一种二代测序文库构建用接头以及文库构建方法与流程

本发明涉及一种二代测序文库构建用接头，本发明还涉及一种二代测序文库构建方法，属于测序技术领域。

背景技术：

华大智造下一代测序技术dnbseq^tm已经应用于测序仪器中，如mgiseq-t7。其测序文库构建主要流程是1将待测基因组进行片段化；2将片段化dna进行末端修复以及于3’端加da尾；3通过a/t连接方式将t尾的带茎环接头与修复加a尾的目的片段进行连接；4接着通过特异双引物对连接产物进行扩增，获得带接头序列的标准双链dna片段；5再通过桥接单链(ad153_splintoligo)将单链扩增产物两端进行桥接，利用连接酶连接原接头两端间的缺口，实现单链环化；6最后通过滚环扩增获得待测序的文库。现有技术步骤较多，中间每一个环节的效率都会影响最终的建库转化效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种二代测序文库构建用接头以及文库构建方法，以解决上述问题。

本发明提供一种二代测序文库构建方法，其特征在于，包括：

步骤一：合成以下序列：

5’-agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaannnnnnnnnnnnnncaactccttggctcacatgtgagccaaggagttgnnnnnnnnnnnnnnttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt-3’

其中，从第32位碱基到第41位以及从第83到92位的n为样本标签序列，在整体序列上构成回文结构；其中，从第32位碱基到第41位以及从第83到92位的n为样本标签序列，其长度范围是6至15个碱基，

从第42位到第45位以及从第79位到第82位的n为随机分子标签序列，从第8位到第18位的碱基以及从第106位到第122位的序列在整体上会形成茎环结构，随机分子标签中的碱基数量为2-6个；

3’末端的一个t在整体序列上不构成双链，以单核苷酸悬于接头末端；

步骤二：退火形成双茎环接头，纯化回收接头，使接头浓度得到浓缩，-20℃储存备用；

步骤三：合成以下序列：

5-ttgtcttcctaagaccgcttggcct-3，该序列为等温扩增引物；

步骤四：基因组片段化：

通过超声破碎仪将基因组dna片段化，分选获得预定大小的片段化dna；

步骤五：对片段化dna的末端修复并加da尾；

步骤六：接头连接：完成双茎环接头和目的dna片段的连接，dna目的片段两端连接有双茎环接头，再通过磁珠纯化回收目的dna片段；

步骤七：等温扩增：以上述接头连接产物为模板，利用等温扩增引物和neb的phi29dna聚合酶，进行等温扩增，滚环复制；

步骤八：纯化回收扩增产物，测序备用。

作为优选，本发明的二代测序文库构建方法，还具有这样的特征：从第32位碱基到第41位为样本标签序列，在每一种标签中分别设置为预定的固定序列。

作为优选，本发明的二代测序文库构建方法，还具有这样的特征：步骤二中通过低浓度退火形成双茎环接头，低浓度退火的浓度为10μm。

作为优选，本发明的二代测序文库构建方法，还具有这样的特征：步骤二中样本标签序列的长度为10个碱基。

作为优选，本发明的二代测序文库构建方法，还具有这样的特征：步骤二中分子标签序列在整体序列上会形成茎环结构。

作为优选，本发明的二代测序文库构建方法，还具有这样的特征：步骤二中分子标签中的碱基数量为4个。

发明的有益效果

本发明的二代测序文库构建用接头以及文库构建方法，具有如下优点：

1.减少额外的步骤，提高最终的转化效率，增加原始基因拷贝的保留率，同时避免双链扩增引入的错配；

2.引入分子标签，结合串联纠错，增强和优化了生信分析能力，促进对扩增和测序引入的误差的去除，保留了对原始片段错配信息的分析。

附图说明

图1是本发明接头连接的示意图；

图2是本发明进行滚环复制的示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式来详细说明本发明的技术方案。

一、接头设计与合成

1.合成以下序列：

5’-agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaannnnnnnnnnnnnncaactccttggctcacatgtgagccaaggagttgnnnnn’n’n’n’n’n’n’n’n’n’ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt-3’

其中，从第32位碱基到第41位以及从第83到92位的n为样本标签序列，在整体序列上构成回文结构；其中，从第32位碱基到第41位以及从第83到92位的n为样本标签序列，其长度范围是6至15个碱基，在本实施方式中，样本标签序列设置为10个碱基。

从第42位到第45位以及从第79位到第82位的n为随机分子标签序列，从第8位到第18位的碱基以及从第106位到第122位的序列在整体上会形成茎环结构，随机分子标签中的碱基数量为2-6个；在本实施方式中，随机分子标签的碱基数量设为4个。

3’末端的一个t在整体序列上不构成双链，以单核苷酸悬于接头末端。

2.退火形成双茎环接头：结构如下所示：

通过低浓度退火形成双茎环接头，再利用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs^tmsmarterdnacleanbeads纯化回收接头，使接头浓度得到浓缩，-20℃储存备用。本实施方式中的低浓度退火所采用的浓度是：10μm。

二、文库扩增引物设计与合成

合成以下序列：

5-ttgtcttcctaagaccgcttggcct-3

该序列为等温扩增引物。

三、dnb文库构建

1.基因组片段化：

通过covaris超声破碎仪将基因组dna片段化，通过磁珠分选获得相应片段大小的片段化dna；

2.dna片段末端修复和加da尾：

利用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs^tmmaxupiidnalibraryprepkit的末端修复模块完成片段化dna的末端修复和加一个da尾；

3.接头连接：

利用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs^tmmaxupiidnalibraryprepkit的连接模块完成双茎环接头和目的dna片段的连接，再通过磁珠纯化回收目的dna片段；如图1所示，中间一段为dna片段，两端为本发明的双茎环接头。

连接产物示意图，蓝色dna目的片段双端连接有双茎环接头；

4.等温扩增：

以上述接头连接产物为模板，利用等温扩增引物和neb的phi29dna聚合酶，进行等温扩增，滚环复制，滚环复制的方式如图2所示。引物结合目的序列，实现等温扩增，滚环复制。

5.产物纯化会后：

利用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs^tmdnaselectionbeads纯化回收扩增产物，测序备用。

本实施方式的分子标签适用于mgiseq平台。

作为对照，本发明使用背景技术中提到的mgiseq平台传统的文库构建方法进行文库构建，计算出其转化效率为18％，使用本发明的构建二代测序文库的方法，文库构建的转化效率为30％，较传统的方法，效率提升了50％到80％。

序列表

<110>上海雅鉴生物科技有限公司

<120>一种二代测序文库构建用接头以及文库构建方法

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