一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法。

背景技术：

化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大问题，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。早期的微生物蛋白主要是来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(icp),新型微生物蛋白主要是蛋白激发子类物质，目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有过敏蛋白(harpin)、隐地蛋白(cryptogein)和激活蛋白(activator)，这些蛋白质不直接杀灭害虫和病原物，也不直接提供营养物质，而是在促进植物生长发育和对营养物质的吸收、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑形作用方面有广泛应用前景。因此，它们可以配制成生物制品，应用到以上方面。

这些新型微生物蛋白或多肽大都通过发酵重组大肠杆菌等生物工程菌来实现大批量生产，在发酵后的下一步工艺为溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放微生物蛋白或多肽。细胞溶解的方法有非化学的方法，如高压或超声波处理，使用该方法对设备要求较高，能耗高且难以大规模应用。作为另外的选择，大部分厂商采用将细胞悬浮液与溶菌酶接触来进行，之后还需要进行40-42℃消化，离心去细胞碎片和变性蛋白，以及蛋白纯化工艺以达到需要的纯度。这些工艺操作复杂，成本昂贵，且由于步骤多，过程冗长，会降低微生物蛋白和多肽的收率，并降低它们的生物活性和稳定性。

因此，需要有步骤简便、成本低廉的方法用于这类新型微生物蛋白或多肽的生产。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种简便、快速的利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法，基于该制备方法本发明还提供了一种农用抗菌抑菌剂。

本发明第一方面提供了一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法，步骤包括：

s1、将隐地蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中；

s2、将步骤s1所得质粒转入短短芽孢杆菌宿主中；

s3、发酵培养步骤s2所得短短芽孢杆菌，所述发酵培养的培养条件为：t2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h；

s4、收集发酵后的菌液，分离提取隐地蛋白液；所述分离提取方法包括：离心菌液收集上清，对上清液进行切向流超滤获得滤液、超滤浓缩滤液即得隐地蛋白液。

上述方法相比于常规的隐地蛋白制备工艺，避免了透析、蛋白层析等繁琐、昂贵的纯化步骤，能够简便快速的获取高纯度的隐地蛋白，且所得的隐地蛋白液可直接用作农用抗菌抑菌剂，能够达到明显促进植物生长的效果，使隐地蛋白工业化生产及应用成为可能，具有良好的应用前景。

优选的，步骤s1中，所述质粒为pnc-hist质粒。

更加优选的，步骤s2中，所述质粒的结构区域包括：隐地蛋白、分泌信号肽、t2启动子、核糖体结合位、复制子repb；在大肠杆菌中复制的氨苄抗性基因ampr及复制起始区oric；在短短芽孢杆菌中复制的新霉素抗性基因nmr及复制起始区ori。

进一步的，本发明对于隐地蛋白的分离、提纯工艺进行了优化，有效简化了工艺流程。

优选的，步骤s3中，所述发酵培养的培养条件为：t2培养基、温度33℃、转速120rpm、发酵培养时间48h。

优选的，步骤s4中，所述分离提取步骤包括：采用10kd孔径的中空纤维柱进行超滤，回收滤液采用3kd孔径的中空纤维柱浓缩多次。

更加优选的，步骤s4中，所述回收滤液采用3kd孔径的中空纤维柱浓缩三次步骤包括：采用3kd孔径的中空纤维柱将滤液浓缩10倍后得一次浓缩液，加入与一次浓缩液等体积的缓冲液后再次浓缩得二次浓缩液，再加入与二次浓缩液等体积的缓冲液后进行第三次浓缩得三次浓缩液，再加入与三次浓缩液等体积的缓冲液后进行第四次浓缩得隐地蛋白液；所述缓冲液配方为：50mmtri-hcl、300mmnacl、1mmedta、2mmdtt。

本发明第二方面提供了一种农用抗菌抑菌剂，将上述制备方法制备得到的隐地蛋白液，直接作为农用抗菌抑菌剂。

目前暂无以隐地蛋白为有效成分的农用抑菌抗菌剂，已见报道的多为另一种植物超敏反应激发剂harpin蛋白为有效成分的农用抑菌抗菌剂，该类农用抑菌抗菌剂使用了重组表达harpin蛋白的细菌裂解物，直接将细菌裂解物施用于农作物上，表达宿主主要选择的是大肠杆菌。而细菌自身的有害成分(如大肠杆菌细胞壁中的内毒素)，有可能污染农作物；且工程菌株携带的人为改造的优势基因(如抗生素抗性基因)，其基因扩散有可能造成生态环境的污染等后果。本发明以上述制备方法制备得到的高纯度蛋白溶液直接作为农用抑菌抗菌剂，避免采用细菌裂解物，且有效成分浓度高，杂质污染物、蛋白活性抑制剂含量低，比使用简单的细菌裂解物能产生更好的施用效果，且有效避免了作物污染及生态环境污染等不良后果，具有良好的实际应用价值。

优选的，所述隐地蛋白溶液直接喷施在农作物植株上，所述农作物为番茄。在本发明的实施例中对番茄植株喷施所述隐地蛋白溶液获得了显著的促生长效果，但本隐地蛋白溶液适用的农作物并不局限于番茄这一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明有效简化了隐地蛋白的提纯工艺，避免了透析、蛋白层析等繁琐、昂贵的纯化步骤，可简便、快速的获取高纯度隐地蛋白，使隐地蛋白工业化生产及应用成为可能。

(2)本发明制备得到的高纯度隐地蛋白可用作农用抗菌抑菌剂，直接喷施于植株可显著促进植物生长，使植株健壮，各种主要的植物学和生理学指标都得到明显的提高，且无毒无污染，喷施简单易行，易被农户接受，便于推广，具有良好的实际应用价值。

附图说明

图1转入短短芽孢杆菌中分泌表达目的蛋白(cryptogein)的pnc-cryptogein质粒的图谱，以圆环示意环状质粒dna分子，基因表达方向在片段末端以箭头显示；该质粒的结构区域包括：cryptogein蛋白、分泌信号肽(secretionsignalpeptide)、基因启动子(t2promoter)、核糖体结合位(rbs)、复制子(repb)；在大肠杆菌中复制的氨苄抗性基因(ampr)及复制起始区(oric)；在短短芽孢杆菌中复制的新霉素抗性基因(nmr)及复制起始区(ori)。

图2为不同发酵条件的ph和od595随培养时间的变化曲线图，由左图表可知ph与温度成反比，由右图表可知od595与温度成正比，结合两个图表可知ph和od595随培养时间呈先上升后下降的趋势。

图3为纯化后的短短芽孢杆菌分泌表达的cryptogein蛋白的电泳图，图中泳道1为蛋白分子量标准，单位千道尔顿(kd)；泳道2为发酵上清液；泳道3发酵上清经一步超滤浓缩后样品；泳道4、5分别为第一次和第二次洗滤的样品；泳道6-10表示洗滤三次后的cryptogein目的蛋白溶液(约10kd)从原液到16倍稀释进行的2倍梯度稀释样品；泳道11-15表示小牛血清蛋白(bsa)从2mg/ml到0.125mg/ml进行2倍梯度稀释样品。

图4为不同处理下番茄植物学性状，左图为清水对照组处理区的番茄作物植物学性状实物图；右图为试验组处理区的番茄作物植物学性状实物图。喷施cryptogein隐地蛋白的番茄作物植株更健壮，相比常规施肥增产可达12.8％。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明第一方面提供了一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法，步骤包括：

s1、将隐地蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的pnc-hist质粒中。

s2、将步骤s1所得质粒转入短短芽孢杆菌宿主中；所述质粒的结构区域包括：隐地蛋白、分泌信号肽、t2启动子、核糖体结合位、复制子repb；在大肠杆菌中复制的氨苄抗性基因ampr及复制起始区oric；在短短芽孢杆菌中复制的新霉素抗性基因nmr及复制起始区ori。

s3、发酵培养步骤s2所得短短芽孢杆菌，所述发酵培养的培养条件为：t2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h；在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的条件优选为：t2培养基、温度33℃、转速120rpm、发酵培养时间48h。

s4、收集发酵后的菌液，分离提取隐地蛋白液；所述分离提取方法包括：离心菌液收集上清，对上清液采用10kd孔径的中空纤维柱进行切向流超滤获得滤液，回收滤液，采用3kd孔径的中空纤维柱将滤液浓缩10倍后得一次浓缩液，加入与一次浓缩液等体积的缓冲液后再次浓缩得二次浓缩液，再加入与二次浓缩液等体积的缓冲液后进行第三次浓缩得三次浓缩液，再加入与三次浓缩液等体积的缓冲液后进行第四次浓缩得隐地蛋白液；所述缓冲液配方为：50mmtri-hcl、300mmnacl、1mmedta、2mmdtt。

本发明第二方面提供了一种农用抗菌抑菌剂，将上述制备方法制备得到的隐地蛋白液，直接作为农用抗菌抑菌剂，所述隐地蛋白液能够直接喷施在农作物植株上而发挥作用，所述农作物为番茄。

下面将结合具体实施例对本申请的利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法进行详细说明。

实施例1、隐地蛋白(cryptogein)的序列获取

来源于菌株phytophthoracryptogea编码cryptogein蛋白的序列已经公开(genebank编号：caa84224.1)。隐地蛋白(cryptogein)基因的获得可以采用基因合成、pcr扩增、提取染色体dna并建立文库等行业内公知的技术。本发明采用基因合成方法，将隐地蛋白(cryptogein)氨基酸序列送合成(中国苏州金唯智生物科技公司)，合成时在目的序列的上游引入pstⅰ酶切位点序列，下游引入hindⅲ酶切位点序列。

实施例2、构建pnc-cryptogein质粒

质粒的原始骨架为pbu110，经商业公司改造为pnc-hist(购自takara公司)，其载体多克隆位点区有pstⅰ和hindⅲ限制性酶切位点各一个，且整个载体有且只有一个pstⅰ和hindⅲ酶切位点。我们将上述质粒骨架dna及cryptogein蛋白基因合成片段经pstⅰ和hindⅲ限制性内切酶处理后，使用t4连接酶连接成环状dna并使用化学转化法转化进入大肠杆菌jm109感受态细胞中。经细胞培养以及碱裂解法抽提质粒，获得了可以转入短短芽孢杆菌中分泌表达目的蛋白的pnc-cryptogein质粒，该质粒的图谱见图1。质粒序列的正确性经过了测序确认(中国苏州金唯智生物科技公司)。

将测序正确的质粒经电击转化法转入短短芽孢杆菌(株系名称brevibacillus.choshinensissp3，购自takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)电转感受态细胞中，经菌落pcr以确认阳性转化子，单克隆阳性转化子在含有新霉素的2sy培养基过夜培养并保藏菌种。

实施例3、cryptogein蛋白的分泌表达

将上述获得的阳性转化子在t2培养基中进行小量发酵筛选最佳表达条件。设置如下条件进行筛选：

(1)两个温度条件，分别是30℃和33℃，

(2)摇床转速三个条件，分别是120rpm，160rpm和200rpm进行正交实验，

(3)在24h、48h、72h和90h四个培养时间点取1ml培养液，其中200μl培养液进行od595测定以及ph值测试，剩余800μl离心分离培养上清液和芽孢杆菌细胞进行sds-page胶电泳检测目的蛋白表达量(跑胶结果图未展示，部分数据以图2展示)，综合分析数据结果，选定了其中最优的表达条件为：转速120rpm，发酵温度33℃，发酵时间48h。

以上述最优培养条件培养发酵阳性转化子，发酵后以10000×g，4℃的条件离心10min分离细胞和上清液。

实施例4、cryptogein蛋白的分离

培养上述步骤中分离获得的培养上清液经切向流超滤技术(tff)将目的蛋白分离同时换至保存缓冲液中。目的蛋白cryptogein分子量大小约10kd，上清中主要条带为目的蛋白和脱落的细胞壁蛋白，几乎无其他明显杂蛋白，细胞壁蛋白大小约120kd。此步骤包括一步超滤浓缩和三次洗滤。超滤系统为“新一代kr2i切向流过滤系统”(瑞普利金(上海)生物科技有限公司)型号syr2-u20-a。选用10kd孔径的中空纤维柱(d02-e030--05-n,mpes/30kd,115cm²)对400ml培养上清进行超滤，细胞壁蛋白被截留，目的蛋白滤过。回收滤过液选用3kd孔径的中空纤维柱(d02-e010--05-n,mpes/10kd,115cm2)进行目的蛋白的浓缩，浓缩10倍即约40ml时加入等体积40ml的缓冲液(50mmtri-hcl(ph8.0)、300mmnacl、1mmedta、2mmdtt)，再次浓缩至40ml时加入等体积40ml的同种缓冲液，第三次浓缩至40ml时再加入等体积40ml的同种缓冲液，最后继续浓缩至10ml左右，最终获得cryptogein蛋白液13ml。此步骤将蛋白换至缓冲液(50mmtri-hcl(ph8.0)、300mmnacl、1mmedta、2mmdtt)中，同时细胞壁蛋白被超滤膜截留分离，获得较纯的cryptogein蛋白液，结果见图3。

向cryptogein蛋白液中补加50％的甘油，于-20℃长期保存。

实施例5、cryptogein蛋白在番茄作物上的应用及效果

试验选定湖北省黄冈市现代农业展示与信息中心蔬菜基地种植的品种为“美国红帅”的番茄作物，该作物于2018年1月25日播种育苗，3月13日移栽，6月25日收获完毕。种植土壤为潮土沙泥土，质地中壤。土壤有机质21.8g/kg，全氮1.12g/kg，速效磷13.5mg/kg，速效钾123.0mg/kg，ph值6.8。且在不同生长期做不同的常规施肥处理，分别为番茄移栽前，每亩基施饼肥150kg；番茄苗期，每亩施用尿素20kg；坐果期，每亩追施俄罗斯产复合肥(n、p2o5、k2o百分含量均为16)50kg。

按照随机区组实验设计，每试验小区面积为20m²。

将按照上述方法纯化cryptogein蛋白液按终浓度50μg/ml喷雾施用结合常规施肥处理为实验组，等量清水结合常规施肥处理为对照组1，只做常规施肥处理作为对照组2，分别做4组重复。试验分别于番茄苗期、花芽分化期、初花期、幼果期、进行喷施处理。根据试验观察，番茄在苗期喷施隐地蛋白后，植株长势较旺，功能叶面积较大。花芽分化期调查结果，与等量清水处理比较，隐地蛋白处理单株开花数多6.5％，株高高1.2cm，单株结果数多1.9个，单果重4.3g。据番茄成熟期观察，隐地蛋白处理的番茄大小均匀，果实色泽光亮，外观品质较好。这说明含有隐地蛋白对番茄生物性状有良好的影响，从而为提高番茄产量奠定良好基础。

表1不同处理下4组实验小区产量实收结果

在三个处理中，隐地蛋白处理产量较高，分别比等量清水处理结合常规施肥和只做常规施肥处理增产12.2％和12.8％。针对表1的结果进行方差分析和lsr法分析，见表2和表3。

表2试验结果方差分析

试验结果经方差分析(表2)，区组间差异不显著，处理间均差达到显著水平。

表3试验结果新复极差(lsr法)测验

进一步通过新复极差(lsr法)测验结果，隐地蛋白处理与等量清水处理和常规施肥处理间差异都达到显著水平，而等量清水处理与常规施肥处理间差异不显著，这说明含有隐地蛋白具有显著的增产效果。

结合三个表的数据可总结如下，与等量清水处理比较，隐地蛋白处理每亩增产番茄336.5kg增加产值1009.50元，除去隐地蛋白投资39.20元，每亩增加纯收益970.30元，隐地蛋白产投比为25.75︰1。由此说明本发明提供的隐地蛋白液抗菌抑菌剂在番茄上应用是一项投资少、收益高的重要物化技术措施。同时隐地蛋白无毒无污染，喷施简单易行，易被农户接受，便于推广。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。