一种褐飞虱Vg多肽及其多克隆抗体制备方法与流程

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测，具体是一种兔抗褐飞虱vg多肽多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

vg全称为vitellogenin，为卵黄原蛋白，在昆虫卵子发生等生殖过程中发挥着至关重要的作用。褐飞虱是农业重要害虫，对褐飞虱的vg进行研究或检测对于褐飞虱的防治具有重要意义。

技术实现要素：

（1）本发明的目的在于提供一种vg多肽，其序列为：knyndnsgrysasn。

（2）本发明的另一目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与组织或细胞中天然vg蛋白特异识别的vg多肽多克隆抗体及其制备方法。

（3）所述的vg多肽多克隆抗体通过以下技术方案实现：

步骤一：在合成所述多肽序列时，在其n端增加一个半胱氨酸，方便与载体蛋白偶联，用多肽自动合成仪合成vg修饰多肽，纯化后与载体蛋白klh偶联，形成vg修饰多肽-klh复合蛋白；

步骤二：将乳化后的vg修饰多肽-klh复合蛋白在兔背部皮下注射，初次免疫后，进行3次加强免疫；

步骤三：收集、分离得到含有兔抗褐飞虱vg修饰多肽抗体的血清；

步骤四：将抗血清通过vg多肽亲和层析柱进行肽亲和纯化，得到vg多肽抗体；

步骤五：对vg多肽抗体进行效价检测；

步骤六：通过westernblot对vg多肽抗体的特异性进行鉴定。

附图说明

图1为westernblot图，图中免疫印迹的目的条带大小在200kda左右，与vg蛋白的理论分子量（227.8kda）大小一致。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例一：褐飞虱vg序列的分析与vg多肽的设计和合成

根据genbank上的褐飞虱vg序列（登录号：ael22916），已知褐飞虱vg蛋白序列包含2045个氨基酸，利用dnastar软件中的protean程序模块对褐飞虱vg蛋白特性进行分析，得知该蛋白分子量为227786.41道尔顿，等电点为8.32，为碱性蛋白，进一步分析该蛋白氨基酸序列的抗原性、亲水性、表面可能性等特征，从中筛选到一段序列为knyndnsgrysasn的多肽序列适合用作抗原（1722aa-1735aa）。为便于与载体蛋白交联，增加多肽的免疫原性，在上述多肽的n末端增加一个半胱氨酸c，故最终待合成的多肽序列为cknyndnsgrysasn。多肽合成由多肽自动合成仪合成，合成的多肽用高效液相色谱仪（hplc）检测纯度，纯度为86.1%，用ms质谱仪检测多肽的分子量，其分子量为1692.40。

实施例二：多肽与载体蛋白交联

采用mbs作为交联剂将载体蛋白klh与合成多肽进行交联：用交联缓冲液溶解klh至浓度为10mg/ml；溶解mbs于dmf为10mg/ml；将溶解后的klh溶液和mbs溶液按10：1（w/w）的比例混匀，室温激活klh30分钟；用sephadexg‐25纯化激活的klh溶液；将激活的klh溶液与多肽溶液按1:1（w/w）混合，室温反应3小时；将上述反应液在pbs中4℃下透析过夜，得到多肽-klh复合蛋白。

实施例三：实验动物的免疫。

选取适龄的新西兰雄兔作为免疫动物，免疫前耳部静脉采血2-3ml，用作后续elisa检测的阴性对照。首次免疫时，将0.5mg的多肽-klh复合蛋白溶于0.5ml的pbs溶液中，与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化，兔子皮下多点注射。2周后，进行首次加强免疫，将0.5mg的多肽-klh交联复合蛋白溶于0.5ml的pbs溶液中，与等体积的弗氏不完全佐剂充分混匀乳化，皮下多点注射，此后每隔3周进行同样操作的加强免疫，前后共3次。每次加强免疫1周后，从兔子耳部静脉采血微量，用间接elisa法检测免疫血清效价，当效价达到1:20000以上，采用颈动脉放血的方式收集兔子血液，制备血清。

实施例四：vg多肽亲和层析柱纯化抗体

将1ml活化的凝胶悬液注入层析柱，待柱内液体流干后，加入5ml的偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的vg多肽，并加入层析柱，再加入1ml的偶联缓冲液至层析柱中，于4℃条件下旋转混匀过夜。用8ml偶联缓冲液冲洗层析柱，再用3ml的封闭液室温封闭1小时，用结合缓冲液冲洗层析柱3次，直至柱内液体流干，制备得到vg多肽结合层析柱。向层析柱内加入含有vg抗体血清的结合缓冲液，室温混匀1小时，用30ml冲洗缓冲液冲洗层析柱，直至流出液的280nm吸收峰稳定。用15ml的洗脱缓冲液洗脱层析柱，获得纯化的vg抗体。

实施例五：间接elisa法测定抗体的效价

将vg修饰多肽-klh复合物包被elisa板，4℃下过夜包被；用5%的脱脂奶粉室温封闭2小时；用vg抗体作不同浓度稀释，1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，室温2小时或4℃过夜孵育；加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，室温孵育2小时；加入tmb进行显色反应，硫酸终止反应后测定450nm波长的吸光度。当与阴性血清的比值大于2.1时，计算抗体效价。经检测，纯化过后的vg抗体的效价达到1:512000。

实施例六：westernblot分析vg抗体的特异性检测

按照标准方法配制sds-page凝胶，将10μl蛋白浓度为5mg/ml的组织裂解液加入垂直电泳槽的上样孔中，恒压80v电泳，待样品跑过浓缩胶，呈一条直线时，改换120v电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶时终止电泳，采用湿转膜方法恒压100v电转90分钟，将蛋白转膜至nc膜。将实施例四获得的vg抗体作为一抗，1:500稀释后，与上述湿转后的nc膜在室温下杂交2小时，然后用hrp标记的羊抗兔抗体在室温下杂交2小时，采用dab显色法进行显色，得到免疫印迹结果。本实施例的实验结果表明，vg在褐飞虱卵巢中普遍表达。

序列表

<110>中国计量大学

<120>一种褐飞虱vg多肽及其多克隆抗体制备方法

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>nilaparvatalugens

<220>

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种褐飞虱Vg多肽及其多克隆抗体的制备方法。所述的Vg多肽的氨基酸序列为：KNYNDNSGRYSASN。其多克隆抗体制备步骤如下：（1）褐飞虱Vg蛋白抗原表位分析；(2)褐飞虱Vg多肽设计与合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗褐飞虱Vg多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗褐飞虱Vg多肽的抗体。本发明得到的褐飞虱Vg多肽多克隆抗体特异性好、纯度高，可与褐飞虱Vg蛋白发生特异性结合发应，可用于褐飞虱Vg蛋白的相关研究，如其特性、功能、表达谱和含量的分析。

技术研发人员：李迦南;许益鹏;俞晓平
受保护的技术使用者：中国计量大学
技术研发日：2018.12.24
技术公布日：2019.06.07