一种DICER1基因及其siRNA的应用的制作方法

本发明涉及抗病毒研究技术领域，更具体的说是涉及一种dicer1基因及其sirna在影响prrsv复制中的应用。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是引起北美，欧洲和亚洲经济损失最严重的猪疾病。该病的病原是prrs病毒(prrsv)，主要造成仔猪呼吸系统疾病，生长性能差，生殖障碍以及子宫内感染等。prrs导致的损失中生殖障碍约占45％，新生仔猪中主要有流产、死胎、木乃伊胎以及呼吸疾病。最严重的时候生殖障碍可导致新生仔猪死亡率达90％。子宫感染中存活的猪在以后成为带毒猪，导致地方性感染畜群。

prrsv可分为欧洲基因型(1型)和北美基因型(2型)，lelystad和vr-2332分别为原型菌株。每种基因型中，病毒可以根据其基因组特征和致病性分为不同的亚型。在中国，hp-prrsv于2006年出现，在nsp2基因中具有两个不连续30aa(29aa+1aa)缺失的遗传标记，导致了2006年全年超过100万头猪的死亡，并已成为亚洲主要的prrsv毒株。最近，nadc30-likeprrsv在中国出现，与nadc30相似。在过去两年中，nadc30-likeprrsv已经扩散到几个省份，成为疫苗接种猪当地的主要毒株。与2006年以来出现并成为中国主要流行株的高致病性prrsv(hp-prrsv)相比，nadc30-likeprrsv的毒力相对较低，导致临床呼吸道症状，猪死亡率为30-50％。接种猪群的nadc30-likeprrsv的爆发预示着目前商业疫苗的无效。

在活细胞中，dicer酶通常在启动rna沉默途径所需的较大蛋白质复合物中起作用。在嗜热四膜虫中，dcr2与rna依赖性rna聚合酶rdr1物理耦合，用于sirnas的生物发生。在黑腹果蝇中，dcr-2与蛋白r2d2相互作用并促进sirna载入到ago2上。在秀丽隐杆线虫中，dcr-1与超过20种其他蛋白因子相关联，并存在于至少两种不同功能复合物中，这些复合物负责启动内源和外源性rna干扰(rnai)途径。除了产生小rna双链体之外，dicer本身还可用作所有这些复合物中的分子支架。machitani等人证明dicer介导腺病毒编码的小rnas加工从而起到负调控腺病毒复制的作用。但是，目前关于dicer1基因突变是否影响prrsv的复制和增殖，还没有相关报道。

因此，提供一种能够影响prrsv复制和增殖的sirna是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种dicer1基因及其sirna在影响prrsv复制中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种靶向dicer1的sirna，所述sirna的序列如下：

正义链：uccagagcugcuucaagca；seqidno.1；

反义链：ugcuugaagcagcucugga；seqidno.2。

进一步，所述靶向dicer1的sirna在抑制宿主因子dicer1表达中的应用。

进一步，所述靶向dicer1的sirna在制备预防和治疗prrsv药物中的应用。

进一步，一种宿主因子dicer1在抑制prrsv复制和增殖中的应用，特异性敲低dicer1的sirna转染pams细胞后，能够有效抑制dicer1的表达，从而抑制prrsv在pams细胞中的复制和增殖。

进一步，一种宿主因子dicer1在开发抗prrsv转基因猪中的应用。

宿主因子dicer1的核苷酸序列如seqidno.3所示。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种dicer1基因及其sirna在影响prrsv复制中的应用，本发明利用sirna特异性敲低dicer1，然后通过qrt-pcr和tcid50检测了dicer1对prrsv感染宿主细胞的影响，并发现此宿主因子dicer1被特异性敲低后能够影响prrsv的复制和增殖，该宿主因子dicer1的特异性sirna可以用于开发预防和治疗prrsv的药物，其对应基因dicer1可用于抗prrsv转基因猪的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明感染hp-prrsvgd-hd毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量；

图2附图为本发明感染hp-prrsvgd-hd毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量；

图3附图为本发明感染hp-prrsvgd-hd毒株时，pams细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数；

图4附图为本发明感染hp-prrsvgd-hd毒株时，pams细胞培养上清液中的病毒滴度；

图1-图4中，dicer1-sirna：在pams中转染针对dicer1的sirna后感染hp-prrsvgd-hd毒株；对照sirna组：pams中转染无关sirna后感染hp-prrsvgd-hd；正常细胞对照：pams感染hp-prrsvgd-hd；空白对照：pams中加入转染试剂后感染hp-prrsvgd-hd；

图5附图为本发明感染n-prrsv毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量；

图6附图为本发明感染n-prrsv毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量；

图7附图为本发明感染n-prrsv毒株时，pams细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数；

图8附图为本发明感染n-prrsv毒株时，pams细胞培养上清液中的病毒滴度；

图4-图8中，dicer1-sirna：在pams中转染针对dicer1的sirna后感染n-prrsv毒株；对照sirna组：pams中转染无关sirna后感染n-prrsv；正常细胞对照：pams感染n-prrsv；空白对照：pams中加入转染试剂后感染n-prrsv；

图9附图为本发明感染nadc30-like毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量；

图10附图为本发明感染nadc30-like毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量；

图11附图为本发明感染nadc30-like毒株时，pams细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数；

图9-图11中，dicer1-sirna：在pams中转染针对dicer1的sirna后感染nadc30-like毒株；对照sirna组：pams中转染无关sirna后感染nadc30-like；正常细胞对照：pams感染nadc30-like；空白对照：pams中加入转染试剂后感染nadc30-like；

图12附图为本发明感染gz11-g1毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量；

图13附图为本发明感染gz11-g1毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量；

图12-图13中，dicer1-sirna：在pams中转染针对dicer1的sirna后感染gz11-g1毒株；对照sirna组：pams中转染无关sirna后感染gz11-g1；正常细胞对照：pams感染gz11-g1；空白对照：pams中加入转染试剂后感染gz11-g1。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

dmem培养基、opti-mem培养基、rpmi-1640培养基以及sirna转染试剂均购于lifetech公司；胰蛋白酶和胎牛血清购于bi公司；sirna序列及引物由上海invitrogen公司合成；faststartuniversalsybrgreenmaster试剂购于roche公司；hs酶，rna提取试剂(rnaisoplus)，反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkit)购于takara公司；pams细胞为(猪肺泡巨噬细胞)分离于6周仔猪的肺脏组织；marc-145细胞(恒河猴肾细胞ma-104的衍生细胞系)，高致病性prrsv毒株gd-hd(genbankid：kp793736.1)、低致病性prrsv毒株ch1a(genbankid：ay032626.1)、nadc30-like、gz11-g1(genbank:kf001144.1)由西北农林科技大学兽医病原生物学实验室保存。

实施例1在pams细胞中敲低dicer1对hp-prrsv复制的影响

(1)dicer1的sirna转染及细胞接毒：

1)铺板：从6周龄的仔猪肺脏组织中分离猪肺泡巨噬细胞，并进行细胞计数与铺板，于37℃5％co2培养箱中培养；

2)转染：转染试剂为lifetech公司的lipofectaminernaimaxreagent，按照转染试剂的操作步骤进行转染。铺板12h后配制转染混合液(dicer1的sirna与lipofectaminernaimaxreagent分别溶于opti-mem中，再将两者混合)室温孵育5min。将24孔板从温箱中取出，用pbs清洗后换成opti-mem，将混合物逐滴加入摇晃混匀，置于细胞培养箱中培养；

3)接毒：转染24h后接毒，以0.01moi接种hp-prrsvgd-hd毒株，根据公式pfu＝细胞个数×moi＝0.7×tcid50计算所需的病毒液。将24孔板取出，用pbs清洗后，加入病毒稀释液，37℃培养1h后弃去所接病毒液，换为血清含量3％的1640培养基；

4)收样：感染后0h、12h、24h和36h收取细胞样品以及细胞培养上清液，-80℃保存。细胞样品用于检测细胞中prrsvorf7基因的相对表达水平，细胞培养上清液用于检测释放到培养液上清中病毒基因组的拷贝数以及病毒滴度。

(2)rt-qpcr检测pams中的dicer1和prrsvorf7mrna相对表达水平：

1)提取细胞中的rna并反转为cdna

使用takara公司rnaisoplus提取pams细胞的总rna。

步骤为：细胞中加入takara公司的rnaisoplus，充分裂解；按照操作说明依次加入氯仿，异丙醇，离心后rna沉于管底；加入75％乙醇清洗rna，待沉淀干燥后，加入适量的rnase-free水进行溶解。

测定rna浓度，纯度及完整性，在biotek微孔定量仪上测定rna浓度及纯度，其od260/od280的比值在1.8-2.0之间，同时进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察所检测rna的5srrna，18srrna和28srrna条带，发现三条带清晰完整。

使用takara公司反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkit)对于所提取的rna进行反转录。

反转录反应体系：为5×primescriptbuffer，2μl；rtenzymemixi，0.5μl；oligodtprimer(50μm)，0.5μl；randomprimer(100μm)，0.5μl；totalrna，500ng；rnasefreeddh2o，补足10μl。

反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃。

2)进行rt-qpcr检测，每个样品需要检测pams中的dicer1和prrsvorf7的mrna表达量，内参都为hprt-1基因，pcr反应体系(10μl)：2×sybrgreenmix5.0μl、ddh2o2.0μl、上游引物(12μm)0.25μl、下游引物(12μm)0.25μl、模板cdna2.5μl。

pcr反应程序为：95℃10min；95℃15s；60℃30s；95℃15s；40个循环。

用real-timepcrsystem仪器的steponesoftwarev2.3软件进行结果的分析。

rt-qpcr引物为：

dicer1-f：gcttgaagcagctctggat；seqidno.4；

dicer1-r：cagctgacacttgttgagca；seqidno.5；

prrsv-orf7-f：agatcatcgcccaacaaaac；seqidno.6；

prrsv-orf7-r：gacacaattgccgctcacta；seqidno.7；

hprt1-f：tggaaagaatgtcttgattgttgaag；seqidno.8；

hprt1-r：atctttggattatgctgcttgacc；seqidno.9。

pams中dicer1mrna的相对表达量结果如图1所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染hp-prrsvgd-hd毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量在0hpi、12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了67.6％、70％、72.8％和62.7％。

prrsvorf7mrna的相对表达量结果如图2所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染hp-prrsvgd-hd毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量在12hpi、24hpi时36hpi，与对照sirna组相比分别降低了66.5％、87.1％和85.2％。

(3)rt-qpcr检测测定细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数：

1)将步骤(1)中所收取的400ul的细胞培养上清液与400ulrnaisoplus混合后进行裂解，提取rna并溶于15μl的rnase-free水中；

2)配置反转录反应体系：5×primescriptbuffer，2μl；rtenzymemixi，0.5μl；oligodtprimer(50μm)，0.5μl；randomprimer(100μm)，0.5μl；totalrna，6.5μl。反转录的反应条件为：37℃，20min；85℃，5s；4℃；

3)制备阳性标准品(含有prrsvorf7基因片段的质粒标准品)并计算细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数：将prrsvorf7完整cds区域(372bp)克隆入pmd-18t载体，转化至trans5α感受态，提取质粒后测序鉴定。测定质粒dna浓度，作为绝对定量的标准品，命名为pmd-18t-orf7(初始浓度为5.5ng/μl)，进行以10为倍数的梯度稀释，根据公式：拷贝数(copies)＝(质量/分子量)×6.0×1023，计算不同稀释度标准品的拷贝数，形成rt-qpcr的标准曲线，用prrsv-orf7rt-qpcr引物进行检测，用realtimepcr分析仪分析数据，计算出每毫升细胞培养上清液中的prrsv基因组拷贝数。

结果如图3所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染hp-prrsvgd-hd毒株12hpi、24hpi和36hpi时，pams培养上清液中prrsv基因组拷贝数与对照sirna组相比分别下降了53.3％、96.5％和96.3％。

(4)tcid50测定细胞培养上清液中prrs病毒的滴度：

1)铺板：将胰酶消化好的marc-145细胞加入适量的含有10％fbs的dmem培养基，调整密度为1×10⁵个/ml，加到96孔细胞培养板中，使细胞长成单层；

2)在灭菌ep管中用无血清的dmem培养基将所收取含有病毒的细胞上清液进行连续10倍稀释，从10^-1～10^-10，每个稀释要充分混合均匀；

3)按稀释度从高到低依次接种到marc-145细胞中，每一稀释度接种一纵排8孔，每孔接种100μl，取两纵排为正常细胞对照；

4)从第二天开始逐日进行观察并记录结果，观察5～7天；

5)参照reed-muench方法对于tcid50进行计算。

结果如图4所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染hp-prrsvgd-hd毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi、24hpi和36hpi时分别下降了0.29-log、0.63-log和0.67-log(p<0.05)。

上述结果表明，敲低dicer1的表达可显著抑制hp-prrsv在pams细胞中的复制。

实施例2在pams细胞中敲低dicer1对n-prrsv复制的影响

(1)dicer1的sirna转染及细胞接毒：

铺板、转染、接毒(0.1moin-prrsvch1a)及收样同实施例1。

(2)rt-qpcr检测pams中的dicer1和prrsvorf7mrna相对表达水平

提取细胞中rna、反转为cdna以及rt-qpcr检测同实施例1。

pams中dicer1mrna的相对表达量结果如图5所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染n-prrsvch1a毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量在0hpi、12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了83.4％、90.3％、71.2％和77.2％。

prrsvorf7mrna的相对表达量结果如图6所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染n-prrsvch1a毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量在12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了96.4％、99.8％和98％。

(3)rt-qpcr检测测定上清样品中prrsv基因组拷贝数

提取细胞培养液上清中rna、反转录、制备阳性标准品(含有prrsvorf7基因片段的质粒标准品)并计算上清样品中prrsv基因组拷贝数同实施例1。

结果如图7所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染n-prrsvch1a毒株12hpi、24hpi和36hpi时，pams培养上清液中prrsv基因组拷贝数与对照sirna组相比分别下降了89.2％、99.4％和99.9％。

(4)tcid50测定细胞培养上清液中prrs病毒的滴度

铺板、倍比稀释含有病毒的细胞上清液、测定、观察以及计算同实施例1。

结果如图8所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染n-prrsvch1a毒株时，细胞培养液上清中的病毒滴度在12hpi、24hpi和36hpi时分别下降了1.7-log、3.0-log和3.3-log(p<0.05)。

上述结果表明，敲低dicer1的表达可显著抑制n-prrsv在pams细胞中的复制。

实施例3在pams细胞中敲低dicer1对nadc30-like复制的影响

(1)dicer1的sirna转染及细胞接毒：

铺板、转染、接毒(0.01moinadc30-like)及收样同实施例1。

(2)rt-qpcr检测pams中的dicer1和prrsvorf7mrna相对表达水平

提取细胞中rna、反转为cdna以及rt-qpcr检测同实施例1。

rt-qpcr引物为：

nadc30-like-orf7-f：atggccagccagtcaatcagctgtg；seqidno.10；

nadc30-like-orf7-r：cccggtcccttgcctctggactggt；seqidno.11。

pams中dicer1mrna的相对表达量结果如图9所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染nadc30-like毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量在0hpi、12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了70.5％、61.1％、65％和80.4％。

prrsvorf7mrna的相对表达量结果如图10所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染nadc30-like毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量在12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了63.9％、80.6％和98.6％。

(3)rt-qpcr检测测定细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数

提取细胞培养上清液中rna、反转录、制备阳性标准品(含有prrsvorf7基因片段的质粒标准品)并计算细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数同实施例1。

结果如图11所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染nadc30-like毒株12hpi、24hpi和36hpi时，pams细胞培养上清液中prrsv基因组拷贝数与对照sirna组相比分别下降了61.7％、71.3％和99.2％。

上述结果表明，敲低dicer1的表达可显著抑制nadc30-like在pams细胞中的复制。

实施例4在pams细胞中敲低dicer1对gz11-g1复制的影响

(1)dicer1的sirna转染及细胞接毒：

铺板、转染、接毒(0.01moigz11-g1)及收样同实施例1。

(2)rt-qpcr检测pams中的dicer1和prrsvorf7mrna相对表达水平

提取细胞中rna、反转为cdna以及rt-qpcr检测同实施例1。

rt-qpcr引物为：

gz11-g1-orf7-f：atggccggtaaaaatcagagccaga；seqidno.12；

gz11-g1-orf7-r：ctaggttgctggcgctgggacttta；seqidno.13。

pams中dicer1mrna的相对表达量结果如图12所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染gz11-g1毒株时，pams中dicer1mrna的相对表达量在0hpi、12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了73.1％、76.8％、94.8％和63.6％。

prrsvorf7mrna的相对表达量结果如图13所示，在pams中转染针对dicer1的sirna后感染gz11-g1毒株时，prrsvorf7mrna的相对表达量在12hpi、24hpi和36hpi时，与对照sirna组相比分别降低了68.4％、68.0％和52.0％。

上述结果表明，敲低dicer1的表达可显著抑制gz11-g1在pams细胞中的复制。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种dicer1基因及其sirna的应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>artificialsequence

<400>1

uccagagcugcuucaagca19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>artificialsequence

<400>2

ugcuugaagcagcucugga19

<210>3

<211>5995

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

ttgaaacactggatgaatgaaaagccctgctttgcaacccctcagcatggcaggcctgca60

gctcatgacccctgcttcctcaccaatgggtcctttctttggactgccatggcaacaaga120

agcaattcatgataacatttatacgccaagaaaatatcaggttgaactgcttgaagcagc180

tctggatcataataccatagtctgtttaaacactggctcagggaagacgtttattgcagt240

actactcactaaagagctgtcctatcagatcaggggagacttcaacagaaatggcaaaag300

gacggtgttcttggtcaactctgcaaaccaggttgctcaacaagtgtcagctgttaggac360

tcactcggatctcaaggttggggaatactcgaacctagaagtaaatgcatcttggacaaa420

agagaaatggaaccaagagtttactaagcaccaggttcttgttatgacttgctctgtcgc480

cttgaatgttttgaaaaatggttacttagcactgtcagacattaaccttttggtgttcga540

tgagtgtcatcttgcaatcctagatcacccctaccgagagattatgaagctctgtgaaaa600

ttgtccatcatgtcctcgtattttggggctaactgcttccattttaaatgggaaatgtga660

tccagaggaattggaagaaaagatacagaaactggagaaaattcttaagagtaatgctga720

aactgcaactgacttggtggtcttagacagatatacttctcagccatgtgagattgtggt780

agactgtggaccatttactgacagaagtgggctttatgaaagactgctgatggaattaga840

agaagctctcaattttatcaatgactgtaacatagctgtacattcaaaagaaagagattc900

tactttaatttccaaacagatactgtcagactgtcgtgcagtattggtagttctgggacc960

ttggtgtgcagataaagtagctggaatgatggtaagagaactacagaaatatatcaaaca1020

tgaacaagaggagctgcacaggaaatttctattgtttacagacactttcctgaggaaagt1080

acacgcgctgtgtgaagggcacttctcccctgccgcgcttgacctgagatttgtgactcc1140

taaagtcataaaactgctcgaaatcttacgcaagtacaaaccctacgagcgacagcagtt1200

tgaaagcgttgagtggtataataataggaatcaggataattacgtgtcttggagtgattc1260

ggaggatgatgaggaggacgaagaaattgaagaaaaagaaaagccggagacgaattttcc1320

ttctccatttaccaatattttatgtggaattatttttgtggaaagaagatacacggcagt1380

tgtcttaaacagattgataaaggaagctggcaaacaagatccagagctggcttacatcag1440

cagcagcaattttataactggacatggcattggaaagaatcagcctcgtaacaaacagat1500

ggaagcagaattcagaaaacaggaagaggtacttaggaaatttcgagctcacgaaaccaa1560

cctgctgattgccacgagcattgtggaagagggtgttgatataccaaaatgcaacctggt1620

ggttcgtttcgatctgcccacagagtatcgatcctacgttcagtctaagggaagagcaag1680

ggcgccaatctctaattacgtcatgttagcagatacggacaaaataaagagttttgaaga1740

agaccttaaaacatacaaagctattgaaaagatcttgagaaacaaatgctccaagtccgt1800

tgagagtggggagaccgaccttgagcccgtggtggatgacgacgacatcttcccccccta1860

cgtgctgcggcccgacgatggcggtccccgggtcaccatcaacacggccattggacacat1920

caacagatactgtgctagattacccagtgacccgtttactcatctggctcctaagtgtag1980

aacccgagagttgcctgatggtacattttattcaactctttatctgccaattaattcacc2040

tcttcgagcctccattgttggccccccaatgagctgtatacgattggctgaaagagtcgt2100

ggctctcatttgctgtgaaaaactgcacaaaattggtgaactggatgaccatttgatgcc2160

ggttgggaaagagacggttaaatacgaagaggagcttgatttacatgatgaggaggagac2220

cagtgttccaggaagaccaggctccacaaaacgaagacagtgctacccaaaagcgattcc2280

agaatgtttgcgggacagctaccccaagcccgatcagccctgttacctgtatgtgatagg2340

gatggttctgacaacacctctccccgatgaactcaactttagaaggcggaagctctatcc2400

ccccgaggacaccacaagatgcttcggaatactgacagccaaacccatacctcagattcc2460

tcactttcctgtgtacacacgctctggagaggtcaccatttccattgagttgaagaagtc2520

tggtttcacgctgtctctgcaaatgcttgagctgattacaagacttcaccagtatatatt2580

ttcacatattcttcggcttgagaaacctgcactagagtttaaacccaccgacgctgactc2640

agcatactgtgttctacctcttaatgtcgttaatgactccagcactttggacattgactt2700

taaattcatggaagacatcgagaaatcagaagctcgcataggcattcccagtacaaagta2760

ttcaaaagaaacaccttttgtttttaaattagaagattaccaagatgcagttatcattcc2820

aaggtatcgcaattttgatcagcctcatcgattttacgtagctgatgtgtacactgatct2880

taccccactgagtaaatttccttcccctgagtatgaaacttttgcagaatattataaaac2940

gaagtataaccttgacctgaccaatctcaaccagccgctgctggatgtggaccacacatc3000

gtcaagacttaatcttttgacacctcgccatttgaatcagaaggggaaagctcttcctct3060

gagcagcgctgaaaagaggaaagccaaatgggagagtctgcagaacaaacagatcctggt3120

tccggaactctgtgctatccatccaattccagcatcactgtggagaaaagcagtctgtct3180

ccccagcatcctttatcgccttcactgccttctgaccgcggaggagctaagagcccagac3240

ggccagcgatgctggtgtgggagtcagatcacttcccgtggattttagataccccaactt3300

agacttcgggtggaaaaaatccatcgacagcaaatctttcatctcagttgctaactcctc3360

ttcagctgaaaacgagaactactgtaagcacagccccctcgtccctgaacatgctgcaca3420

tcgaggtgctaaccgaccctccgctctcgaaaatcacggccacacgtctgtgacctgccg3480

agcgctcctcagcgagtcccctgctaagctcccgatcgacgttgcaacagatctgacagc3540

agtgaacggtctttcgtacaataaaaatcttgccaatggcagttacgacttagctaacag3600

agacttttgccaaggaaatcatctgagttactacaagcaggaaatacctgtacaaccaac3660

tacctcatatcccattcagaatttatacaattacgagaaccagccccagcccagcgatga3720

atgtactctactgagtaataaataccttgatggaaatgctaacaaatctacctcagaagg3780

acgtcccacgatgcctggtactacagaggctggtaaggcgctttcggaaaggatggcttc3840

tgcgcagagccctgctccgggctactccccgaggactcctggcccaaaccctggactcat3900

ccttcaggctctgaccctttcaaacgctagcgacggatttaacctggagcggctcgaaat3960

gctcggtgactccttcttaaagcacgccatcaccacgtatctcttttgcacttaccctga4020

tgctcacgagggccgcctttcgtatatgagaagcaaaaaggtcagcaactgtaacctgta4080

tcggcttgggaagaagaagggcctgcccagccgcatggtggtgtcgatatttgatccccc4140

tgtgaactggcttcctcctggttatgtagtaaatcaagacaaaagtaacacagacaaatg4200

ggaaaaagatgaaatgacaaaagactgcgtgctggctaacggcagactggacgccgacct4260

ggaggaggaggacgccgccgcgctcatgtggaggccgcccagggaggaggccgaggacga4320

cgaggacctcctggagtacgaccaggagcacatcaggttcatagacagcatgctgatggg4380

gtcaggagccttcgtcaagaagattgctcttgctcccttcgccgccgccgatcctgccta4440

cgaatggaagatgcccaaaaaggcccccctggggagcatgcccttttccgcagatttcga4500

ggactttgactacagctcgtgggatgccatgtgctatctggaccccagcaaagccgttga4560

ggaggatgactttgtggtgggcttctggaatccatccgaagagaactgtggtgtggacac4620

aggcaaacagtccatttcttacgacttgcacacggagcagtgcatcgctgacaaaagcat4680

cgccgactgtgtggaagccctgctgggctgctacttgaccagctgtggcgagcgggccgc4740

tcagctcttcctctgctcgctgggcctgaaggtgctcccggcggtgaagaggaccgatcg4800

ggcacaggccgcctgcccggccagggagagcttcaccagccaacaaaagaccctttccgg4860

gggccggcccgccgccggctcccgctcttccgggttgaaagacttggagtacggctgttt4920

gaagatcccaccgagatgtatgtttgatcacccagacgcagacaggacactcagtcacct4980

catctcgggctttgagaacttcgaaaggaagatcaactacagcttcaagaataaggctta5040

ccttctgcaggccttcacccacgcctcctaccactacaacaccatcaccgattgttacca5100

gcgcctggagttcctgggagatgccattctggactacctcataaccaagcacctttacga5160

agacccgcggcagcactccccgggggtcctgaccgacctgcgctctgctctggtcaacaa5220

caccatcttcgcctcgctggccgtcaagtacgactaccacaagtacttcaaggccgtgtc5280

gcccgagctcttccacgtcatcgatgattttgtgcagtttcagcttgagaagaacgagat5340

gcaggggatggattctgagcttaggagatctgaggaggatgaagagaaagaagaggatat5400

tgaagttccgaaggccatgggggacatttttgagtcgcttgctggtgccatttacatgga5460

tagtggaatgtcactggaggtggtttggcaggtgtactatccgatgatgcggccgctaat5520

agaaaaattttctgcaaacgtgccccgttcgcctgtgcgagaattgcttgaaatggaacc5580

agaaaccgccaaatttagcccggctgagagaacttacgatggcaaggtcagagtcaccgt5640

ggaagtcgtaggaaaggggaaattcaaaggtgttggccgaagttacaggattgccaaatc5700

tgcagcagcacgacgagccctgcgaagcctcaaagctaatcaacctcaggttcccaacag5760

ctgaaacccctttttaaaataacgaaaagaagcagagttaaggtggaaaatatttaagtg5820

gaaaaggatgatttaaaattggcagtgagtggaatgaattgaaggcagaagttaaagttt5880

gataacaagctagattgcagaataaaacatttaacatatgtataaaacctttggaactaa5940

ttgtagttttagttttttgcgcaaacacaatcttgtcttctttcctcacttctgc5995

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

gcttgaagcagctctggat19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

cagctgacacttgttgagca20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>6

agatcatcgcccaacaaaac20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>7

gacacaattgccgctcacta20

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>8

tggaaagaatgtcttgattgttgaag26

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

atctttggattatgctgcttgacc24

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>10

atggccagccagtcaatcagctgtg25

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>11

cccggtcccttgcctctggactggt25

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>12

atggccggtaaaaatcagagccaga25

<210>13

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>13

ctaggttgctggcgctgggacttta25