专利名称：一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法及其应用，更具体地说是利用荧光强度定量分析技术定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，并将该方法用于动物细胞培养中细胞凋亡诱因的筛查和抗凋亡化合物的筛选，属于细胞工程技术领域。
背景技术：
细胞凋亡是动物细胞体外培养过程中细胞死亡的主要方式，也是大规模动物细胞培养过程中期制约活细胞密度和细胞表达产品生产效率、影响细胞表达产品质量重要因素。预防并控制动物细胞培养过程中的细胞凋亡是提高动物细胞表达产品生产效率和质量的关键技术手段。
细胞凋亡的定量检测是控制动物细胞培养过程中细胞凋亡的重要前提。目前，细胞凋亡的检测方法大致可归为三类形态学检测方法、生化和分子生物学检测方法及流式细胞仪检测方法。细胞凋亡的形态学检测方法、生化和分子生物学检测方法难于检测出处于凋亡早期阶段的凋亡细胞，一般主要用于检测处于凋亡中、晚期阶段的凋亡细胞。其中，形态学方法虽然直观可靠，但主观性较强、定量不够准确，检测效率低、不能完成对大批量细胞样品的检测；生化和分子生物学方法(如琼脂糖凝胶电泳法、TUNEL法、Caspases活性检测法)的样品需要量较大、操作繁琐耗时，一般只能对检测样品的细胞凋亡作相对定量分析。目前，最常用的细胞凋亡检测方法是基于FITC-AnnexinV/PI(异硫氰酸荧光素-膜联蛋白/碘化丙啶)染色的流式细胞仪方法。该方法能够检测出部分处于早期的细胞凋亡，结果较为准确，但其缺点是不能用于原位检测贴壁依赖生长细胞的凋亡，荧光染料的价格较高、流式细胞仪的价格昂贵，不利于其推广应用。此外，由于流式细胞仪检测法不能区分早期阶段的细胞坏死(称为胀亡，oncosis)和凋亡，在一定程度上影响了流式细胞仪检测法的特异性和准确性。
体外培养的动物细胞受不断变化的环境条件的影响，任何能影响细胞正常代谢和/或生长的环境因素即细胞环境压力均有可能诱发细胞的凋亡和坏死。尽管动物细胞体外培养的细胞环境压力一般不足于招致细胞的原发性坏死，而是启动细胞按自身预定的精确步序发生、发展的细胞自杀过程(即细胞凋亡)，但往往也同时伴随着一定程度的原发性细胞坏死。此外，在持续存在或加剧的细胞环境压力作用下，处于凋亡早、中期阶段的凋亡细胞可转化为继发性的细胞坏死。因而，在动物细胞的培养物中往往可同时观察到不同程度的细胞坏死。在定量测定动物细胞凋亡的同时定量检测细胞坏死，能更全面地反映体外培养细胞的生长状况，更全面地分析细胞环境压力对细胞存活的影响。
YO-PRO-1(简称YP)是一种喹啉化合物，其化学文摘索引号和化学名称(CASNumber/Name)为152068-09-2/Quinolinium，4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-，diiodide)。它能够在细胞膜通透性发生轻微变化的细胞凋亡早期透过细胞膜，与DNA结合发出强烈的绿色荧光。碘化丙啶(PI)也是一种核酸染料，它只能透过通透性很强的坏死细胞膜，与DNA结合发出红色荧光。这两种染料的联合应用，能够将活细胞(YP-/PI-)、凋亡细胞(YP+/PI-)和坏死细胞(YP-/PI+和极少量YP+/PI+)区分开来。2002年，Wronski等用荧光分光光度计检测YP/PI联合染色细胞样品，根据YP和PI的荧光强度比值定性分析细胞样品中凋亡细胞与坏死细胞的相对比值。对于利用荧光强度定量分析技术定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，迄今尚无文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性，利用荧光强度定量分析技术定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，并将该方法用于动物细胞培养中细胞凋亡诱因的筛查和抗凋亡化合物的筛选。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，以YO-PRO-1(YP)和碘化丙啶(PI)为细胞凋亡检测的荧光染料，用荧光分光光度计分别测量具有不同稀释度的细胞样品的YP和PI荧光强度，用荧光显微镜判定各具有不同稀释度的细胞样品中的凋亡细胞数和坏死细胞数；对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析，分别得到依据YP荧光强度值和PI荧光强度值求得凋亡细胞数和坏死细胞数的直线相关方程；用荧光分光光度计测量待测样品的YP和PI值，分别代入上述直线相关方程，得到待测样品中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
本发明具有广泛的适用性，所述动物细胞包括贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞和非贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞，至少包括但并不局限于CHO、Vero、BHK、HEK、C127细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞。
所述细胞样品是指用于建立直线相关方程的动物细胞，可以直接采用批次培养至第2～5天的待测动物细胞，也可以依照下述方法制备在生长状态良好的细胞培养物中加入浓度为800nM的星形孢菌素，37℃、5％CO2条件下作用8～12小时，使部分细胞凋亡和死亡。
本发明可以但并不局限于用下述方式实施在生长状态良好的细胞培养物中加入浓度为800nM的星形孢菌素(staurosporine，STS)，37℃、5％CO2条件下作用8～12小时，STS通过抑制细胞内的蛋白激酶C而使部分细胞凋亡和死亡，以此作为用于建立定量检测细胞凋亡方法的细胞样品；或直接以批次培养第2～5天的动物细胞作为用于建立定量检测细胞凋亡方法的细胞样品。用细胞密度和活力自动分析系统(Cedex A20，Innovatis)确定的细胞样品中的细胞密度。
根据细胞样品的细胞密度先用用含1～5％(v/v)小牛血清的DMEM培养基对细胞样品作5～20倍稀释，再分别作2～10倍稀释，用微量加样器按100μl/孔移入96孔细胞培养板，每一稀释度样品分别加于2块细胞培养板中，每块细胞培养板中的加入孔数为3，同时在其中的1块细胞培养板中设置添加100μl稀释液的对照孔1个。
于设置有对照孔的细胞培养板的各孔中加入100μl YP浓度为5μM、PI浓度为5μg/ml、血清浓度为1～5％(v/v)DMEM培养基，37℃作用5～10分钟后，用荧光分光光度计分别读取各样品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP荧光强度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI荧光强度值。
在对细胞样品进行荧光强度定量分析的同时，用Nikon Eclipse TE300倒置荧光显微镜的10×或20×相差荧光物镜查看细胞的荧光着色，显现绿色荧光的细胞判定为凋亡细胞，显现橙色荧光的细胞判定为坏死细胞。分别计数各孔中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
以YP荧光强度值为横坐标、倒置荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的凋亡细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的YP荧光强度值与凋亡细胞数的关系；以PI荧光强度值为横坐标、倒置荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的坏死细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的PI荧光强度值与坏死细胞数的关系。对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析，分别得到依据YP荧光强度值和PI荧光强度值求得凋亡细胞数和坏死细胞数的直线相关方程。
本发明与现有技术相比具有以下优点①可同时定量检测细胞样品的细胞凋亡和坏死。②按照本发明的定量检测动物细胞凋亡方法能够检测出样品中少至100个的凋亡细胞，灵敏度高、特异性强。③所需仪器和试剂的价格相对便宜、检测成本低。④操作简便、快捷，可在短时间内完成对大批量细胞样品的凋亡检测。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明，并非对本发明实施方式的限制。
图1为实施例1中倒置荧光显微镜下观察的经YP和PI染色处理的杂交瘤细胞。显现绿色荧光的细胞为凋亡细胞，显现橙色荧光的细胞为坏死细胞。
图2为实施例1中YP荧光强度值与凋亡杂交瘤细胞数在直角坐标系中的对应关系。
图3为实施例1中PI荧光强度值与坏死杂交瘤细胞数在直角坐标系中的对应关系。
具体实施例方式
实施例1、定量检测杂交瘤细胞凋亡方法的建立(1)细胞样品的准备在生长状态良好的分泌抗人单链尿激酶原单克隆抗体的杂交瘤细胞(由军事医学科学院生物工程研究所采用杂交瘤技术构建)培养物中加入浓度为800nM STS，37℃、5％CO2条件下作用12小时后，用细胞密度和活力自动分析系统(Cedex A20，Innovatis)确定的细胞样品中的细胞密度，以此作为用于建立定量检测杂交瘤细胞凋亡方法的细胞样品。
(2)杂交瘤细胞样品中凋亡细胞数的定量用含2％(v/v)小牛血清的DMEM培养基对杂交瘤细胞样品作10倍稀释后，再分别作2～10倍稀释，用微量加样器按100μl/孔移入96孔细胞培养板，每一稀释度样品各加3个培养孔。在装备有落射荧光光源的Nikon Eclipse TE300倒置显微镜下用10×或20×相差荧光物镜查看杂交瘤细胞的荧光着色，显现绿色荧光的细胞判定为凋亡细胞，显现橙色荧光的细胞判定为坏死细胞(图1)。分别计数适宜稀释度孔中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
(3)杂交瘤细胞样品的YP和PI荧光强度测定将上述经不同倍数稀释的杂交瘤细胞样品加入另一块细胞培养板中，每一稀释度样品各加3个培养孔，同时在其中块设置添加100μl稀释液的对照孔1个。于各孔中加入100μl YP浓度为5μM、PI浓度为5μg/ml、血清浓度为2％(v/v)的DMEM培养基，37℃作用5～10分钟后，用荧光分光光度计分别读取各样品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP荧光强度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI荧光强度值。
(4)YP荧光强度与杂交瘤细胞凋亡数的直线回归分析以YP荧光强度值为横坐标、倒置荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的凋亡细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的YP荧光强度值与凋亡细胞数的关系(图2)；以PI荧光强度值为横坐标、倒置荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的坏死细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的PI荧光强度值与坏死细胞数的关系(图3)。对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析，分别得到依据YP荧光强度值和PI荧光强度值求得凋亡杂交瘤细胞数和坏死杂交瘤细胞数的直线相关方程。YP荧光强度值与凋亡杂交瘤细胞数、PI荧光强度值与坏死杂交瘤细胞数的直线相关系数分别为0.995和0.984。
凋亡杂交瘤细胞数＝4.69×YP荧光强度值+0.059坏死杂交瘤细胞数＝13.49×PI荧光强度值-0.062实施例2、定量检测CHO工程细胞凋亡方法的建立表达人重组尿激酶原的CHO工程细胞(由军事医学科学院生物工程研究所采用基因重组技术构建，简称CHO工程细胞)用小牛血清浓度为1％(v/v)的DMEM/F12培养基培养于100ml组织培养瓶中。培养的第5天，经0.25％(w/v)的胰蛋白酶消化处理后，用小牛血清浓度为1％(v/v)的DMEM/F12培养基分散、悬浮。以此作为用于建立定量检测CHO工程细胞凋亡方法的细胞样品，并用细胞密度和活力自动分析系统确定的细胞样品中的细胞密度。
用含2％(v/v)小牛血清的DMEM培养基对CHO工程细胞样品作20倍稀释后，再分别作2～10倍稀释后，按实施例1中步骤2所述的方法在Nikon Eclipse TE300荧光倒置显微镜下分别计数适宜稀释度孔中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
将上述经不同倍数稀释的CHO工程细胞样品加入另一块细胞培养板中，按实施例1中步骤3所述的方法处理细胞样品并用荧光分光光度计分别读取各样品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP荧光强度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI荧光强度值。
按实施例l中步骤4所述的方法对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析，分别得到依据YP荧光强度值和PI荧光强度值求得凋亡CHO工程细胞数和坏死CHO工程细胞数的直线相关方程。YP荧光强度值与凋亡CHO工程细胞数、PI荧光强度值与坏死CHO工程细胞数的直线相关系数分别为0.981和0.958。
凋亡CHO工程细胞数＝12.5×YP荧光强度值-0.023坏死CHO工程细胞数＝11.92×PI荧光强度值+0.055实施例3、培养基中氨基酸和葡萄糖缺乏对体外培养杂交瘤细胞凋亡的影响将生长状态良好的分泌抗人单链尿激酶原单克隆抗体的杂交瘤细胞用含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培养基悬浮、调整细胞浓度为1.4×104cells/ml，按200μl/孔接种96孔细胞培养板，每块细胞培养板中同时设置2个只加DMEM培养基的空白对照孔，37℃、5％CO2条件下培养24小时。
先用移液器自各培养孔中吸去160μl培养基，除其中的4个培养孔按170μl/孔更换含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培养基外，其余培养孔按170μl/孔分别更换为如下氨基酸或葡萄糖缺失的DMEM培养基无谷氨酰胺DMEM、无甲硫氨酸DMEM、无丙酮酸钠DMEM、无赖氨酸DMEM、无异亮氨酸DMEM、无胱氨酸DMEM和无葡萄糖DMEM，每种处理设置4个重复。
37℃、5％CO2条件下培养2天后，先用移液器自各培养孔中吸去100μl培养基，再于各孔中加入100μl YP浓度为5μM、PI浓度为5μg/ml、血清浓度为2％(v/v)的DMEM培养基，37℃作用5～10分钟后，用荧光分光光度计分别读取各样品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP荧光强度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI荧光强度值。
求出相同处理的YP荧光强度平均值，代入实施例1所求得的YP荧光强度值和凋亡杂交瘤细胞数的直线相关方程，得到各处理的的凋亡杂交瘤细胞数；求出相同处理的PI荧光强度平均值，代入实施例1所求得的PI荧光强度值和坏死杂交瘤细胞数的直线相关方程，得到各处理的坏死杂交瘤细胞数。以各处理的凋亡杂交瘤细胞数为主要评价指标，结合各处理的坏死杂交瘤细胞数评定培养基中氨基酸和葡萄糖缺乏诱导体外培养杂交瘤细胞凋亡的作用。表1所列为氨基酸和葡萄糖缺乏对杂交瘤细胞的凋亡诱导作用。
表1氨基酸和葡萄糖缺乏对杂交瘤细胞的凋亡诱导作用
实施例4、抗细胞凋亡化合物的筛选将生长状态良好的表达人重组尿激酶原的CHO工程细胞用含1％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培养基悬浮、调整细胞浓度为1.0×104cells/ml，按200μl/孔接种96孔细胞培养板，每块细胞培养板中同时设置2个只加DMEM培养基的空白对照孔，37℃、5％CO2条件下培养24小时。
用移液器自各培养孔中吸去160μl培养基，按170μl/孔更换含1％(v/v)小牛血清、5.6mM葡萄糖的无谷氨酰胺DMEM培养基。除其中3个设置为实验对照的培养孔外，分别将不同的抗细胞凋亡化合物按2～10μl/孔加入其余培养孔。不同抗细胞凋亡化合物的作用浓度如下2μM、10μM Z-VAD-FMK，2mM、5mM GSH(还原型谷胱甘肽)，1mM、3mM Vc(维生素C)，2mM、10mM NAC(N-乙酰半胱氨酸)，20μM、100μM ATA(金精三羧酸)。每种处理设置3个重复。
37℃、5％CO2条件下培养3天后，先用移液器自各培养孔中吸去100μl培养基，再于各孔中加入100μl YP浓度为5μM、PI浓度为5μg/ml、血清浓度为2％(v/v)的DMEM培养基，37℃作用5～10分钟后，用荧光分光光度计分别读取各样品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP荧光强度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI荧光强度值。
求出相同处理的YP荧光强度平均值，代入实施例2所求得的YP荧光强度值和凋亡CHO工程细胞数的直线相关方程，得到各处理的凋亡CHO工程细胞数；求出相同处理的PI荧光强度平均值，代入实施例2所求得的PI荧光强度值和坏死CHO工程细胞数的直线相关方程，得到各处理的坏死CHO工程细胞数。以各处理的凋亡CHO工程细胞数为主要评价指标，结合各处理的坏死CHO工程细胞数评定不同抗细胞凋亡化合物对抗谷氨酰胺诱导CHO工程细胞凋亡的效果。表2所列为不同抗细胞凋亡化合物对抗谷氨酰胺诱导CHO工程细胞凋亡的效果。
表2不同抗细胞凋亡化合物对抗谷氨酰胺诱导CHO工程细胞凋亡的效果
本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干步骤和/或参数的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
权利要求
1.一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，其特征在于以YO-PRO-1(YP)和碘化丙啶(PI)为细胞凋亡检测的荧光染料，用荧光分光光度计分别测量具有不同稀释度的细胞样品的YP和PI荧光强度，用荧光显微镜判定各具有不同稀释度的细胞样品中的凋亡细胞数和坏死细胞数；对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析，分别得到依据YP荧光强度值和PI荧光强度值求得凋亡细胞数和坏死细胞数的直线相关方程；用荧光分光光度计测量待测样品的YP和PI值，分别代入上述直线相关方程，得到待测样品中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，其特征在于所述动物细胞包括贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞和非贴壁依赖性生长的哺乳动物细胞。
3.根据权利要求2所述的一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞至少包括CHO、Vero、BHK、HEK、C127细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法，其特征在于所述细胞样品为批次培养至第2～5天的待测动物细胞，或为依照下述方法制备的动物细胞在生长状态良好的细胞培养物中加入浓度为800nM的星形孢菌素，37℃、5％CO2条件下作用8～12小时，使部分细胞凋亡和死亡。
5.根据权利要求1至3中任何一项所述的一种定量检测动物细胞凋亡的方法，其特征在于所述凋亡细胞数和坏死细胞数的判定方法是在对细胞样品行荧光强度定量分析的同时，用荧光显微镜查看细胞的荧光着色，显现绿色荧光的细胞判定为凋亡细胞，显现橙色荧光的细胞判定为坏死细胞，分别计数各孔中的凋亡细胞数和坏死细胞数。
6.根据权利要求1至3中任何一项所述的一种定量检测动物细胞凋亡的方法，其特征在于所述对YP荧光强度值与凋亡细胞数作直线回归分析是指以YP荧光强度值为横坐标、荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的凋亡细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的YP荧光强度值与凋亡细胞数的关系。
7.根据权利要求1至3中任何一项所述的一种定量检测动物细胞凋亡的方法，其特征在于所述对YI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析是指以YI荧光强度值为横坐标、荧光显微镜判定的不同稀释度孔中的坏死细胞数为纵坐标，在直角坐标系中确定细胞样品不同稀释度孔的YP荧光强度值与凋亡细胞数的关系。
8.根据权利要求1至3中任何一项所述的定量检测动物细胞凋亡和坏死方法的应用，其特征在于所述方法用于哺乳动物细胞培养中存在于培养基的细胞凋亡诱因的筛查。
9.根据权利要求1至3中任何一项所述的定量检测动物细胞凋亡和坏死方法的应用，其特征在于所述方法用于具有抑制细胞凋亡作用的抗细胞凋亡化合物的筛选。
全文摘要
本发明涉及一种定量检测动物细胞凋亡和坏死的方法及其应用，属于细胞工程技术领域。以YP和PI为检测用荧光染料，测量不同稀释度的细胞样品的YP和PI荧光强度及各细胞样品的凋亡细胞数和坏死细胞数；对YP荧光强度值与凋亡细胞数、PI荧光强度值与坏死细胞数作直线回归分析得到直线相关方程；测量待测样品的YP和PI值，代入直线相关方程，得到待测样品的凋亡细胞数和坏死细胞数。本发明可用于动物细胞培养中细胞凋亡诱因的筛查和抗凋亡化合物的筛选。优点为①同时定量检测细胞凋亡和坏死，②能检测出样品中少至100个的凋亡细胞，灵敏度高、特异性强，③仪器和试剂价格相对便宜、检测成本低，④操作简便、快捷，可在短时间内完成对大批量细胞样品的凋亡检测。
文档编号C12Q1/06GK1779440SQ20041009177
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者陈昭烈, 叶玲玲, 刘红, 吴本传, 刘兴茂, 熊福银, 黄培堂, 李世崇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所