本发明涉及细胞培养基领域，特别涉及一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法及其制得的动物细胞培养液的应用。
背景技术：
各种动物来源细胞的体外培养是生命科学研究的重要组成部分，也被认为是一种重要的动物实验替代方法。细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除需无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，它供给细胞生长所需要的营养物质。目前对细胞生长所需的营养成分尚未完全搞清楚，因此需要加入一些天然的成分，否则细胞很难良好的生长。动物血清，尤其是牛血清，是动物来源细胞培养中用量最大的天然培养基。血清的生物学效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促黏附因子、激素及其他活性物质。而且血清能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。
目前用于动物来源细胞培养的天然培养基主要以胎牛血清或新生牛血清为主。胎牛血清是在母牛怀孕五至八月龄时，剖腹产将胎牛取出，在没有任何麻醉措施的条件下进行心脏穿刺取血。为了保证收集到较多量的血清并保证所收集的血清质量，在采血的过程中需要保证胎牛是活的，心脏取血可能造成胎牛的痛苦，因此胎牛血清的使用一直存在动物伦理和科学的争议。每头胎牛只能取得约0.5升的血清，产量低，成本高，因此其价格相当昂贵。新生牛血清是出生12-24小时的新生牛静脉采血所得，同样产量较低，价格虽然比胎牛血清便宜，但是随着需求量的增加，价格也不断攀升。此外，牛血清还存在批次间差异较大，性能不稳定的缺点。因此，开发适用于动物来源细胞培养的替代牛血清的优质培养基符合当前的发展需求。
牛、羊、马、猪等家畜的血液来源丰富，可以从中提取血细胞裂解液。血液中白细胞可释放出多种细胞因子，如白细胞介素、集落刺激因子、转化生长因子等。血小板的作用是凝聚在损伤部位，协助凝血机制，并释放生长因子以及其他介质促进伤口愈合。血小板经裂解后可释放出多种生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、基质细胞衍生因子-1、血管内皮生长因子等。这些生长因子参与许多不同的细胞功能，可以促进动物来源细胞的生长和增殖。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法及制得的动物细胞培养液的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，包括以下步骤：将牛、羊、马、猪或其他家畜采全血后经离心、自然沉降或淋巴细胞分离液等方法分离得到血细胞；然后采用反复冻融法或超声法裂解血细胞，离心收集上清液，经微孔滤膜过滤后得到血细胞裂解液。
优选的是，其中，所述微孔滤膜选用0.22μm膜。
优选的是，包括以下步骤：
1)将牛、羊、马、猪或其他家畜采全血后收集在含有抗凝剂的血袋中；
2)经离心、自然沉降或淋巴细胞分离液等方法分离得到血细胞(包括白细胞或血小板)；
3)裂解血细胞；
4)4000g下离心20分钟，收集上清液；
5)将所得溶液经过0.22μm膜过滤，制备得到血细胞裂解液，-20℃保存备用。
优选的是，其中的血细胞为白细胞或血小板。
优选的是，所述步骤3)中采用反复冻融法裂解血细胞，具体为将血细胞置于-80℃/4℃反复冻融2-6次。
优选的是，所述步骤3)中采用反复冻融法裂解血细胞，具体为将血细胞置于-80℃/4℃反复冻融5次。
优选的是，所述步骤3)中采用超声法裂解血细胞，具体为在130w的功率下超声10秒停10秒反复进行，共计5分钟。
一种由上述家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法制得的动物细胞培养液的应用，即培养动物细胞时，将由所述方法制得的血细胞裂解液作为动物细胞培养液完全或部分替代牛血清，以5％-30％的比例添加到商品化的基本培养基中。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法及其制得的动物细胞培养液的应用，与胎牛血清和新生牛血清相比，本发明制备的细胞培养基不但能有效的促进细胞增殖，而且批次间一致性高，价格低廉，来源广泛，不存在动物伦理的争议。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，包括以下步骤：将牛、羊、马、猪或其他家畜采全血后经离心、自然沉降或淋巴细胞分离液等方法分离得到血细胞(包括白细胞或血小板)；然后采用反复冻融法或超声法裂解血细胞，离心收集上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后得到血细胞裂解液。
本发明还提供该方法制得的动物细胞培养液的应用，即培养动物细胞时，将该动物细胞培养液(血细胞裂解液)完全或部分替代牛血清，以5％-30％的比例添加到商品化的基本培养基中。
以下提供具体实施例，以对本发明做进一步说明。
实施例一：
一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，具体步骤为：
(1)将牛、羊、马、猪等家畜采全血后收集在含有抗凝剂的血袋中，经离心分离得到富血小板血浆，调整浓度至100-150×109个/l；
(2)将血小板置于-80℃/4℃反复冻融，2-6次，进一步优选为5次；
(3)4000g离心力下离心20分钟，收集上清液；
(4)将所得溶液经过0.22μm膜过滤，制得血小板裂解液，-20℃保存备用。
实施例二：
一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，具体步骤为：
(1)将牛、羊、马、猪等家畜采全血后收集在含有抗凝剂的血袋中，经离心分离得到富白细胞血浆，调整浓度至5-10×109个/l；
(2)将白细胞置于-80℃/4℃反复冻融，2-6次，进一步优选为5次；
(3)4000g离心力下离心20分钟，收集上清液；
(4)将所得溶液经过0.22μm膜过滤，制得白细胞裂解液，-20℃保存备用。
实施例三：
一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，具体步骤为：
(1)将牛、羊、马、猪等家畜采全血后收集在含有抗凝剂的血袋中，经离心分离得到富血小板血浆，调整浓度至100-150×109个/l；
(2)超声裂解血小板，100％功率(130w)，超声10秒停10秒，反复进行裂解，共计5分钟；
(3)4000g离心20分钟，收集上清液；
(4)将所得溶液经过0.22μm膜过滤，制得血小板裂解液，-20℃保存备用。
实施例四：
一种家畜血细胞制备动物细胞培养液的方法，具体步骤为：
(1)将牛、羊、马、猪等家畜采全血后收集在含有抗凝剂的血袋中，经离心分离得到富白细胞血浆，调整浓度至5-10×109个/l；
(2)超声裂解白细胞，100％功率(130w)，超声10秒停10秒，反复进行裂解，共计5分钟；
(3)4000g离心20分钟，收集上清液；
(4)将所得溶液经过0.22μm膜过滤，制得白细胞裂解液，-20℃保存备用。
实施例五：
提供一种由实施例一至实施例四中任意一种方法制得的血细胞裂解液用于培养骨髓瘤细胞(ns-1)的应用，具体步骤为：
将实施例一至实施例四中任意一种处理得到的血细胞裂解液按10％的比例加入1640细胞培养基中培养ns-1细胞，观察细胞生长情况。设置胎牛血清组(1640+10％胎牛血清)、反复冻融组(1640+10％冻融处理的血细胞裂解液)和超声组(1640+10％超声处理的血细胞裂解液)，比较各组的细胞生长情况。
结果表明，用本发明制备的血细胞裂解液培养的细胞，与胎牛血清相比，在形态上无明显差别，生长良好。由此可见，本发明制备的血细胞裂解液可以替代牛血清作为动物细胞培养液。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。