骤6）获得的滤液再次经过旋转蒸发仪浓缩2倍后，再次进入结晶罐结晶，降温至0℃，转速为10r/min，时间为20min，获得浓缩液结晶；8）将步骤7）获得的结晶经离心、烘干、粉碎、检测、包装后获得成品腺苷；所述吸附剂按照如下工艺制备而得：1）将硅藻土进行研磨，然后过200目筛，收集筛下物，然后置于浓度为2m的盐酸溶液中超声波分散处理30s，然后静置30min，再以500rpm的转速离心3min，收集沉淀，烘干，得到改性硅藻土；超声波频率为30khz，硅藻土和盐酸溶液的比例为1g:2ml；2）将改性硅藻土、石墨烯以及水按照9:1:5的质量比添加到搅拌机中，1000rpm搅拌3min，然后投入到造粒机中进行造粒，控制颗粒的粒径为500-1000微米，然后置于700℃的条件下，煅烧10min，取出，冷却至室温，即得。实施例2一种从发酵液中提取腺苷的方法，其步骤如下：1）将腺苷发酵液升温至100℃，自然降温至40℃以下，通过陶瓷膜过滤，获得滤液和截留物；其中陶瓷膜孔径50nm，工作温度50℃。2）将步骤1）得到的滤液，通过旋转蒸发仪或双效蒸发器进行浓缩，浓缩3倍，收集浓缩液；蒸发出去的蒸馏水可以回用；3）将步骤2）得到的浓缩液移至结晶罐进行粗结晶，控制温度为2℃，转速为20r/min，时间为15min，获得浓缩液粗结晶；4）将步骤3）获得的浓缩液粗结晶，通过离心机以2000rpm的转速离心，获得粗品；5）将步骤4）获得的粗品在溶解罐中加入6倍纯水重溶，获得重溶液，并加入占重溶液质量1.5%的吸附剂；6）将步骤5）重溶液通过板框过滤，获得滤液和吸附剂；板框过滤参数为：过滤压力0.35mpa，通过孔径10微米，水流量为4t/h；7）将步骤6）获得的滤液再次经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，降温至0℃，转速为10r/min，时间为20min，获得浓缩液结晶；8）将步骤7）获得的结晶经离心、烘干、粉碎、检测、包装后获得成品腺苷；所述吸附剂按照如下工艺制备而得：1）将硅藻土进行研磨，然后过200目筛，收集筛下物，然后置于浓度为2m的盐酸溶液中超声波分散处理30s，然后静置30min，再以500rpm的转速离心3min，收集沉淀，烘干，得到改性硅藻土；超声波频率为30khz，硅藻土和盐酸溶液的比例为1g:2ml；2）将改性硅藻土、石墨烯以及水按照9:1:5的质量比添加到搅拌机中，1000rpm搅拌3min，然后投入到造粒机中进行造粒，控制颗粒的粒径为500-1000微米，然后置于700℃的条件下，煅烧10min，取出，冷却至室温，即得。实施例3一种从发酵液中提取腺苷的方法，其步骤如下：1）将腺苷发酵液升温至95℃，自然降温至40℃以下，通过陶瓷膜过滤，获得滤液和截留物。其中陶瓷膜孔径30nm，工作温度55℃。2）将步骤1）得到的滤液，通过双效蒸发器进行浓缩，浓缩2倍，收集浓缩液；蒸发出去的蒸馏水可以回用；3）将步骤2）得到的浓缩液移至结晶罐进行粗结晶，控制温度为2℃，转速为15r/min，时间为15min，获得浓缩液粗结晶。4）将步骤3）获得的浓缩液粗结晶，通过离心机以1500rpm的转速离心，获得粗品；5）将步骤4）获得的粗品在溶解罐中加入5倍纯水重溶，获得重溶液，并加入占重溶液质量2%的吸附剂；6）将步骤5）重溶液通过板框过滤，获得滤液和吸附剂；板框过滤参数为：过滤压力0.35mpa，通过孔径10微米，水流量为4t/h；7）将步骤6）获得的滤液再次经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，降温至0℃，转速为8r/min，时间为25min，获得浓缩液结晶；8）将步骤7）获得的结晶经离心、烘干、粉碎、检测、包装后获得成品腺苷；所述吸附剂按照如下工艺制备而得：1）将硅藻土进行研磨，然后过200目筛，收集筛下物，然后置于浓度为2m的盐酸溶液中超声波分散处理30s，然后静置30min，再以500rpm的转速离心3min，收集沉淀，烘干，得到改性硅藻土；超声波频率为30khz，硅藻土和盐酸溶液的比例为1g:2ml；2）将改性硅藻土、石墨烯以及水按照9:1:5的质量比添加到搅拌机中，1000rpm搅拌3min，然后投入到造粒机中进行造粒，控制颗粒的粒径为500-1000微米，然后置于700℃的条件下，煅烧10min，取出，冷却至室温，即得。实施例4本发明腺苷纯度和收率的测定1、腺苷纯度的检测方法：色谱条件色谱柱：c184.6mm×25cm×5μm检测波长：254nm流速：1.0ml/min进样量：20μl流动相：硫酸盐缓冲液：水=60:40硫酸盐缓冲液：精密称取硫酸氢钾约6.8g和硫酸氢化四丁铵约3.4g，加水溶解并定容至1000ml，用2n氢氧化钾调节ph至6.5。溶液制备系统适应性溶液：精密称取腺苷对照品20mg和肌苷对照品20mg，同置100ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。样品溶液：精密称取供试品10mg，置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。系统适用性试验腺苷峰与肌苷峰的分离度r应不低于9.0，拖尾因子（t）≯2.5，响应因子的相对标准偏差rsd≤2.0%。进样顺序空白溶液（n=1）→系统适应性溶液（n=5）→供试液（a、b各1针）…典型色谱保留时间腺苷11.6±0.5min肌苷5.5±0.5min2、腺苷收率通过计算获得，计算公式如下：腺苷收率=（成品质量/发酵液中初始质量）×100％3、本发明制备的腺苷产品外观色泽均一，为白色结晶粉末；纯度较高，达到医药级应用水准。设置对照组检测了各因素对收率和纯度的影响：实验组：实施例1；对照组1：吸附剂采用常规的活性炭；对照组2：吸附剂采用常规的硅藻土；对照组3：采用树脂吸附的方法，具体参照cn104762347a。各组别的纯度和收率见表1：表1组别收率％纯度％实验组83.999.4对照组180.188.6对照组282.890.3对照组379.498.1结论：通过表1可见，本发明实验组的收率和纯度最高，而对照组1-2使用了其他吸附剂，纯度大大下降，可能是因为常规吸附剂的吸附效果偏弱，而且容易残留到产品中；与现有技术中的树脂吸附法相比，本发明采用二次结晶法，收率和纯度有一定的提升，而且成本低廉，不使用或少使用化学试剂，安全性能高，无公害，提升了产品品质。吸附剂是本发明提取方法中耗材较为昂贵的产品，本发明的吸附剂可以再生，再生工艺包括如下步骤：将使用后的吸附剂取出，置于400－500℃煅烧5min，取出，冷却，再用清水洗净，烘干，即完成了吸附剂的再生；节约了企业成本，提高了利润。需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12