分离提取脐血血浆的方法与流程

本发明属于医药生物技术领域，涉及分离提取脐血血浆的方法，本发明所制得的脐血血浆可以广泛的应用于细胞培养、医疗、美容等行业，例如用于神经发育及神经损伤修复、伤口修复，以及例如用于造血祖细胞、人脐静脉内皮细胞、cik细胞、cd3ak细胞、cd34+细胞、白血病hl-60细胞等的细胞培养。

背景技术：

脐血血浆是脐血干细胞分离之后获得的副产物，含大量生长因子，分离纯化后可广泛的应用于医疗、美容、细胞培养等行业。例如，随着社会生活水平的不断提高，人们对自身美的追求也不断提高，尤其是日常生活护肤美容愈加重视；而市场上所出售的护肤品不具有生物活性，不能从根本上改善表皮细胞的生存环境和新陈代谢，对于外界因素造成的皮肤损害没有修复作用，尤其不适宜皮肤敏感或孕妇使用，再者，其中多含有乙醇、着色剂、铅汞等对人体皮肤有害的物质。脐血血浆的治疗应用亦有诸多报道。例如，杨云华(杨云华，儿童急性白血病化疗后输注脐血血浆的临床研究，南华大学学报(医学版)，2003年02期)文献中探讨了脐血血浆在儿童白血病的临床应用价值，具体方法是，选择健康妊娠孕妇、足月顺产儿的脐血，每个胎盘提取50ml左右血浆，在白血病患儿化疗后输注血浆2次，观察患儿外周血wbc、hb、plt及骨髓造血功能的恢复情况，同时动态观察患儿afp含量变化，结果显示，输注脐血血浆的患儿外周血wbc恢复、骨髓增生活跃均提前，p<0.05，差异有显著性。hb、plt亦提前恢复，同时afp含量仅呈暂时性升高，一个半月后恢复正常，可见，脐血血浆能促进儿童急性白血病病儿化疗后骨髓造血功能的恢复，由于资源广泛，价格低，具有推广价值。

陈活强(陈活强，等，脐血血浆输注对急性白血病患者化疗后血象恢复的影响，广州医药，2011年03期)研究了脐血血浆对急性白血病患者化疗后促进血象恢复的影响，具体方法是，设脐血血浆治疗组和对照组，治疗组患者化疗后第2天及第4天各输注同型脐血血浆300ml，对照组仅采用一般的对症支持治疗。观察两组病例化疗后血象和骨髓象的恢复情况以及患者身体状况的变化，包括精神、食欲、感染及出血等情况。结果治疗组外周血白细胞恢复较快，平均为(12.53±4.34)天，对照组平均为(19.42±5.45)天，两组比较差异有统计学意义(p<0.05)；治疗组骨髓恢复至增生活跃需(11.54±5.38)天，对照组骨髓恢复至增生活跃需(18.89±5.74)天，两组比较差异有统计学意义(p<0.05)；且无1例出现输血反应及其它不良现象。这表明，急性白血病患者化疗后输注脐血血浆具有刺激骨髓生长和促进外周血白细胞恢复的功能，脐血血浆具有很好的开发利用价值。

柴晔(柴晔，等，环孢霉素a联合脐血血浆治疗重型再生障碍性贫血的探讨，临床血液学杂志，2001年03期)探讨了提高重型再生障碍性贫血(saa)疗效的方法，具体地说，采用环孢霉素a(csa)联合脐血血浆(cbp)治疗saa13例，并与csa加细胞因子治疗组进行疗效比较，结果显示，csa联合cbp治疗saa总有效率为69.2％，与csa加细胞因子治疗组疗效(60.0％)相近(p>0.05)，这表明，csa联合cbp是安全、方便的治疗saa的有效方案。

陈丽敏(陈丽敏，等，脐血及血浆输注治疗肝炎：分组对照1年随访，中国组织工程研究，2010，14(10)：1874-1877)文献中记载，研究资料证明脐血干细胞移植能改善患者肝功能和免疫功能，修复肝损伤，促进肝细胞再生，但具体分化机制及生物学特性尚不明了，远期治疗前景有待分析。该文献的目的在于对照分析脐血输注与血浆输注对慢性乙型重型肝炎患者的远期治疗效果。具体方法是，将2003-01/2004-01中南大学湘雅二医院住院的慢性重型肝炎患者50例，随机分为治疗组、对照组，25例/组，两组患者均接受护肝、对症、支持等综合治疗，在年龄、病情、用药等方面无明显差异，具有可比性。脐血来源于产前检查hbsag、抗hcv、抗hiv、kt阴性，无血液病的健康足月顺产产妇，应用一次性采血袋，以封闭式采血法采血。脐血离心后，保留有核细胞及脐血浆，24h内使用。治疗组输注脐血干细胞悬液，200ml/次，每周一两次，每例患者输注4～8次，平均5次；对照组输注成人新鲜血浆。检测两组患者治疗前后血象和肝功能各项指标的变化。结果与结论显示：两组患者全部完成1年随访。治疗前两组患者肝功能和血象各项指标均基本相似(p>0.05)。脐血治疗1年后，两组患者血象各项指标无明显差异(p>0.05)，但治疗组谷丙转氨酶、总胆红素明显低于对照组(p<0.05)，血清白蛋白明显高于对照组(p<0.05)。与治疗前比较，脐血治疗1年后治疗组血小板无明显变化，谷丙转氨酶、总胆红素均明显下降(p<0.05)，血清白蛋白明显升高(p<0.05)；对照组血小板明显下降(p<0.05)，血清白蛋白明显下降(p<0.05)。提示脐血输注可改善重型肝炎患者的肝功能和血象，可作为其辅助治疗措施。

然而，由于脐血的来源有限，制约了脐血血浆的利用，以高的制备效率获取脐血血浆仍是本领域技术人员迫切期待的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以高的效率制备脐血血浆的方法，已经出人意料的发现，本发明制备脐血血浆的方法呈现至少一个方面的优异效果，本发明基于此/此类发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了分离脐血血浆的方法，其包括如下步骤：

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：0.8～1.2体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入0.6～1.2倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，1500～2500rpm离心10～20min，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-50℃以下例如置于-80℃冷冻保存，分离得到脐血血浆；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中提供于产前当天采集的产妇3～8ml例如5ml外周血用于病毒检测。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中所述病毒包括但不限于hiv、hcv、htlv。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，将脐血样本与生理盐水以1：1体积比稀释，充分混匀。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，加入0.8～1.0倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，2000rpm离心15min离心。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，以加速度1、减速度0离心。

根据本发明第一方面的方法，其中所述ficoll分离液是用聚蔗糖和泛影葡胺配制的混合物。

根据本发明第一方面的方法，其中所述ficoll分离液的比重为1.077±0.005。ficoll分离液是众所周知的并且可以容易地从市场上购得。

根据本发明第一方面的方法，其中所述ficoll分离液中还额外添加重量/体积百分比为0.02～0.03％的乳果糖，例如其添加量为0.025％(w/v)。

如上文所述，ficoll分离液的比重为1.077±0.005，而血浆的比重约为1.035～1.040之间，单个核细胞层比重约为1.076～1.090之间，红细胞层的比重约为1.090～1.095之间，经离心分离后自上而下形成血浆层、单核细胞层、分离液层和红细胞层。本发明已经出人意料的发现，在常规的ficoll分离液中添加微量的乳果糖，不但有助于使离心后的血浆层与单核细胞层之间的界面更清晰，而且能够使单核细胞层与分离液层之间的界面更清晰，并且这些乳果糖基本上完全汇集到分离液层中而不会进入其它各层中。这种清晰的界面对于提高脐血血浆的分离提取效率是非常有意义的。此外还发现，通过添加乳果糖有助于提高脐血血浆的提取率。

进一步的，本发明第二方面提供了一种脐血血浆，其是照包括如下步骤的方法分离得到的：

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：0.8～1.2体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入0.6～1.2倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，1500～2500rpm离心10～20min，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-50℃以下例如置于-80℃冷冻保存，分离得到脐血血浆；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(1)中提供于产前当天采集的产妇3～8ml例如5ml外周血用于病毒检测。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(2)中所述病毒包括但不限于hiv、hcv、htlv。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(3)中，将脐血样本与生理盐水以1：1体积比稀释，充分混匀。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(4)中，加入0.8～1.0倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(4)中，2000rpm离心15min离心。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中步骤(4)中，以加速度1、减速度0离心。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中所述ficoll分离液是用聚蔗糖和泛影葡胺配制的混合物。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中所述ficoll分离液的比重为1.077±0.005。ficoll分离液是众所周知的并且可以容易地从市场上购得。

根据本发明第二方面的脐血血浆，其中所述ficoll分离液中还额外添加重量/体积百分比为0.02～0.03％的乳果糖，例如其添加量为0.025％(w/v)。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

脐血血浆是脐血干细胞分离之后获得的副产物，含大量生长因子，分离纯化后可广泛的应用于医疗(如修复伤口)、美容等行业。

1974年kundtzon等首先发现人类脐血中粒-单系祖细胞集落形成单位(cfu-gm)产率远较成人外周血高，接着，一些学者证明脐血中造血细胞之质量和数量可与骨髓媲美。在这些实验研究的基础上，20世纪80年代末提出了用脐血代替骨髓作造血干细胞移植的设想，并立题进行了临床研究，在1989年broxmeyer与gluckman等进行了世界上首例脐血移植术，成功地治愈了1例fanconli's贫血的患儿。自此之后，脐血的临床应用研究进入了新的高科技研究阶段。

20世纪90年代以来，一些学者对脐血血浆中造血生长因子进行了研究，发现脐血血浆中含有丰富的造血生长因子，如粒细胞集落刺激因子(gcsf)、粒单细胞集落刺激因子(gm-csf)、单核细胞集落刺激因子(m-csf)、红细胞生成素(epo)、白细胞介素1(il-1)、il-3和il-6等，并具有刺激造血的功能。

脐血血浆中富含造血生长因子。1990年laver等[laverj，duncane，abboudm，etal.highlevelsofgranulocyteandgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactorsiscordbloodofnormalfull-termneonates.jpediatr，1990，116：627-632.]对34例正常足月胎儿的脐血和11例正常成人外周血进行检测，脐血csf水平检测结果(×1000u/l，x±s)中，g-csf、g-csf+单抗、gm-csf、gm-csf+单抗分别为：40.8±2.8、11.8±1.5、19.9±5.2、2.1±0.2；正常成人外周血csf水平检测结果(×1000u/l，x±s)中，g-csf、g-csf+单抗、gm-csf、gm-csf+单抗分别为：2.5±1.5、未测出、未测出、未测出。

可以看出，脐血血浆中g-csf和gm-csf水平明显高于正常成人外周血。1991年roth等[rothp，renardm，daffosf，etal.colony-stimulatingfactor1levelsinthehumannewborninfant.jpediatr，1991：113-119]测定脐血中m-csf的含量为正常成人外周血的3倍，前者为(13.8±0.32)μg/l，后者为(4.5±0.1)μg/l。1998年王秀华等[王秀华，张学忠，时宏珍，等.脐血血浆中epo、g-csf、il-2、il-6含量的测定及意义.中华血液学杂志，1999，20：600-601]利用放免法和酶联免疫吸附1(elisa)法定量测定了20份脐血标本，结果发现脐血血浆中含有较高水平的g-csf、epo，也含有略高水平的il-2、il-6，具体地说，脐血的g-csf/ng/l、epo/u/l、il-2/μg/l、il-6/ng/l分别为(x±s)：338±281、32.66±21.65、14.96±3.86、14.17±9.44，正常成人外周血g-csf/ng/l、epo/u/l、il-2/μg/l、il-6/ng/l分别为(x±s)：41±27、12.87±3.65、10.71±4.19、8.63±1.15。

另外，已有一些学者报道脐血血浆中含有一定量的il-1、il-3、igfs等[biesckerlg，emersonsg.interlenkin-6isacomponentofhumanumbilicalcordserumandstimulateshematopoiesisinembryonicstemcellsinvitro.exphematol，1993，21：774-781；sandersm，brownrd，tanakam，etal.insulin-likegrowthfactorstimulateerythropoiesisinserum-substitutedumbilicalcordbloodcultures.exphematol，1993，21：25-32.]。尚有一些学者根据脐血血浆能够促进脐血和骨髓中造血干细胞自我更新和增殖的能力，而目前所认知的细胞因子，如slf、il-1、il-3、g-csf、gm-csf、m-csf等单独或联合使用均不能替代脐血血浆，推测脐血血浆中可能含有一种或几种尚未认知的造血因子[bertolinif，lazzaril，laurieetal.cordbloodplamamediatedexvivoexpansionofhematopoieticprogenitorcells.bonemarrowtransplantation，1994，14：347-354]。

脐血血浆具有刺激造血的功能。现已证实，人脐血中含较丰富的造血细胞，且造血细胞比骨髓中更原始，那么脐血血浆是否具有维持和促进脐血中造血细胞自我更新和增殖的能力呢？1994年ruggieri等[ruggieril，heimfelds，broxmeyerhe.cytokine-dependentexvivoexpansionofearlysubsetsofcd34+cordbloodmyeloidprogenitorsisenhancedbycordbloodplasma，butexpansionofthemerematuresubsetsofprogenitorsisravored.bloodcells，1994，20：436-454]使用无基质体外培养扩增cd34+脐血细胞，发现当使用脐血血浆+steel因子+pixy321时，cd34+脐血细胞扩增总数高达7倍，而使用成人外周血浆加同样细胞因子情况下只扩增3倍，在比较cfu-gemm产率上，当使用脐血血浆+steel因子+pixy321时，产率增加11.4倍，而外周血浆在同样条件下只增加6.8倍，结果表明：脐血血浆能够增强脐血中cfugemm的自我更新能力，而成人外周血浆无此能力。随后，carow等[carowce，hamgocg，broxmeyerhe，etal.humanmultipotentialprogenitorcells(cfu-gemm)haveextensivereplantingcapacityforsecondarycfu-gemm：aneffectenhancedbycordbloodplasma.blood，1993，81：942-949]发现脐血血浆也能够增强骨髓中造血干/祖细胞的自我更新和增殖的能力，而成人外周血浆联合使用il-1、il-3、il-6、il-11、g-csf、gm-csf等均不能替代脐血血浆，这两项研究证实了脐血血浆具有刺激造血的功能。

1996年张林生等[张林生，王逸兰，陆道培，等.脐血血浆支持骨髓造血祖细胞体外集落培养的研究.实验血液学杂志，1996，4：87-90]利用脐血血浆对骨髓中造血干/祖细胞进行体外集落培养，发现脐血血浆能促进cfu-gm、bfu-e、cfu-gem、cfu-meg及cfugemm的生长，而正常成人外周血血浆则无此作用，伍纲等[伍纲，应大明，林梓，等.脐血血浆体外对造血祖细胞增殖的影响.中华血液学杂志，1997，18：237-239]提出在进行造血干细胞移植的同时最好能输注脐血血浆。1997年张学忠等[张学忠，陈玉心，汪承亚，等.脐血血浆与rhgm-csf对正常骨髓细胞影响的比较研究.中国输血杂志，1998，11：5-7]采用骨髓细胞液体培养法和集落培养法，比较研究脐血血浆和rhgm-csf对正常骨髓细胞生长的影响，发现脐血血浆在维持和促进正常骨髓细胞生长方面与一定量的rhgm-csf相当。

脐血血浆的临床应用情况。脐血血浆除具有一般正常成人外周血血浆的功能外，尚具有自身的特点，即①特异性刺激作用：因脐血血浆中含有较高水平的g-csf、epo，故输注后可刺激造血，可用来治疗各种贫血和粒细胞减少症。②非特异性刺激作用：一般可见到精神好转、食欲增加等。近年来，张学忠等[张学忠，陈玉心，王秀华，等.脐血血浆增强阿糖胞苷抗白血病效应的实验研究.中华血液学杂志，1999，20：229-231]研究发现脐血血浆能够增强阿糖胞苷对耐药急性髓性系白血病(aml)细胞的敏感性，其机制可能是脐血血浆促进耐药aml细胞进入增殖周期，从而增强阿糖胞苷对耐药aml细胞的敏感性，预示着脐血血浆与阿糖胞苷联合运用治疗耐药aml的潜在价值。脐血血浆输注与脐血全血输注相比，有如下优点：①因脐血红细胞绝大部分为胎儿型血红蛋白(hbf)，在成人体内其寿命较短[沈柏均.人类脐血基础·临床.天津：天津科学技术出版社，1995，137-138]。②因脐血血浆中无红细胞、白细胞等有形成份，输注后几乎不发生输血反应。

脐血血浆的临床应用方法方面，国内已有一些医院开展了脐血血浆临床输注的工作，并取得了一定的经验[王秀华，张学忠，陈明伦，等.恶性血液病患者化疗后输注脐血血浆的研究.江苏医药，2000，26：799-800；张学忠，王秀华，徐燕丽，等.脐血血浆输注对急性白血病患者化疗后血象恢复的影响.白血病，2000，9：283-284；张学忠，王秀华，孟钵，等.急性白血病患者化疗后输注脐血血浆的临床研究.中华内科杂志，2000，39：759-760]。

脐血血浆的制备方面，通常选择产前检查无肝胆系统和血液系统疾病及各种传染病、非高危妊娠和两对半、甲丙戊肝抗体阴性的健康产妇，并要求足月顺产，无产科并发症。当胎儿娩出后立即断脐，消毒封闭式采集脐血，至胎盘剥离停止采血，设1只胎盘采集的脐血为1个单位，每单位脐血约100ml，制备成血浆约50ml，并做血型鉴定及无菌检测。脐血血浆制备后置于-50℃或以下冷冻保存、备用(输注时要求血型相同)。

治疗方法方面，每次可输注脐血血浆3～6单位，为减少输血反应，输注前注射地塞米松2～5mg，根据病情，每隔2～5d可再输注脐血血浆3～6单位2～4次。

附图说明

图1是离心前和离心后离心管内物质分布示意图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在本发明中，如未特别指明，所用试剂试药等材料均为市售获得的。

实施例1：分离脐血血浆

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血(5ml)置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测(包括hiv、hcv、htlv检测)，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本(具体操作中，取一份样本中的10ml量进行试验，下同；由于一份脐血样本通常能达到100ml以上，因此一份脐血样本可以用于多次试验)，将其与生理盐水以1：1体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入0.8倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，2000rpm离心15min(加速度1、减速度0)，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-80℃冷冻保存，分离得到脐血血浆(本实施例所得血浆样品可记为ex1)；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

典型的，离心前和离心后离心管内物质分布示意图如图1所示，其中在离心前的离心管中分上下两层：血液即脐血样本层和分离液层，离心后的离心管中自上至下分四层：血浆层、单核细胞层、分离液层和红细胞层。

实施例2：分离脐血血浆

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血(3ml)置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测(包括hiv、hcv、htlv检测)，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：0.8体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入0.6倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，1500rpm离心20min(加速度1、减速度0)，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-50℃冷冻保存，分离得到脐血血浆(本实施例所得血浆样品可记为ex2)；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

实施例3：分离脐血血浆

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血(8ml)置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测(包括hiv、hcv、htlv检测)，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：1.2体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入1.2倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，2500rpm离心10min(加速度1、减速度0)，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-60℃冷冻保存，分离得到脐血血浆(本实施例所得血浆样品可记为ex3)；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

实施例4：分离脐血血浆

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血(4ml)置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测(包括hiv、hcv、htlv检测)，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：0.9体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入0.9倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，1700rpm离心18min(加速度1、减速度0)，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-80℃冷冻保存，分离得到脐血血浆(本实施例所得血浆样品可记为ex4)；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

实施例5：分离脐血血浆

(1)提供于产前当天采集的产妇外周血(6ml)置于采血管中，提供生产时采集的新鲜脐血置于血袋中，运回实验室待处置；

(2)外周血进行病毒检测(包括hiv、hcv、htlv检测)，以确保脐血样本的安全性；

(3)从血袋中抽出脐血样本，将其与生理盐水以1：1.1体积比稀释，充分混匀；

(4)将ficoll分离液加至离心管中，缓慢加入1.0倍体积的步骤(3)所得脐血稀释液，2300rpm离心12min(加速度1、减速度0)，脐血分成三层(上层、中间层、下层三层分别为：血浆层、单核细胞层(包含淋巴细胞、造血干细胞等)、红细胞层，其中分离液层介于中间层与下层之间)；

(5)缓慢抽取上层血浆，取适量用于微生物检测，其余置于-80℃冷冻保存，分离得到脐血血浆(本实施例所得血浆样品可记为ex5)；另外依次分别缓慢吸出中间层、分离液层和下层，另行处理。

实施例6：分离脐血血浆

分别参照实施例1～5的方法，不同的是仅在所用ficoll分离液中额外添加重量/体积百分比0.025％、0.03％、0.02％、0.022％、0.027％的乳果糖，分离得到脐血血浆以及中间层细胞和下层细胞。本实施例中，分别参照实施例1～5所得五批血浆样品分别记为ex61、ex62、ex63、ex64、ex65。

当以上实施例1～6采用同一脐血样本进行时，实施例6所得血浆量是其相应实施例1～5所得血浆量的1.21～1.26倍，例如ex61所得血浆量是ex1所得血浆量的1.24倍，表明实施例6方法血浆收率更高。针对另外获取的8份脐血样本，均分别照以上实施例1～6的方法进行，结果实施例6所得血浆量均是其相应实施例1～5所得血浆量的1.20～1.29倍，表明实施例6方法所得血浆收率比实施例1～5收率高20～29％。

实施例6与实施例1～5相比，其血浆层与单核细胞层之间的界面、单核细胞层与分离液层之间的界面明显的更清晰，这种清晰的界面有助于更加准确地吸取各个细胞层，这一效果从下面测定血浆层与分离液层中的单核细胞残存量的差异可以更清楚地说明。对于实施例1～6所得血浆，使用五分类血细胞分析仪，测定其血浆层中的单核细胞数量，实施例6所得血浆中残存的单核细胞数为2.2～2.7*10^2/l范围内，实施例1～5所得血浆中残存的单核细胞数为46.2～51.3*10^2/l范围内，并且实施例1～5所得血浆中残存单核细胞数是其相应实施例6所得血浆中残存单核细胞数的19～23倍，例如ex2所得血浆中残存单核细胞数是ex62所得血浆中残存单核细胞数的21.2倍。对于实施例1～6所得分离液层，使用五分类血细胞分析仪，测定其分离液层中的单核细胞，实施例6所得分离液层中残存的单核细胞数为1.8～2.1*10^2/l范围内，实施例1～5所得分离液层中残存的单核细胞数为27.8～32.6*10^2/l范围内，并且实施例1～5所得分离液层中残存单核细胞数是其相应实施例6所得分离液层中残存单核细胞数的14～18倍，例如ex2所得分离液层中残存单核细胞数是ex62所得分离液层中残存单核细胞数的16.4倍。

另外，参照美国药典usp36第4049页收载的lactuloseconcentrate中的含量测定方法，测定各实施例所得血浆层、单核细胞层和红细胞层中的乳果糖的含量，结果：实施例1～6所得全部血浆层、单核细胞层和红细胞层中乳果糖的浓度均小于0.01％，表明在这些层基本无残留的乳果糖。

脐血血浆具有广泛的应用价值，这些应用价值已有广泛报道。例如，伍钢(伍钢，等，脐血血浆体外对造血祖细胞增殖的影响，中华血液学杂志，1997年05期)探讨了脐血血浆对造血细胞增殖的刺激作用。具体方法是，用细胞培养的方法以集落形成单位(cfu)为指标，观察了脐血血浆体外对脐血和骨髓造血祖细胞增殖的影响。结果显示：①脐血血浆使脐血cfu总和增加了2.23±0.52倍，在一定范围内，cfu总和增加幅度与培养体系中脐血血浆含量呈剂量依赖关系，并发现脐血细胞和脐血血浆abo血型不同时刺激作用更为明显。②脐血血浆对骨髓造血祖细胞集落形成的刺激作用与abo血型有关，血型相同者，无刺激作用，血型不同者cfu总和增加了1.55±0.43倍。③细胞因子可使脐血cfu总和增加，联合应用细胞因子与脐血血浆，cfu总和增加更为明显。④成人外周血血浆对脐血和骨髓造血细胞增殖的影响与胎牛血清相比无差异。这些结果表明：脐血血浆中含有刺激造血细胞增殖的因子，这种(些)因子对造血细胞的刺激作用具有一定的选择性；并提示脐血干细胞移植时同时输注脐血血浆可能更为有利。

陆琰(陆琰，等，胎盘间充质干细胞脐血血浆培养体系的建立，广东医学，2015年15期)建立并优化了适用于临床级胎盘源间充质干细胞的脐血血浆体外培养体系。具体方法是，采用酶消化法分离胎盘间充质干细胞，分为胎牛血清组(10％胎牛血清+dmem/f12)、脐血血浆组(10％脐血血浆+dmem/f12+1000iu/l肝素)和无血清组(stempromscsfmctstm)；经培养扩增后，采用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志，并诱导细胞向成脂肪、成骨分化，比较3组培养扩增所得间充质干细胞的差异。结果显示：3组细胞的增殖速度并无明显差异；脐血血浆组、胎牛血清组及无血清组培养扩增所得的细胞均表达cd90、cd29、cd44、cd49e、cd105、cd73，不表达cd34、hla-dr、cd45；而且均具有向成脂、成骨分化的能力。这些结果表明：脐血血浆可取代胎牛血清或无血清培养基用于胎盘间充质干细胞的培养扩增，以此获取可供临床应用的胎盘间充质干细胞。

李满祥(李满祥，等，混合脐血血浆对脐血cd34～+细胞体外扩增的作用，中国实验血液学杂志，1998年01期)采用两步法分离出脐血cd34～+细胞，比较研究了混合脐血血浆联合il-3，il-6，gm-csf，epo4种中、晚期造血因子和单纯的4种造血因子情况下脐血cd34～+细胞的体外扩增。结果表明，混合脐血血浆联合造血因子对粒-巨噬细胞集落形成单位(granulocyte-macrophagecolony-formingunit，cfu-gm)，红系爆式集落形成单位(burst-formingunitoferythriod，bfu-e)，混合集落形成单位(minxedcolony-formingunit，cfu-mix)3种集落的扩增效果明显优于单纯的4种造血因子联合组，差异具有统计学意义(p<0.01)，但单纯混合脐血血浆扩增效果较差。脐血造血细胞扩增对子成人脐血移植有重要意义。上述结果提示，混合脐血血浆的扩增成功，可代替或弥补早期造血生长因子的作用，用于脐血造血细胞的体外扩增。

彭晓(彭晓，等，混合脐血血浆用于cd3ak细胞培养的研究，临床血液学杂志，2000年03期)观察比较了混合脐血血浆和成人ab血清在cd3ak细胞培养中的作用效果。具体方法是，分别用混合脐血血浆和成人ab血清培养cd3ak细胞，检测两组细胞的增殖特性、杀伤活性及免疫表型。结果显示：混合脐血血浆组的增殖倍数略低于血清组，对k562、hl-60的杀伤活性则稍高于血清组，但差异均无显著性意义(均为p>0.05)；两组的免疫表型都以cd3+、cd8+为主，亦无显著性差异(p>0.05)。这些结果表明：混合脐血血浆在cd3ak等免疫效应细胞的培养中可能和成人ab血清具有相似的效果。

张学忠(张学忠，等，脐血血浆输注对急性白血病患者化疗后血象恢复的影响，白血病，2000年05期)的论文目的在于开发脐血血浆的临床应用价值，探讨脐血血浆输注对急性白血病患者化疗后血象恢复的影响。具体方法是，设脐血血浆治疗组和对照组，治疗组在急性白血病化疗后第2天和第4天各输注脐血血浆6u，对照组仅采用一般的对症支持治疗，观察两组病例化疗后血象和骨髓象的恢复情况。结果显示：治疗组外周血白细胞恢复较快，平均为(11.83±4.26)d，对照组平均为(18.92±5.75)d(p<0.05)；治疗组骨髓恢复至增生活跃需(11.24±4.68)d，对照组骨髓恢复至增生活跃需(19.15±6.76)d，两组差异有显著性(p<0.05)；且无一例出现输血反应及其它不良现象。这些结果表明：急性白血病患者化疗后脐血血浆输注具有刺激骨髓生长和促进外周血白细胞恢复的功能，临床输注脐血血浆具有一定的开发利用价值。

王秀华(王秀华，等，恶性血液病患者化疗后输注脐血血浆的研究，江苏医药，2000年10期)在其论文中探讨了脐血血浆(cbp)输注对恶性血液病患者化疗后细胞因子的变化和血像恢复的影响。具体方法是，恶性血液病患者78例化疗后治疗组于第2、4天分别输注cbp6个单位，或注射基因重组人粒细胞集落刺激因子(rhgcsf)150μg，对照组采用对症支持治疗，观察三组病例化疗后粒细胞集落刺激因子(gcsf)和红细胞生成素(epo)的水平变化及骨髓和血像的恢复情况。结果显示，cbp和rhgcsf治疗组外周血白细胞恢复较对照组快(p<005)，cbp输注后第2天外周血gcsf和epo水平达到高峰。且无输血反应及其它不良现象。这些结果表明，恶性血液病患者化疗后输注cbp具有促进外周血白细胞恢复的功能，临床上具有一定的开发利用价值。

王利(王利，等，脐血血浆对k562细胞增殖抑制作用研究，重庆医学，2003年08期)研究脐血血浆(cbp)对人红白血病细胞株k562增殖影响及可能机制，具体方法是，台盼蓝拒染法绘制生长曲线；mtt法检测cbp对k562细胞的抑制作用；流式细胞术分析细胞周期变化；免疫细胞化学方法检测增殖相关核抗原(pcna，ki67)表达。结果显示，细胞生长曲线可见cbp作用24h即观察到抑制作用，随时间增加，抑制作用更加明显，有非常显著性差异(p<0.01)。mtt法结果与生长曲线结果相符。cbp作用3d后，s期细胞数减少，g0/g1期细胞增多，有显著性差异(p<0.05)，并出现g0/g1期凋亡细胞。cbp作用后，k562细胞增殖相关核抗原pcna、ki67表达阳性程度降低，有显著性差异(p<0.05)。这些结果表明，cbp对k562细胞增殖有明显抑制作用，与浓度、时间正相关；其机制可能与诱导凋亡、下调pcna、ki67表达，抑制细胞增殖活性有关。

姚一芸(姚一芸，等，脐血血浆化疗增敏作用的实验研究，诊断学理论与实践，2004年06期)研究了脐血血浆(cbp)对急性髓细胞性白血病(aml)细胞的体外化疗增敏作用，其方法是，以aml细胞株hl-60细胞为实验对象，培养体系中分别加入cbp或人重组粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhgm-csf)作为实验组或阳性对照组，不加cbp和rhgm-csf的hl-60细胞作为阴性对照组。培养48h后进行细胞周期动力学检测；各组细胞再加入阿糖胞苷(ara-c)培养，24h后进行细胞增殖测定。结果：经过48h孵育，cbp组s期细胞比例明显增高，再与ara-c作用，细胞的生长较阴性对照组明显受抑。实验组和阳性对照组之间无明显差异。这些结果表明，cbp与rhgm-csf相似，可通过促进hl-60细胞进入s期增强对ara-c的敏感性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。