一种基于抗体反向表位设计的蛋白质及其在制备抗艾滋病病毒疫苗中的应用的制作方法

本发明涉及一种基于抗体反向表位设计的蛋白质及其在制备抗艾滋病病毒疫苗中的应用。
背景技术：
：自发现以来，艾滋病病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)已累计造成全球约3900万人死亡。为预防和治疗hiv感染，每年造成的全球经济负担目前已高达约2百亿美元。hiv感染已经成为严重的全球性公共健康问题。据世界卫生组织(worldhealthorganization，who)及联合国艾滋病规划署(thejointunitednationsprogrammeonhiv/aids，unaids)的最新统计，截至2016年12月，全球范围内hiv的感染人数约为3670万，2016年新增的hiv感染人数约为180万，死亡人数约为100万。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于抗体反向表位设计的蛋白质及其在制备抗艾滋病病毒疫苗中的应用。本发明提供了一组蛋白质，是如下(a1)至(a13)中的任意一种：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a4)含有(a1)或(a2)或(a3)的融合蛋白；(a5)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、三聚体折叠结构域；所述功能区段为(a1)或(a2)或(a3)；(a6)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为(a1)或(a2)或(a3)；(a7)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为(a1)或(a2)或(a3)；(a8)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为(a1)或(a2)或(a3)；(a9)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为(a1)或(a2)或(a3)；(a10)在(a1)或(a2)或(a3)或(a5)或(a6)的末端连接标签得到的融合(a11)在(a1)或(a2)或(a3)或(a5)或(a6)的n末端连接信号肽得到的融合蛋白；(a12)在(a1)或(a2)或(a3)或(a5)或(a6)的n末端连接信号肽c末端连接标签得到的融合蛋白；(a13)将(a1)至(a12)中的任意一种蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由其衍生的蛋白质。序列表的序列5所示蛋白质中具有序列表的序列3所示蛋白质。序列表的序列3所示蛋白质中具有序列表的序列1所示蛋白质。gp67信号肽具体如序列表的序列7所示。连接肽具体如序列表的序列9所示。三聚体折叠结构域具体如序列表的序列11所示。his6标签具体如序列表的序列13所示。编码以上任一所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体为如下(b1)至(b10)任一所述的dna分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)编码区如序列表中序列4所示的dna分子；(b3)编码区如序列表中序列6所示的dna分子；(b4)编码区自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：编码功能区段的基因、三聚体折叠结构域的编码序列；(b5)编码区自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：编码功能区段的基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列；(b6)编码区自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：gp67信号肽的编码序列、编码功能区段的基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列；(b7)编码区自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：编码功能区段的基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列、his6标签的编码序列；(b8)编码区自上游至下游依次由如下元件组成的dna分子：gp67信号肽的编码序列、编码功能区段的基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列、his6标签的编码序列；(b9)在严格条件下与(b1)至(b8)任一所述dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；(b10)与(b1)至(b8)任一所述dna分子具有95％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。所述编码功能区段的基因如序列表的序列2或序列表的序列4或序列表的序列6所示。gp67信号肽的编码序列具体如序列表的序列8所示。连接肽的编码序列具体如序列表的序列10所示。三聚体折叠结构域的编码序列具体如序列表的序列12所示。his6标签的编码序列具体如序列表的序列14所示。含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌具属于本发明的保护范围。所述重组质粒具体可为将以上任一所述基因插入pfastbac1载体的多克隆位点(例如bamhi和noti酶切位点之间)得到的重组质粒。本发明还保护以上任一所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c8)中的至少一种：(c1)制备抗艾滋病病毒疫苗；(c2)制备治疗艾滋病的药物；(c3)制备抑制艾滋病病毒的药物；(c4)制备抑制艾滋病病毒进入细胞的药物；(c5)抗艾滋病病毒；(c6)治疗艾滋病；(c7)抑制艾滋病病毒；(c8)抑制艾滋病病毒进入细胞。本发明还保护以上任一所述蛋白质形成的三聚体。所述三聚体的制备方法如下：将以上任一所述基因导入哺乳动物细胞，培养细胞并收集上清，其中含有所述三聚体。本发明还保护所述三聚体的应用，为如下(c1)至(c8)中的至少一种：(c1)制备抗艾滋病病毒疫苗；(c2)制备治疗艾滋病的药物；(c3)制备抑制艾滋病病毒的药物；(c4)制备抑制艾滋病病毒进入细胞的药物；(c5)抗艾滋病病毒；(c6)治疗艾滋病；(c7)抑制艾滋病病毒；(c8)抑制艾滋病病毒进入细胞。本发明还保护一种组合物，由组分甲、组分乙和组分丙组成；所述组分甲为蛋白甲形成的三聚体；所述蛋白甲为(e1)或(e2)或(e3)或(e4)或(e5)；所述组分乙为蛋白乙形成的三聚体；所述蛋白乙为(f1)或(f2)或(f3)或(f4)或(f5)；所述组分丙为蛋白丙形成的三聚体；所述蛋白丙为(g1)或(g2)或(g3)或(g4)或(g5)；(e1)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e2)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e3)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e4)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e5)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(f1)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f2)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f3)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f4)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f5)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(g1)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g2)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g3)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域；所述功能区段为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g4)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g5)自n端至c端依次由如下元件组成的蛋白质：gp67信号肽、功能区段、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签；所述功能区段为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。gp67信号肽具体如序列表的序列7所示。连接肽具体如序列表的序列9所示。三聚体折叠结构域具体如序列表的序列11所示。his6标签具体如序列表的序列13所示。所述组合物中，组分甲、组分乙和组分丙的质量配比为：0.5-2：0.5-2：0.5-2。所述组合物中，组分甲、组分乙和组分丙的质量配比为：1：1：1。所述组合物的功能为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：(d1)抗艾滋病病毒；(d2)治疗艾滋病；(d3)抑制艾滋病病毒；(d4)抑制艾滋病病毒进入细胞。本发明还保护所述组合物的应用，为如下(c1)至(c8)中的至少一种：(c1)制备抗艾滋病病毒疫苗；(c2)制备治疗艾滋病的药物；(c3)制备抑制艾滋病病毒的药物；(c4)制备抑制艾滋病病毒进入细胞的药物；(c5)抗艾滋病病毒；(c6)治疗艾滋病；(c7)抑制艾滋病病毒；(c8)抑制艾滋病病毒进入细胞。本发明还保护以上任一所述基因在制备疫苗中的应用；所述疫苗的功能为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：(d1)抗艾滋病病毒；(d2)治疗艾滋病；(d3)抑制艾滋病病毒；(d4)抑制艾滋病病毒进入细胞。本发明还保护一种疫苗，其活性成分为以上任一所述蛋白质或以上任一所述三聚体或以上任一所述组合物；所述疫苗的功能为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：(d1)抗艾滋病病毒；(d2)治疗艾滋病；(d3)抑制艾滋病病毒；(d4)抑制艾滋病病毒进入细胞。以上任一所述艾滋病病毒具体可为hivb亚型。以上任一所述艾滋病病毒具体可为中国流行株。以上任一所述艾滋病病毒具体可为cne14、cne4、cne10、cne11或cne57。本发明提供的蛋白质具有很好的表位构象和结合活性，显示出很好的靶向免疫原性。采用本发明提供的蛋白质作为免疫原免疫生物，可以促使生物产生对多种艾滋病病毒具有普适的中和活性的抗体。本发明对艾滋病的治疗具有重大的应用推广价值。附图说明图1为用buffer1进行分子排阻色谱纯化的色谱图。图2为六种溶液进行还原性sds-page凝胶电泳的电泳图。图3为实施例4中血清滴度的检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的pbs缓冲液均为ph7.2、0.01m的pbs缓冲液。pfastbac1载体：invitrogen公司，货号为10359-016。大肠杆菌dh10bac：invitrogen公司，货号为10359-016。sf9细胞：invitrogen公司，货号为11496-015。dunkinhartley雌性豚鼠：北京维通利华公司，货号为601。293t细胞：atcc，货号为crl-3216。pcdna3.1(+)载体：invitrogen公司，货号为v790-20。骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase：nihaidsreagent公司，货号为3418。tzm-bl细胞：nihaidsreagent公司，货号为8129。昆虫细胞培养基(insect-xpresstmmedia)：lonzawokinghamltd.，货号为12-730f。实施例1、v61蛋白及其编码基因的发现将随机切割与重组后产生的抗原片段文库通过t-a连接的方式与aga2蛋白的c端融合，在相应的诱导条件下展示在酿酒酵母表面。利用全长抗体和作为对照的其他中和表位在酵母展示文库中进行筛选，获得其对应的阳性酵母单克隆并进行酵母流式细胞染色验证，筛出表位抗原片段。其中三个表位抗原片段分别为表位抗原片段v61、表位抗原片段v51和表位抗原片段v17。表位抗原片段v61，又称v61蛋白，如序列表的序列1所示(由227个氨基酸残基组成)。v61蛋白的预期分子量为30-35kda。编码v61蛋白的核酸命名为v61基因，cdna中的编码区如序列表的序列2所示。表位抗原片段v51，又称v51蛋白，如序列表的序列3所示(由254个氨基酸残基组成)。v51蛋白的预期分子量为30-35kda。编码v51蛋白的核酸命名为v51基因，cdna中的编码区如序列表的序列4所示。表位抗原片段v17，又称v17蛋白，如序列表的序列5所示(由261个氨基酸残基组成)。v17蛋白的预期分子量为30-35kda。编码v17蛋白的核酸命名为v17基因，cdna中的编码区如序列表的序列6所示。实施例2、蛋白的表达和纯化一、构建重组质粒将特异dna分子甲-ⅰ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒甲-ⅰ。特异dna分子甲-ⅰ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列2所示的v61基因、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒甲-ⅰ导入细胞并培养可以表达特异蛋白甲-ⅰ。特异蛋白甲-ⅰ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列1所示的v61蛋白、his6标签。特异蛋白甲-ⅰ在培养上清中以单体的形式存在。将特异dna分子甲-ⅱ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒甲-ⅱ。特异dna分子甲-ⅱ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列2所示的v61基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒甲-ⅱ导入细胞并培养可以表达特异蛋白甲-ⅱ。特异蛋白甲-ⅱ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列1所示的v61蛋白、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签。特异蛋白甲-ⅱ在培养上清中以三聚体的形式存在。将特异dna分子乙-ⅰ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒乙-ⅰ。特异dna分子乙-ⅰ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列4所示的v51基因、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒乙-ⅰ导入细胞并培养可以表达特异蛋白乙-ⅰ。特异蛋白乙-ⅰ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列3所示的v51蛋白、his6标签。特异蛋白乙-ⅰ在培养上清中以单体的形式存在。将特异dna分子乙-ⅱ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒乙-ⅱ。特异dna分子乙-ⅱ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列4所示的v51基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒乙-ⅱ导入细胞并培养可以表达特异蛋白乙-ⅱ。特异蛋白乙-ⅱ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列3所示的v51蛋白、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签。特异蛋白乙-ⅱ在培养上清中以三聚体的形式存在。将特异dna分子丙-ⅰ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒丙-ⅰ。特异dna分子丙-ⅰ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列6所示的v17基因、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒丙-ⅰ导入细胞并培养可以表达特异蛋白丙-ⅰ。特异蛋白丙-ⅰ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列5所示的v17蛋白、his6标签。特异蛋白丙-ⅰ在培养上清中以单体的形式存在。将特异dna分子丙-ⅱ插入pfastbac1载体的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒丙-ⅱ。特异dna分子丙-ⅱ中，自上游至下游依次由如下元件组成：gp67信号肽的编码序列、序列表的序列6所示的v17基因、连接肽的编码序列、三聚体折叠结构域的编码序列、his6标签的编码序列、终止密码子(taa)。将重组质粒丙-ⅱ导入细胞并培养可以表达特异蛋白丙-ⅱ。特异蛋白丙-ⅱ中，自n端至c端依次由如下元件组成：gp67信号肽、序列表的序列5所示的v17蛋白、连接肽、三聚体折叠结构域、his6标签。特异蛋白丙-ⅱ在培养上清中以三聚体的形式存在。以上六个重组质粒中，gp67信号肽的编码序列均如序列表的序列8所示(编码序列表的序列7所示的多肽)，连接肽的编码序列均如序列表的序列10所示(编码序列表的序列9所示的多肽)，三聚体折叠结构域的编码序列均如序列表的序列12所示(编码序列表的序列11所示的多肽)，his6标签的编码序列均如序列表的序列14所示(编码序列表的序列13所示的多肽)。二、重组bacmid的制备1、将重组质粒加入刚刚融化的大肠杆菌dh10bac感受态细胞中，冰上放置30min；然后42℃热激75s，放回冰上2min；然后加入500μllb液体培养基，于37℃复苏5h；然后吸取10μl涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、40μg/mliptg和100μg/mlx-gal的lb固体培养基平板，避光培养三天至长出清晰的蓝白斑。2、挑取白色单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的lb液体培养基，37℃、220rpm振荡培养12小时。3、取步骤2得到的培养体系，采用的质粒小提试剂盒(qiaprepspinminiprepkit，qiagen公司，货号为27106,其中含有p1试剂、p2试剂和p3试剂)提取质粒，具体步骤依次如下：(1)将培养体系13000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用p1试剂重悬菌体；(2)加入p2试剂，缓慢颠倒混匀6-8次；(3)加入p3试剂，缓慢颠倒混匀6-8次(可见白色沉淀)，13000rpm离心10min，取上清液；(4)取600μl步骤(3)得到的上清液，加入800μl预冷的异丙醇，-20℃放置10min，然后13000rpm离心15min，收集沉淀；(5)用500μl预冷的70％乙醇水溶液重悬步骤(4)得到的沉淀，13000rpm离心5min，收集沉淀，将酒精完全吹干后，用65℃预热的ddh2o溶解沉淀，13000rpm离心5min，吸取上清，即为重组bacmid的溶液，简称bacmid溶液。重组质粒为重组质粒甲-ⅰ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液甲-ⅰ。重组质粒为重组质粒甲-ⅱ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液甲-ⅱ。重组质粒为重组质粒乙-ⅰ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液乙-ⅰ。重组质粒为重组质粒乙-ⅱ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液乙-ⅱ。重组质粒为重组质粒丙-ⅰ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液丙-ⅰ。重组质粒为重组质粒丙-ⅱ时，得到的bacmid溶液命名为bacmid溶液丙-ⅱ。三、重组病毒的制备与扩增1、取生长良好的sf9细胞，加入10cm培养皿中，静置10min，细胞贴壁，显微镜下观察，保证培养皿底部约有70％-80％被细胞覆盖。2、取cellfectiniireagent15μl，用100μl昆虫细胞培养基稀释。3、取15-20μlbacmid溶液，用100μl昆虫细胞培养基稀释。4、将步骤2得到的液相缓慢加入步骤3得到的液相中，缓慢吹打均匀，室温静置30min，用昆虫细胞培养基稀释至2ml。5、取完成步骤1的培养皿，弃去上清，缓慢均匀的将步骤4得到的液相滴加至培养皿中，27℃静置培养5h后吸弃上清，加入7ml新鲜的昆虫细胞培养基，用封口膜密封后27℃静置培养8天，收集培养液，600g离心6min，取上清液，加入胎牛血清并使其体积浓度为2-5％，长期保存，即为p0代重组病毒的病毒液。6、取p0代重组病毒的病毒液，按照1:1000的体积比加入摇瓶培养的细胞浓度为2×106个细胞/ml的sf9细胞液中，27℃、110rpm培养5天，收集培养液，600g离心6min，取上清液，即为p1代重组病毒的病毒液，简称p1代病毒液。bacmid溶液为bacmid溶液甲-ⅰ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液甲-ⅰ。bacmid溶液为bacmid溶液甲-ⅱ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液甲-ⅱ。bacmid溶液为bacmid溶液乙-ⅰ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液乙-ⅰ。bacmid溶液为bacmid溶液乙-ⅱ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液乙-ⅱ。bacmid溶液为bacmid溶液丙-ⅰ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液丙-ⅰ。bacmid溶液为bacmid溶液丙-ⅱ时，得到的p1代病毒液命名为p1代病毒液丙-ⅱ。四、蛋白的表达和纯化1、取p1代病毒液，按照1:100的体积比加入1l细胞浓度为2×106个细胞/ml的sf9细胞液中，27℃、125rpm培养72小时，4000rpm离心15min，收集上清液。2、将步骤1得到的上清液用双层0.45μm的玻璃纤维膜抽滤，收集滤液。3、用切向流超滤系统(masterflexpharmedbpttubing系统，cole-parmer公司，货号为06508-24)对步骤2得到的滤液进行浓缩，同时加入buffer1(含150mmnacl的ph7.2、10mmhepas缓冲液)不断稀释，使蛋白置换到buffer1中，然后13000rpm离心30min，收集上清液。4、亲和层析(1)在步骤3得到的上清液中加入ni-nta纯化介质，4℃孵育3小时，400rpm离心5min，取沉淀。(2)用100ml含20mm咪唑的buffer1洗涤步骤(1)得到的沉淀，以去除杂蛋白。(3)用20ml含300mm咪唑的buffer1洗涤步骤(2)得到的沉淀，收集溶液。5、使用10kd浓缩管对步骤4得到的溶液进行浓缩，得到蛋白浓缩液。6、使用凝胶过滤柱(superdex200，gehealthcare)纯化步骤5得到的蛋白浓缩液，用buffer1进行洗脱，流速为1ml/min。p1代病毒液为p1代病毒液甲-ⅰ时，步骤6中收集保留体积为14.5-17.5ml的过柱后溶液，即为含有单体形式存在的特异蛋白甲-ⅰ的溶液，命名为v61溶液。p1代病毒液为p1代病毒液甲-ⅱ时，步骤6中收集保留体积为12-15ml的过柱后溶液，即为含有三聚体形式存在的特异蛋白甲-ⅱ的溶液，命名为v61tri溶液。p1代病毒液为p1代病毒液乙-ⅰ时，步骤6中收集保留体积为14.5-17.5ml的过柱后溶液，即为含有单体形式存在的特异蛋白乙-ⅰ的溶液，命名为v51溶液。p1代病毒液为p1代病毒液乙-ⅱ时，步骤6中收集保留体积为12-15ml的过柱后溶液，即为含有三聚体形式存在的特异蛋白乙-ⅱ的溶液，命名为v51tri溶液。p1代病毒液为p1代病毒液丙-ⅰ时，步骤6中收集保留体积为14.5-17.5ml的过柱后溶液，即为含有单体形式存在的特异蛋白丙-ⅰ的溶液，命名为v17溶液。p1代病毒液为p1代病毒液丙-ⅱ时，步骤6中收集保留体积为12-15ml的过柱后溶液，即为含有三聚体形式存在的特异蛋白丙-ⅱ的溶液，命名为v17tri溶液。用buffer1进行洗脱的色谱图见图1，均显示较单一的峰尖。所有三聚体蛋白比其对应的单体蛋白均有较明显的峰尖前移，说明其通过自身三聚体折叠结构域已成功组装为三聚体形式。7、将步骤6得到的六种溶液进行还原性sds-page凝胶电泳，结果见图2。所有6种蛋白均在约55kda有较纯的主条带。实施例3、表位抗原片段与抗体的结合活性通过表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，spr)，检测表位抗原片段与cd4bs等相关抗体的结合活性。选取了7种cd4bsvrc01class抗体(vrc01、12a12、vrc-ch31、3bnc60、3bnc117、nih45-46、vrc-pg04)和1种v3-glycan抗体(pgt135)。采用3c11抗体(针对流感病毒ha的抗体)为对照抗体。vrc01抗体，轻链如genbankaccessionno.gu980703.1(30-aug-2010)所示，重链如genbankaccessionno.gu980702.1(30-aug-2010)所示。12a12抗体，轻链如genbankaccessionno.he584540.1(25-jul-2016)所示，重链如genbankaccessionno.he584539.1(25-jul-2016)所示。vrc-ch31抗体，轻链如genbankaccessionno.jn159438.1(29-mar-2012)所示，重链如genbankaccessionno.jn159435.1(29-mar-2012)所示。3bnc60抗体，轻链如genbankaccessionno.he584536.1(25-jul-2016)所示，重链如genbankaccessionno.he584535.1(25-jul-2016)所示。3bnc117抗体，轻链如genbankaccessionno.he584538.1(25-jul-2016)所示，重链如genbankaccessionno.he584537.1(25-jul-2016)所示。nih45-46抗体，轻链如genbankaccessionno.he584544.1(25-jul-2016)所示，重链如genbankaccessionno.he584543.1(25-jul-2016)所示。vrc-pg04抗体，轻链如genbankaccessionno.jn159466.1(29-mar-2012)所示，重链如genbankaccessionno.jn159464.1(29-mar-2012)所示。pgt135抗体，轻链如genbankaccessionno.jn201920.1(26-sep-2011)所示，重链如genbankaccessionno.jn201903.1(26-sep-2011)所示。3c11抗体，轻链如genbankaccessionno.jf274049.1(22-feb-2012)所示，重链如genbankaccessionno.jf274048.1(22-feb-2012)所示。本实施例中所用的表位抗原片段即实施例2制备的各个蛋白，具体加入形式为实施例2制备的v61溶液、v61tri溶液、v51溶液、v51tri溶液、v17溶液或v17tri溶液。将表位抗原片段通过氨基偶联试剂盒(gehealthcare)固定到cm5芯片表面，并使其达到200-300responseunits(ru)。进行抗原-抗体结合的动力学分析时：将抗体按1-500nm起始浓度分别流过芯片(结合时间3min、流速30μl/min；解离时间5-30min、流速30μl/min)，然后利用ph2.0、10mm的glycine-hcl缓冲液以50μl/min流速重生1min；再用2倍起始浓度重复上面结合、解离、重生步骤；再用4倍起始浓度重复上面结合、解离、重生步骤；再用8倍起始浓度重复上面结合、解离、重生步骤；再用16倍起始浓度重复上面结合、解离、重生步骤；最后，利用biacoreevaluation软件分析动力学数据，采用1:1langmuirmodel进行分析，最终得到结合常数(kon，on-rateconstant)、解离常数(koff，off-rateconstant)和平衡解离常数(kd，equilibriumdissociationconstant)。实验温度为25℃，所用缓冲液为hbs-ep(10mmhepes,150mmnacl,3mmedta,0.005％surfactantp20,ph7.4)。平衡解离常数的结果见表1(nd代表未检测到结合活性)。单体形式的表位抗原片段和三聚体形式的表位抗原片段均与多种hiv抗体具有较高亲和活性。表1实施例4、豚鼠免疫实验一、免疫并收集血清试验动物为：8-10周龄dunkinhartley雌性豚鼠。采用实施例2制备的v61tri溶液、v51tri溶液或v17tri溶液。蛋白量均以总蛋白计。稀释均采用pbs缓冲液。免疫方式均为皮下免疫。第一组(6只试验动物，依次命名为seq01-seq06)：试验第0天进行初次免疫，试验第28天进行第一次加强免疫，试验第84天进行第二次加强免疫，试验第140天进行第三次加强免疫，试验第154天采血并收集血清；初次免疫时，将v17tri溶液稀释后与完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg；第一次加强免疫时，将v51tri溶液稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg；第二次加强免疫时，将v61tri溶液稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg；第三次加强免疫时，将v17tri溶液稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg；第二组(6只试验动物，依次命名为mix01-mix06)：试验第0天进行初次免疫，试验第28天进行第一次加强免疫，试验第84天进行第二次加强免疫，试验第140天进行第三次加强免疫，试验第154天采血并收集血清；初次免疫时，将v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液混合稀释后与完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg(v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液各提供100μg蛋白)；第一次加强免疫时，将v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液混合稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg(v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液各提供100μg蛋白)；第二次加强免疫时，将v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液混合稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg(v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液各提供100μg蛋白)；第三次加强免疫时，将v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液混合稀释后与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl，单只动物免疫的蛋白量为300μg(v61tri溶液、v51tri溶液和v17tri溶液各提供100μg蛋白)；第三组(对照组)(3只试验动物，依次命名为nc01-nc03)：试验第0天进行初次免疫，试验第28天进行第一次加强免疫，试验第84天进行第二次加强免疫，试验第140天进行第三次加强免疫，试验第154天采血并收集血清；初次免疫时，将pbs缓冲液与完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl；第一次加强免疫时，将pbs缓冲液与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl；第二次加强免疫时，将pbs缓冲液与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl；第三次加强免疫时，将pbs缓冲液与不完全弗氏佐剂等体积混合后进行免疫，单只动物免疫总体积为600μl。二、血清滴度取步骤一得到的血清作为待测血清，通过elisa检测滴度。elisa检测时，包被抗原的包被浓度为2μg/ml。包被抗原分别由实施例2制备的v61tri溶液、v51tri溶液或v17tri溶液提供(浓度以总蛋白浓度计)。待测血清的滴度是按照最大稀释度下od450nm的读值大于阴性血清对照确定的。结果见图3。对照组试验动物得到的待测血清结果为阴性。第一组试验动物和第二组试验动物得到的待测血清针对3种包被原的滴度均为106-107。三、中和活性检测取步骤一得到的血清作为待测血清。为了验证待测血清的中和活性，选取若干现有毒株的假病毒分别作为待测毒株，进行假病毒中和实验。1、制备各个假病毒现有毒株分别为：中国流行株：cne14、cne4、cne10、cne11和cne57。采用鼠白血病病毒mmlv作为现有毒株的对照病毒。表达全长膜蛋白的质粒(命名为膜蛋白质粒)和骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染293t细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的假型病毒，其感染性同活病毒相似。将编码各个现有毒株的全长膜蛋白的基因插入pcdna3.1(+)载体的hindiii和xhoi酶切位点之间，得到各个膜蛋白质粒。将某个膜蛋白质粒和骨架质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染293t细胞，37℃静置孵育，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有相应假病毒的病毒液。cne14的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.hm215400.1(07-nov-2014)所示。cne4的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.hm215413.1(07-nov-2014)所示。cne10的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.hm215397.1(07-nov-2014)所示。cne11的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.hm215398.1(07-nov-2014)所示。cne57的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.hm215420.1(07-nov-2014)所示。mmlv的全长膜蛋白及其编码基因如genbankaccessionno.s77017.1(26-jul-2016)所示。2、中和活性检测待测病毒液分别为步骤1制备的各个假病毒的病毒液。(1)采用含10％fbs的dmem培养基将待测血清倍比稀释，得到不同稀释倍数的各个稀释液。(2)将100微升步骤(1)得到的稀释液与50微升待测病毒液(病毒含量为100tcid50)混合，37℃静置孵育1小时。设置用100微升含10％fbs的dmem培养基代替100微升稀释液的空白对照。(3)完成步骤(2)后，加入50微升tzm-bl细胞的细胞液(约含2×104个tzm-bl细胞)，37℃静置孵育48小时。(4)完成步骤(3)后，加入100μlpbs缓冲液和50μl细胞裂解液(bright-glotmluciferaseassaysystem，promega，e2650)，静置2min，然后用化学发光仪检测荧光素酶活性。每种处理设置5个复孔，结果取平均值。中和活性＝(空白对照组的荧光强度-加入稀释液的实验组的荧光强度)/空白对照组的荧光强度×100％。中和活性为50％时对应的待测血清的稀释度即为id50值。结果见表2(na代表无活性)。第一组试验动物和第二组试验动物得到的待测血清可以不同程度的中和各个假病毒进入细胞，不但可以中和自体病毒cne11，还可以不同程度的中和cne14、cne4、cne10和cne57等异体病毒，其中mix02对cne14和cne4的中和id50值可分别达592和3226。序贯式免疫组(第一组)和混合式免疫组(第二组)之间的中和活性并无明显统计学差异，但混合式免疫组略强。表2nc01nc02nc03seq01seq02seq03seq04seq05seq06mix01mix02mix03mix04mix05mix06cne14<20<20<201316448801332874765921321382241cne4<20<20<2027136282011588347322694278<20120cne10<20<20<20<20<20<2028<2051<2050<20<20<20<20cne11<20<20<20<2065<20<203634395528<202637cne57<20<20<20<2035<203670<20629429248nanammlv<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20<20sequencelisting<110>清华大学<120>一种基于抗体反向表位设计的蛋白质及其在制备抗艾滋病病毒疫苗中的应用<130>cggnqayx-176150<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>227<212>prt<213>artificialsequence<400>1ileargprovalvalserthrglnleuleuleuasnglyserleuala151015gluglugluvalvalileargserserasnphethrasnasnalalys202530valileilevalglnleuasngluservalileileasncysthrarg354045proasnasnasnthrarglysserilehisleuglyglnglyargala505560trptyrthrthrglyglnileileglyaspileargglnalahiscys65707580asnleuserargthrglutrpasnasnthrleulysglnilealalys859095lysleuarggluglnpheglyasnlysthrileilepheasnglnser100105110serglyglyaspprogluilevalmethisserpheasncysglygly115120125gluphephetyrcysasnthrserglnleupheasnserthrtrpasn130135140asnasnserthrtrpasnaspthrseriletrpasnaspthrthrgly145150155160asnaspasnilethrleuprocysargilelysglnileileasnmet165170175trpglngluvalglylysalamettyralaproproilealaglygln180185190ileargcysserserasnilethrglyleuleuleuthrargaspgly195200205glythrasnglusergluthrthrgluilepheargproalaglygly210215220aspmetarg225<210>2<211>681<212>dna<213>artificialsequence<400>2attaggccagtagtatcaacccaactgctgttaaatggcagtttagcagaagaagaggta60gtaattagatctagcaatttcacgaacaatgctaaagtcataatagtacagctgaatgaa120tctgtaataattaattgtacaagacccaacaacaatacaagaaaaagtatacatctagga180caagggcgagcatggtatacaacaggacaaataataggagatataagacaagcacattgt240aaccttagtagaacagaatggaataacactttaaagcagatagctaaaaaattaagagaa300caatttgggaacaaaacaataatctttaatcaatcttcaggaggggacccagagattgta360atgcacagttttaattgtggaggggaatttttctactgtaatacatcacaactgtttaat420agtacttggaataataatagtacttggaatgatactagtatttggaatgatactacagga480aatgacaatatcacgctcccttgcagaataaaacaaattataaacatgtggcaggaagta540gggaaagcaatgtatgcccctcccattgcaggacaaattagatgttcatcaaatattaca600gggttactattaacaagagatggtggtactaatgaaagcgagaccaccgagatcttcaga660cctgcaggaggagacatgaga681<210>3<211>254<212>prt<213>artificialsequence<400>3alaglyphealaileleulyscysasnasplysthrpheasnglythr151015glyprocysthrasnvalserthrvalglncysthrhisglyilearg202530provalvalserthrglnleuleuleuasnglyserleualagluglu354045gluvalvalileargserserasnphethrasnasnalalysvalile505560ilevalglnleuasngluservalileileasncysthrargproasn65707580asnasnthrarglysserilehisleuglyglnglyargalatrptyr859095thrthrglyglnileileglyaspileargglnalahiscysasnleu100105110serargthrglutrpasnasnthrleulysglnilealalyslysleu115120125arggluglnpheglyasnlysthrileilepheasnglnsersergly130135140glyaspprogluilevalmethisserpheasncysglyglygluphe145150155160phetyrcysasnthrserglnleupheasnserthrtrpasnasnasn165170175serthrtrpasnaspthrseriletrpasnaspthrthrglyasnasp180185190asnilethrleuprocysargilelysglnileileasnmettrpgln195200205gluvalglylysalamettyralaproproilealaglyglnilearg210215220cysserserasnilethrglyleuleuleuthrargaspglyglythr225230235240asnglusergluthrthrgluilepheargproalaglygly245250<210>4<211>762<212>dna<213>artificialsequence<400>4gctggttttgcgattctaaagtgtaacgataaaacgttcaatggaacaggaccatgtaca60aatgtcagtacagtacaatgtacacatggaattaggccagtagtatcaacccaactgctg120ttaaatggcagtttagcagaagaagaggtagtaattagatctagcaatttcacgaacaat180gctaaagtcataatagtacagctgaatgaatctgtaataattaattgtacaagacccaac240aacaatacaagaaaaagtatacatctaggacaagggcgagcatggtatacaacaggacaa300ataataggagatataagacaagcacattgtaaccttagtagaacagaatggaataacact360ttaaagcagatagctaaaaaattaagagaacaatttgggaacaaaacaataatctttaat420caatcttcaggaggggacccagagattgtaatgcacagttttaattgtggaggggaattt480ttctactgtaatacatcacaactgtttaatagtacttggaataataatagtacttggaat540gatactagtatttggaatgatactacaggaaatgacaatatcacgctcccttgcagaata600aaacaaattataaacatgtggcaggaagtagggaaagcaatgtatgcccctcccattgca660ggacaaattagatgttcatcaaatattacagggttactattaacaagagatggtggtact720aatgaaagcgagaccaccgagatcttcagacctgcaggagga762<210>5<211>261<212>prt<213>artificialsequence<400>5asnglythrglyprocysthrasnvalserthrvalglncysthrhis151015glyileargprovalvalserthrglnleuleuleuasnglyserleu202530alagluglugluvalvalileargserserasnphethrasnasnala354045lysvalileilevalglnleuasngluservalileileasncysthr505560argproasnasnasnthrarglysserilehisleuglyglnglyarg65707580alatrptyrthrthrglyglnileileglyaspileargglnalahis859095cysasnleuserargthrglutrpasnasnthrleulysglnileala100105110lyslysleuarggluglnpheglyasnlysthrileilepheasngln115120125serserglyglyaspprogluilevalmethisserpheasncysgly130135140glygluphephetyrcysasnthrserglnleupheasnserthrtrp145150155160asnasnasnserthrtrpasnaspthrseriletrpasnaspthrthr165170175glyasnaspasnilethrleuprocysargilelysglnileileasn180185190mettrpglngluvalglylysalamettyralaproproilealagly195200205glnileargcysserserasnilethrglyleuleuleuthrargasp210215220glyglythrasnglusergluthrthrgluilepheargproalagly225230235240glyaspmetargaspasntrpargsergluleutyrlystyrlysval245250255vallysileglupro260<210>6<211>783<212>dna<213>artificialsequence<400>6aatggaacaggaccatgtacaaatgtcagtacagtacaatgtacacatggaattaggcca60gtagtatcaac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