一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒。
背景技术：
：核酸扩增技术通常用于以核酸为基础的检测，如分析物检测，传感，法医和诊断应用，基因组测序，全基因组扩增等。目前，有多种技术可用于扩增核酸，这些技术包括聚合酶链反应(pcr)，连接酶链反应(lcr)，自主序列复制系统(3sr)，基于核酸序列的扩增(nasba)，链置换扩增(sda)，多重置换扩增(mda)和滚环扩增(rca)。就pcr技术来说，核酸扩增的基本原理是在模板dna、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的dna聚合酶的酶促合成反应。pcr以欲扩增的dna做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板dna变性、模板引物复性结合、并在dna聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板dna。这样，目的dna的数量将以指数增长的形式累积，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、southern杂交或dna序列分析进行检测。目前常见的核酸扩增技术可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，可在动物检疫中用于微量样品的检测。但是，在核酸扩增过程也存在着明显的缺点，如，核酸扩增时易受到高背景信号的影响，易出现非特异性扩增带、片状拖带或涂抹带等现象，其原因可能是：样品中污染核酸的扩增、引物二聚体的形成、或引物与靶序列不完全互补、非依赖性引物-引物相互作用等。这些问题的出现妨碍了核酸的分析检测，易导致产生不正确的诊断结果，如诊断出假阳性结果。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒，通过加入含有修饰碱基的引物与天然dna碱基配对结合，这些含有修饰碱基的引物对天然寡核苷酸具有高亲和力，但对其他寡核苷酸，甚至是互补序列的非天然寡核苷酸都几乎没有亲和力。加入含有修饰碱基的引物使其抑制不需要的引物二聚体和嵌合产物等非特异性扩增带的产生，更有效地扩增所需的靶核酸，例如“dna模板”或“核酸模板”。第一方面，本发明提供了一种含有修饰引物的核酸扩增方法，所述含有修饰基引物的核酸扩增方法，包括：(i)提供含有修饰碱基的引物、dntp、含有与所述引物至少部分互补的靶序列的核酸模板、加工该模板的酶和缓冲溶液；其中所述引物包括正向引物和反向引物；(ii)提供适合用于引物、核酸模板、酶进行核酸扩增的条件，使所述核酸模板与引物接触；(iii)进行扩增反应，引物与核酸模板上的互补序列进行配对结合，延伸扩增所述核酸模板。优选的，所述引物的长度为约8至25个核苷酸。优选的，所述修饰碱基的修饰位置选自嘧啶的c-5、嘌呤的c-2处，其中修饰位置的取代基包括甲基、丙炔基、氨基。优选的，所述修饰碱基包括用5-丙炔基-2'-脱氧尿苷替代胸腺嘧啶。优选的，所述引物包含至少一个修饰碱基，其中所述修饰碱基包括:5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷、2-氨基-脱氧腺苷、2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷；其中所述5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷中取代基的并入提高了与模板结合成双链的稳定性和引物的tm值；其中所述2-氨基-脱氧腺苷、2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷中取代基的并入防止引物二聚体的形成。优选的，所述引物包含dickerson–drew十二聚体，序列为【cgcgaattcgcg】2。优选的，所述dntp包括但不限于：datp，dctp，dgtp和dutp。优选的，所述核酸模板的链具有包含正向引物和反向引物结合位点的序列。优选的，所述扩增条件包括在等温下进行扩增。优选的，所述扩增反应包括在100ul体系中进行。优选的，所述扩增反应的程序为：上述程序具体为：50℃预变性5min，98℃变性20秒，62℃退火20s，72℃延伸45s，循环41次，最后72℃下延伸至少10min。优选的，所述扩增反应包括以巢式pcr形式、数字pcr形式、或多重pcr形式进行扩增。优选的，所述扩增反应中正向和反向引物与模板上引物结合位点的互补性高于其他序列与引物结合位点的互补性。优选的，所述扩增反应中包括至少2对正向和反向引物，其中所述引物可用于多重扩增，且不同的引物连接到对应的具有不同解链温度的靶序列，用于与靶核酸模板中不同位置的多个引物结合位点杂交，并形成多个延伸片段。进一步优选的，所述多个引物与核酸模板以不同的浓度接触。第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：如第一方面所述的含有修饰碱基的引物、dntp、含有与所述引物至少部分互补的靶序列的核酸模板、加工该模板的酶和缓冲溶液以及用于检测的荧光基团。优选的，所述试剂盒通过至少一对引物与荧光信号基团、淬灭荧光基团标记的寡核苷酸连接；其中所述寡核苷酸两端被荧光基团和淬灭荧光基团标记，在扩增期间荧光基团与淬灭荧光基团分离，形成一个荧光分子，表明存在核酸模板的扩增产物。优选的，所述试剂盒包括十二聚体，其中所述十二聚体包含2-氨基-脱氧腺苷、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷和2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷，并用于核酸扩增反应。第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的含有修饰引物的核酸扩增方法和第二方面所述的试剂盒，在检测核苷酸插入，缺失，重排，转换，翻译，颠换，多态性和替换等方面的应用。本发明提供了一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒，其有益效果在于：通过加入含有修饰碱基的引物与天然dna碱基配对，提高了修饰碱基与天然dna碱基配对的亲和力和稳定性，抑制了修饰碱基与非天然dna碱基的亲和力。本发明提供的一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒，有效减少了引物二聚体等非特异性扩增带的产生，更有效的扩增所需的靶核酸，能使检测结果更加精准。附图说明图1：是描述了本发明修饰的碱基5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶,未修饰的脱氧胞嘧啶的标准碱基对。图2：是描述了本发明未修饰的标准碱基t、标准碱基t-a碱基对、修饰的碱基5-丙炔基-2'-脱氧尿苷。图3：是描述了本发明修饰碱基2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷(2-氨基-7-脱氮-da)替代碱基da与标准碱基t的碱基配对组合、标准碱基t-a碱基对。图4：pcr扩增反应的凝胶电泳图像。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围，因为在不脱离本发明的精神和范围的基础上，可以对本发明进行许多改变。可以理解的是，本领域技术人员在阅读完本说明书后根据常规需要作出的没有创造性的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。第一方面，本发明所描述的一种含有修饰引物的核酸扩增方法，如图1所示，用修饰碱基5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶替代碱基dc，在经过碱基互补配对，c-5位基团的引入增强了碱基的疏水性质，有助于从双链体中排除水分子，含有5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶的寡脱氧核苷酸引物显着增强了单链dna和rna的双螺旋形成。使用修饰碱基5-丙炔基-2'-脱氧尿苷替代碱基dt，通过修饰c-5基团，引入具有疏水性的丙炔基，有助于将水分子从双链分子中排除，增强了单链dna和rna的双螺旋形成，利于杂交效率的增加。实施例1：材料说明表1显示的扩增反应使用的引物来自结核分枝杆菌16srrna基因的区域，所述引物为正向引物和反向引物，引物是经过修饰或未修饰的；具体的，本发明引物如下，如表1所示。表1pcr引物序列实施例2：核酸扩增实验本发明提供了一种含有修饰引物的核酸扩增方法，包括如下步骤：扩增在100ul体系中进行，将来自于结核分枝杆菌的dna作为模板dna，使用表1中的引物，所述引物包括正向引物和反向引物，在反应物中扩增，所述反应物由50mmtris-hcl(ph8.9)、50mmkcl、100μdatp、100μmdctp、100μmdgtp、100μmdutp、表1中每种引物250nm、5单位聚合酶、10％甘油；使用lightcycler480仪器完成扩增和分析，使用以下条件设置pcr仪器程序，进行扩增：pcr反应设定程序：上述程序具体为：50℃预变性5min，98℃变性20秒，62℃退火20s，72℃延伸45s，循环41次，最后72℃下延伸至少10min。在appliedbiosystemsdna9600型热循环仪中设置72℃恒温10min以上，待反应结束后，取少量样品通过0.5％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，然后进行溴化乙锭染色。经typhoon成像仪扫描显现，图像如图4所示。如图4所示，所述编号1-8对应表1的引物编号，目的片段参见泳道1-8；m是marker。其中2-氨基-脱氧腺苷、2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷的并入提高了引物的静电作用，防止引物二聚体的形成；其中使用2-氨基-7-脱氮-2'-脱氧腺苷作为修饰碱基的泳道出现的非特异性扩增条带显著较少，显色明亮，更有效的抑制了引物二聚体等非特异性扩增带的形成。实施例3：tm值的测定将碱基5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶替代碱基dc，碱基5-丙炔基-2'-脱氧尿苷替代碱基dt，对未修饰的引物进行碱基修饰，得到含修饰碱基5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷的引物；形成的引物如下表2所示。具体的，引物来自结核分枝杆菌16srrna基因的区域，引物是经过修饰或未修饰的。表2含未修饰、c-5修饰和c-2修饰碱基的引物引物序列碱基5'-atgttcactacgcgaatatgc-3'-5'-atgttcactacgcgaatxtgc-3'x＝2-氨基-脱氧腺苷5'-atgttcactacgcgaatatgy-3'y＝5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶5'-atgttcactacgygaatatgy-3'y＝5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶5'-atgtzcaczacgcgaatazgc-3'z＝5-丙炔基-2'-脱氧尿苷引物加热溶解在lightcycler480仪器中进行，将表2中所示的互补引物对以0.25mm或2.5mm，在含有10mmtris-hcl(ph8.3)、50mmkcl、100mmttp、2mmmgcl2和10nmsytovr13染料的缓冲溶液中混合；设置25分钟内温度从40℃升至90℃，并连续监测荧光(激发465nm，发射510nm)。测得因链分离导致产生的荧光减少特征性熔解曲线，并且从荧光曲线的一阶导数获得tm值，各引物对应的tm值如表3所示。与未修饰的引物相比，含有不同修饰碱基的引物的tm值变化情况如表3所示。由表3可看出2-氨基-脱氧腺苷、5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷中取代基的并入增强了引物的疏水作用、提高了与模板结合成双链的稳定性和引物的tm。表3修饰碱基及对应的tm值当前第1页12