一种用压电技术制备部分植物单细胞样品的方法与流程

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用压电技术制备部分植物单细胞样品的方法。

背景技术：

目前随着单细胞测序技术的迅猛发展，单细胞pcr技术也随之进展迅速，其中单细胞分离技术是这些技术的基础，而植物研究应用等领域中却没有太好的办法获取完整的单细胞，只得通过各种酶解法(果胶酶，纤维素酶等)进行各种植物组织，破坏植物细胞间的正常粘连结构，但植物细胞壁因其成分结构类似于细胞间结构，因此在分离单细胞的过程中也一并被去除，这种去除植物细胞壁的细胞称作原生质体，现有的方法是以这种单原生质体分离测序的方法代表完整植物单细胞分离测序，而这种酶解消化处理后获得的原生质体是否可以代表完整的植物单细胞所有分子生理状态确实是个问题，因此在目前正在兴起的各种植物单细胞分离测序的工作中如何获取含细胞壁的完整植物单细胞成为是必须要首先解决的难题。

技术实现要素：

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用压电技术制备部分植物单细胞样品的方法，来达到分离植物细胞间粘连，同时又保护植物细胞壁的目地，这样即分离开了植物细胞，又保持了植物细胞完整的结构与形态，尽可能地保持了植物细胞原有的活性。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用压电技术制备部分植物单细胞样品的方法，包含如下步骤：

步骤1，用100ul移液器及配套枪头在培养皿中制备若干调试液滴(操作液滴)和对比液滴；

步骤2，用消毒灭菌眼科小手术镊取活体植株芽尖顶端分生组织，只保留1-2片含生长点的叶原基，经过清洗等预处理后转入培养皿中预先制备好的调试液滴(操作液滴)中；

步骤3，在显微镜下观察植物芽尖顶端分生组织结构形态；

步骤4，调节和测试电破膜仪功能；

步骤5，使用显微操作针展开植物芽尖顶端分生组织，并固定部分分生组织；

步骤6，根据镜下实际情况，调整电破膜仪的工作参数并启动压电振动，通过显微操作针处理植物芽尖顶端分生组织，直至植物单细胞从分生组织上脱落；

步骤7，松开固定在部分分生组织的显微操作针，并在分生组织其他部分重复步骤5-步骤6。

优选的是，所述步骤4包括如下步骤：

步骤4.1，用10ul移液器与微量上样针往显微操作针内装入5ul左右的重油；

步骤4.2，用油压式显微注射仪将重油推到显微操作针的头部；

步骤4.3，将显微操作针降入所述调试液滴(操作液滴)中测试压电破膜仪功能，并用调试液滴(操作液滴)清洗显微操作针头部，直至压力平衡。

优选的是，所述步骤1的培养皿为60mm培养皿。

优选的是，所述步骤5的显微操作针为piezotransfertipes显微操作针。

优选的是，所述步骤4.1的微量上样针为microloader微量上样针。

优选的是，所述步骤4.1的重油为sigmafc-770重油。

优选的是，所述步骤6的电破膜仪的工作参数包括强度、速度、次数。

优选的是，所述步骤6的电破膜仪的工作参数为强度46，速度20次/秒，次数为无穷大。

3.有益效果

综上所述，本发明的有益效果在于：

(1)该方法解决了部分植物单细胞制备的问题，避免了制备植物原生质体工作中对于植物细胞原本细胞壁等结构与功能的破坏，尽可能最大程度上保持了植物细胞原有的形态与活性；

(2)该方法根据不同植物组织情况进行各项参数调整并记录，方便了实际操作，提高了实验的工作效率，保证并提高了实验的成功率。

附图说明

图1是显微镜下的两根显微操作针进行的拟南芥芽尖顶端分生组织压电辅助单细胞分离照片。

具体实施方式

以拟南芥芽尖分生组织进一步说明本发明的实施例。

实验仪器

选用全套德国eppendorf显微操作系统，基本配置如下：

1.transferman4r显微操作仪x2(用于精准移动显微操作针)；

2.celltram4rair手动气压式显微注射仪x1(用于吸取与释放植物细胞或常规单细胞样品)；

3.celltram4roil手动油压式显微注射仪x1(用于吸取与释放植物常规单细胞样品或单个植物干细胞等)；

4.leicadmrib手动倒置显微镜x1(用于准确观察植物单细胞样品，各种常规倒置镜都可以使用)；

5.piezoxpert压电式破膜仪x1(用于在以上设备与耗材的配合下，产生一个合适的振动，传递到相连的显微操作针上，通过操作针造成植物细胞振动，将含细胞壁的植物单细胞从组织上振落；随后可以配合上述设备选取移动并释放所需要选用的含完整细胞壁的植物单细胞)；

6.10ulreference2移液器x1，含配套枪头若干(用于将产生压电振动的配套重油加入显微操作针管内，并用于制备各种10ul以下显微调试液滴(操作液滴))；

7.100ulreference2移液器x1，含配套枪头若干(用于制备各种10-100ul显微调试液滴(操作液滴))；

8.adapter适配器(将显微操作仪安装到显微镜上)。

实验耗材

1.60mm细胞培养皿：若干(取其皿盖做为载体，制备植物组织处理与单细胞分离液滴，及空白对照液滴，进行各种相关组织细胞显微操作)；

2.microloader微量上样针：若干(用于将生压电振动的配套重油加入显微操作针管内)；

3.piezotransfertipes显微操作针：若干(用于接受下列压电破膜仪产生的振动，并传递到植物组织，造成组织振动，将含细胞壁的植物单细胞从组织上振落；随后可以配合上述设备选取移动并释放所需要选用的含完整细胞壁的植物单细胞)。

实验试剂

1.植物细胞培养液：若干；

2.sigmafc-770重油：200ul(用10ul移液器配套微量上样针加入显微操作针管中，配合产生这种可控合适强度高频微小振动)。

实验步骤

步骤1，用100ul移液器及配套枪头在60mm培养皿中间制备若干调试与对照液滴；

步骤2，用消毒灭菌眼科小手术镊取活体拟南芥芽尖顶端分生组织，只保留1-2片含生长点的叶原基，经过清洗等预处理后转入培养皿中预先制备好的调试液滴(操作液滴)中；

步骤3，在显微镜下对焦观察拟南芥芽尖顶端分生组织结构形态；

步骤4，用10ul移液器与微量上样针往显微操作针内装入5ul左右的重油，装上显微操作系统后用连接的油压式显微注射仪将重油推到显微操作针的头部，将操作针降入调试液滴(操作液滴)中测试压电破膜仪的功能，并用调试液滴(操作液滴)清洗操作针头部，最后压力平衡后，准备正式实验；

步骤5，操作左边显微操作仪，调整操作针展开拟南芥芽尖顶端分生组织，随后压住拟南芥芽尖顶端分生组织的一部分，进行组织固定，操作右边显微操作仪，带动显微操作针移动到拟南芥芽尖顶端分生组织上，并压住另一部分组织；

步骤6，启动压电振动，带动显微操作针进行附近的拟南芥芽尖顶端分生组织的处理，这里可以在显微镜下看到拟南芥单细胞纷纷从组织块上脱离下来；

步骤7，根据镜下实际情况，调整压电破膜仪合适的各项参数，包括强度、速度、次数等(本次实验设定参数，强度为46、速度为20次/、次数为无穷大，即踩下脚踏板后即产生震动，达到效果后松开脚踏即停止震动)，达到即脱离下单细胞，又保存好细胞壁的目地，如果对分离结果满意，可以通过程序记录功能存贮全套参数组合；

步骤8，松开压在拟南芥芽尖顶端分生组织上的两侧操作针，进行下一个部位的拟南芥细胞压电脱离操作动作。

实验结果

如图1所示，显微镜下观察到的用两根显微操作针进行拟南芥芽尖顶端分生组织的压电辅助单细胞分离，其中的一根据显微操作针固定住植物活组织，另一根显微操作针接上压电破膜仪，也接触到植物活组织时，启动压电振动，将植物单细胞从植物活组织上振落下来。图1中可见上端植物活组织没有压电振动，因此边缘完好，没有分离下来的组织散出；但是图1下方压电显微操作针处理过的植物活组织，因组织已经被震散，许多单细胞分离出来，活组织的圆滑边缘已经破坏，周围散布的许多震动下来分散在周围的植物单细胞，这些震下来的细胞可以直接用于下游的植物单细胞分离，并且立即进行随后的单细胞pcr与单细胞测序工作。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效产品方法变换，或直接或间接运用附属在其他相关技术产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。