一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基及其制备方法与流程

本发明涉及一种培养基，具体涉及一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基及其制备方法。

背景技术：

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物营养类型、实验和研究目的不同，所以培养基的种类、原料也各有差异，但培养基中一般必须含有微生物所必需的碳源(c源)、氮源(n源)、无机盐、生长素及水分等，常规的微生物培养基配制多选用混合c源，例如多种糖类混合蔗糖、乳糖等或结构最简单的、最易被利用的葡萄糖，n源主要选择蛋白胨、酵母膏等蛋白类n源，辅助添加少量无机盐及微生物必须的金属离子等。例如能快速简便的检测或分离海洋细菌，申请号为cn101735968a的专利，它公开了一种海洋细菌显色分离培养基及其应用，该培养基选择的是混合c源乳糖与蔗糖、混合n源蛋白胨、酵母膏，培养基配方如下：蛋白胨2～3g/l，酵母膏0.1～1g/l，乳糖8～20g/l，蔗糖8～20g/l，纤维二塘8～20g/l，硫代硫酸钠0.1～1g/l，柠檬酸铁铵0.1～1g/l，3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐0.01～0.1g/l和琼脂10～20g/l；另外申请号为cn02110818.8的专利选用了结构最简单的葡萄糖做为c源，n源为蛋白胨，将吩嗪-1-羧酸添加到培养基，抑制植物、农作物等生物危害。上述培养基属于富营养培养基，培养过程中由于竞争抑制，优势微生物迅速生长抑制少数微生物的生长，不利于微生物多样性培养和分离。

泡菜的发酵是一种复杂的持续变化的发酵系统，内部微生物区系不断变化，随着免培养技术不断进步，人们对泡菜中微生物区系认识不断深入。近些年人们将测序技术应用到泡菜微生物检测中，2015年佟停停等人基于高通量测序技术分析四川泡菜微生物多样性，测序结果表明四川老坛水中微生物主要为乳杆菌属lactobacillus、魏斯氏菌属weissella、乳球菌属lactococcus、片球菌属pediococcus、明串珠菌属leuconostoc、假单胞菌属pseudomonas、肠杆菌属enterobacteriaceae、以及肠杆菌科未分类菌属等；2016年裴乐乐等通过构建16srrna基因文库及ardra分型分析，对榨菜、萝卜、豇豆和青菜4种不同原料泡菜样品微生物dna提取鉴定，测序结果表明泡菜中含有大量的微生物类群，分布于28个属,样品中主要优势菌属为乳杆菌属lactobacillus、盐单胞菌属halomonas、unclassifiedrhodobacteracea、色盐杆菌属chromovvhalobacter、海杆菌属marinobacter和沙门杆菌属salegentibacter等；2017年李欣蔚等利用细菌16srrna的v3-v4区测序技术分析东北自然发酵酸菜细菌多样性，结果表明多数酸菜中优势菌种为乳杆菌属lactobacillus、明串珠菌属leuconostoc、假单胞菌属pseudomonas等，此外还有大量未定义菌属。免培养结果表明泡菜中含有复杂的微生物区系，微生物种类丰富，是可开发的丰富的食品级微生物资源宝库。现今泡菜中可培养微生物寥寥无几，已培养鉴定的微生物主要属于泡菜的优势菌属乳酸菌属以及少量杆菌属，种类较少，因此如何获得更多种类的非常见泡菜微生物资源是亟待解决的重要问题。

泡菜中可培养微生物类群之所以较少，主要取决于培养基的选择。现今对于分离泡菜微生物的培养基报道较少，以往研究人员在培养分离泡菜微生物时大多选择r2a、lb、mrs、mc、sl、elliker等培养基，其中r2a、lb培养基采用营养丰富的c源、n源混合有机物，这些培养基中优势微生物会快速生长，抑制其他微生物生长，从而忽略一些具有重要功能的微生物；而mrs、mc、sl、elliker培养基是乳酸菌专用培养基，配制时同样选择的是混合c源、n源，适用于乳酸菌生长；以上培养基微生物分离培养结果集中在乳杆菌属如植物乳杆菌lactobacillusplantarum、类植物乳杆菌lactobacillusparaplantarum、消化乳杆菌lactobacillusalimentarius、戊糖乳杆菌lactobacilluspentosu、短乳杆菌lactobacillusbrevi、干酪乳杆菌lactobacilluscasei、清酒乳杆菌lactobacillussakei、棒状乳杆菌lactobacilluscoryniformis、布氏乳杆菌lactobacillusbuchneri、副短乳杆菌lactobacillusparabrevis；少量片球菌属如微小片球菌pediococcusparvulus、戊糖片球菌pediococcuspentosaceus；少量明串珠菌属如leuconostocmesenteroides；少量芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌bacillussubtilis、巨大芽孢杆菌bacillusmegaterium、地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis；少量魏斯氏菌属如leuconostocmesenteroides等四种菌属中，相较于免培养技术鉴定获得的菌属，仍有大量未能被培养的微生物资源有待于被开发，因此如何设计培养基来获得泡菜中更多种类微生物资源成为解决泡菜微生物培养的关键。

在微生物代谢过程中，有机酸例如草酸、乙酸、乳酸等由于电位较低，易成为电子供体，这些有机酸在微生物培养过程中可以作为培养基c源供微生物生长利用；铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐由于电位较高，在微生物生长过程中可以作为电子受体，经微生物代谢转化为气态n素释放，是微生物可利用的n源。酸菜发酵过程是有机酸与硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐的动态变化过程。有文献指出酸菜中含有酒石酸、乳酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和丙酸等，发酵过程中酒石酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸和丙酸含量呈下降趋势，乳酸和苹果酸含量则呈现不规则的波浪形变化。而酸菜发酵过程中亚硝酸盐含量普遍呈先上升后下降趋势。相关研究均表明酸菜不同发酵时期，有机酸种类、n素种类不同，发酵系统中微生物可利用的c源、n源种类不同，造成微生物种类不同，因此在设计酸菜微生物培养基时应将发酵系统中不同时期的有机酸、n素盐作为配制依据来设计培养基从而分离更多的酸菜中非常见微生物类群。

基于以上利用对酸菜发酵液中不同有机酸、n类化合物的检测方法，确定发酵过程中微生物代谢最可能利用的c源、n源，以此作为培养基c源、n源筛选能在酸菜发酵液中生长代谢的微生物，完成酸菜微生物分离培养基的配制，实现酸菜发酵过程中非常见乳酸菌微生物的分离是非常必要的。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明公开了一种培养酸菜中微生物分离培养基的配方与选择依据，通过高通量测序结果表明酸菜发酵第五天时，微生物种类丰富度最高，是酸菜中微生物分离的良好的样本。利用不同检测手段测定第五天发酵液种不同有机酸、n类化合物的检测来确定发酵过程中微生物代谢最可能利用的c源、n源，以此作为培养基c源、n源选择依据配制培养基筛选能在酸菜发酵液中进行代谢生长的微生物。

为了实现以上目的，采用的具体技术方案如下：

一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基，其设计与组成如下:

每1l所述培养基中含有硫酸镁0.1～0.5g,磷酸氢二钾0.5～1.0g，苹果酸钠0.3～0.9g，草酸钠0.1～0.9g，富马酸钠0.1～0.7g，硝酸钠0.1～0.5g，亚硝酸钠0.1～0.5g，琼脂用量为15～20g，ph范围为6.8～7。

优选的，每1l所述培养基中含有硫酸镁0.3g，磷酸氢二钾0.7g，苹果酸钠0.4g，草酸钠0.3g，富马酸钠0.2g，硝酸钠0.3g，亚硝酸钠0.2g，琼脂用量为15g，ph范围为6.8-7。

一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基的制备方法：

(1)发酵液样本的制备：将白菜置于发酵罐中在一定温度条件下进行密封发酵，然后在发酵液的上、中、下三层位置处分别取发酵液混合均匀，经离心处理后，取上清液，稀释浓度至符合高效液相色谱与离子色谱仪器检测的要求，再经滤膜进行过滤，得到泡菜发酵液样本；

(2)培养基c源的确定：选择步骤(1)的酸菜发酵液样本，采用高效液相色谱测定方法，测定发酵液中的有机酸种类；在所检出的有机酸中选择几种有机酸对应的钠盐作为培养基c源；

(3)培养基n源的确定：选择步骤(1)的酸菜发酵液样本，采用离子色谱方法与靛酚蓝比色法，检测发酵液中的n素类型，从而确定培养基中的n源；

(4)培养基的配制：按照培养基的组分，将步骤(2)确定的c源和步骤(3)确定的n源，以及硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂溶于超纯水中，灭菌后得到初步培养基；然后用无菌超纯水配制亚硝酸钠水溶液，经滤膜过滤得到滤液；将滤液加入冷却至一定温度的初步培养基，混合均匀后得到微生物分离的培养基。

优选的，步骤(1)中所述一定温度为5～10℃；所述密封发酵的时间为5天；所述滤膜的孔径为0.22μm。

优选的，步骤(2)中所述高效液相色谱的色谱柱为pursuit5c18(5μm，4.6mm×250mm)，流动相为0.01m/l磷酸氢二铵与纯甲醇的混合液，流速为0.6～0.8ml/min，柱温30℃，酸菜发酵液样本过膜孔径为0.22μm；

优选的，步骤(2)中所述磷酸氢二铵与纯甲醇的体积比为9:1。

优选的，步骤(2)中所述测定发酵液中的有机酸种类包括苹果酸、柠檬酸、草酸和富马酸-琥珀酸、丙酸、酒石酸和乳酸；所述培养基c源为苹果酸钠、草酸钠和富马酸钠。

优选的，步骤(3)中所述离子色谱的色谱柱为metrosepasupp4(9μm，4.0mm×250mm)，流动相为5％硫酸、1.7mmol/l碳酸氢钠与1.8mmol/l碳酸钠混合溶液、超纯水，流速1ml/min；所述靛酚蓝比色法使用的检测波长为630nm；所述培养基n源为硝酸钠和亚硝酸钠。

优选的，所述灭菌的条件为121℃，20min；所述亚硝酸钠水溶液的浓度为5m/l；所述滤膜为无菌滤膜，孔径为0.22μm。

优选的，所述滤液与初步培养基的体积比为0.2～1:1000；所述冷却至一定温度为40～50℃。

本发明的有益效果，具体如下：

(1)本发明对于酸菜等泡菜发酵过程中微生物的筛选，提供了一种新的筛选功能微生物的培养基。

(2)本发明制备的培养基配置方法简便快捷，依据酸菜实际发酵环境选择培养基c源、n源配制，对发酵液中微生物的c源、n源代谢功能有一定的指示说明作用，能够分离泡菜发酵过程中相关代谢的非常见微生物，对研究发酵食品中微生物尤其泡菜等发酵食品中微生物资源的挖掘与应用具有重要的研究意义。

(3)对酸菜等发酵制品发酵过程中相关功能微生物的生理生化性质，具有一定的指示说明作用，同时为其他种类泡菜中微生物的分离培养提供了一种新的培养基设计思路。

附图说明

图1为本发明第五天的酸菜发酵液经高效液相色谱仪测定的有机酸种类与含量。

图2为本发明测定第五天的酸菜发酵液中的硝酸根、亚硝酸根、铵根的n素含量。

图3为本发明实施例中培养基a培养分离菌种的聚类树。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。本发明对不同种类的泡菜发酵微生物具有通用性。本实施案例所参考的为东北酸菜发酵，其它种类的发酵可参考此实例进行。

本实施案例利用酸菜发酵液中c源、n源种类作为培养基配制原则配制培养基培养分离酸菜发酵系统中微生物。通过对酸菜发酵第五天发酵液不同有机酸、n类化合物的检测来确定酸菜发酵过程中微生物代谢最可能利用的c源、n源，基于此配制培养基来筛选能在酸菜发酵液中利用不同c源、n源进行代谢生长的微生物。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：

一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基包括如下步骤：

(1)东北酸菜发酵液样本的制备：先采用传统东北酸菜腌制方法，在5-10℃的温度环境下发酵5天；取第5天腌制酸菜发酵液，在各发酵液的上、中、下三层位置处，分别取5ml发酵液混合均匀；经低温离心处理后，取其上清液，超纯水稀释20倍，经0.22μm的滤膜过滤后得到泡菜发酵液样本；

(2)微生物培养基c源的确定：对于泡菜发酵液样本，采用高效液相色谱测定方法，采用色谱柱型号为pursuit5c18(5μm，4.6mm×250mm)，测定流动相为0.01m/l磷酸氢二铵与纯甲醇(9：1)，流速为0.6-0.8ml/min，柱温30℃；依据测定结果中不同波峰处的位置，得到第5天发酵液内有机酸以苹果酸27.79mg/ml为主，还含有少量的草酸2.81mg/ml与富马酸1.81mg/ml；在此选用泡菜发酵至第5天样本为例设计培养基，此时系统中苹果酸、草酸、富马酸是微生物最有可能利用的c源，所以培养基配制时选取了这3种有机酸对应的钠盐作为培养基的c源；

(3)微生物培养基n源的确定：对泡菜发酵液样本，利用离子色谱仪测定，色谱柱为metrosepasupp4(9μm，4.0mm×250mm),流动相为5％硫酸、1.7mmol/l碳酸氢钠与1.8mmol/l碳酸钠混合溶液和超纯水，流速1ml/min。铵根离子测定采用靛酚蓝比色法，测定波长为630nm。测定结果发现第5天时泡菜发酵液中，含量较高的硝酸盐和亚硝酸盐是泡菜发酵系统中微生物生长最可能利用的n源，所以培养基配制时选取了硝酸钠与亚硝酸钠作为培养基的n源；

(4)培养基配制：

a.称取硫酸镁0.3g，磷酸氢二钾0.7g，苹果酸钠0.4g，草酸钠0.3g，富马酸钠0.2g，硝酸钠0.3g，琼脂15g，用超纯水定容至1l，混匀后调节ph至7，在121℃下杀菌15min，用无菌超纯水配制成浓度为5m/l的亚硝酸钠水溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤，待灭菌的培养基冷却至45℃后再加入过滤后的亚硝酸钠水溶液，亚硝酸钠水溶液用量为600μl，混合均匀后倾倒平板，记为培养基a；

b.称取硫酸镁0.1g，磷酸氢二钾0.5g，苹果酸钠0.3g，草酸钠0.1g，富马酸钠0.1g，硝酸钠0.1g，亚硝酸钠0.1g，琼脂15g，用超纯水定容至1l，混匀后调节ph至6.8，在121℃下杀菌15min，用无菌超纯水配制成浓度为5m/l的亚硝酸钠水溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤，待灭菌的培养基冷却至40℃后再加入过滤后的亚硝酸钠水溶液，亚硝酸钠水溶液用量为200μl，混合均匀后倾倒平板，记为培养基b；

c.称取硫酸镁0.5g,磷酸氢二钾1g，苹果酸钠0.9g，草酸钠0.9g，富马酸钠0.7g，硝酸钠0.5g，亚硝酸钠0.5g，琼脂20g，用超纯水定容至1l，混匀后调节ph至7，在121℃下杀菌15min，用无菌超纯水配制成浓度为5m/l的亚硝酸钠水溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤，待灭菌的培养基冷却50℃后再加入过滤后的亚硝酸钠水溶液，亚硝酸钠水溶液用量为1ml，混合均匀后倾倒平板，记为培养基c；

涂布培养：选取泡菜腌制第五天的发酵液对培养基a、培养基b和培养基c，进行涂布，37℃培养；待培5天后，将平板上生长的的菌体进行纯化富集培养，挑单菌落在r2a平板纯化后，将单菌落转接r2a液体培养基富集。

培养基a分离出64个单菌落，培养基b分离出34个单菌落，培养基c分离出51个单菌落；

pcr鉴定及测序：对相应菌种做16s基因序列pcr扩增，鉴定引物为细菌27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)与1541r(5′-aaggaggtgatccagccgca-3′)，试剂均产自takara试剂公司，pcr扩增体系为：buffer2.5μl、mg²⁺(25mmol/l)2μl、dntp2μl、primerf(515f)0.5μl、primerr(806r)0.5μl、bsa(5mg/ml)2.5μl、taq酶0.1μl、dna模板1μl、加ddh2o至25μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。pcr产物送至上海生工测序鉴定。测序结果利用sepman软件拼接，mega7构建系统发育树。

图1为经高效液相色谱仪测定的发酵第五天发酵液有机酸种类与含量；经高效液相检测有机酸以苹果酸27.79mg/ml为主，还含有少量的草酸2.81mg/ml与富马酸1.81mg/ml。

图2为测定的发酵液第五天硝酸根、亚硝酸根与铵根含量，铵根含量较低，在泡菜发酵过程中波动较少。

图3为利用培养基a培养分离获得菌种与传统培养基分离菌株的聚类树。

本实施例中培养基a配方1分离最多种类微生物，分离菌株经鉴定分属于乳杆菌科、片球菌科、肠杆菌科、肠球菌科、明串珠菌科、克雷白氏杆菌科、芽孢杆菌科还有一些其他菌科未说明(因画图软件没有归类、测序结果无法拼接以及无序列比对的新菌种，所以有些菌种聚类时没有聚类到具体科目)；

培养基b配方1分离菌株经鉴定分属于肠杆菌科、明串珠菌科、克雷白氏杆菌科，还有一些其他菌科未说明，

培养基c配方分离菌株经鉴定分属于乳杆菌科、片球菌科、肠杆菌科、明串珠菌科、克雷白氏杆菌科、芽孢杆菌科还有一些其他菌科未说明；

相较于传统培养基仅有的乳杆、明串珠菌科少数菌科，不仅丰富传统培养基可培养的菌株资源，为食品级微生物资源的开发提供了指导，还对菌株鉴定与泡菜发酵过程中菌株功能也有一定的指示说明作用。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。