一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒。
背景技术：
：人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus；hiv)，即艾滋病(aids，获得性免疫缺陷综合征)病毒，它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(lentivirus)，属逆转录病毒的一种。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。因为hiv病毒直接攻击的是人体cd4-t淋巴细胞系统，免疫系统被不可逆转的破坏，病毒一旦侵入机体细胞，就和人体细胞整合到一起终生难以消除。艾滋病人随后感染其他各种疾病后无法治愈，并可发生恶性肿瘤，病死率极高。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，人类免疫缺陷病毒i型(感染)在一类致癌物清单中。艾滋病在感染后可具有较长的无症状潜伏期，在潜伏期期间hiv感染者通过性接触、血液接触、母婴传播进一步感染健康人群，给社会带来极大的卫生安全威胁。2011年全球新增艾滋病病毒感染者250万，hiv感染相关的死亡人数约为170万。中国大陆1985年发现首例艾滋病病毒感染者至今，艾滋病在我国流行日益严重，形势严峻。hiv感染的整体防治形式依然非常严峻，高质量、高性价比的hiv检测初筛试剂有着极大的市场需求。控制艾滋病流行的关键，还是加强对人群hiv筛查、早期诊断和疫情遏制，因此高灵敏度，窗口期短的hiv检测方法对控制hiv传播有重大意义。艾滋病病人样本具有极端生物危害风险；只有在最高级别的生物防护条件下才可进行检测。艾滋病病毒感染可通过若干类型的实验室检测获得明确诊断，如：抗体捕获酶联免疫吸附试验(elisa)、抗原检测试验、血清中和试验、realtimert-pcr检测和病毒分离培养。血清学中和试验、病毒分离培养具有安全风险高、灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点，并不适用于要求快速高通量的人群初筛。抗原抗体检测方法，灵敏度较好，反应迅速，明显的缺点是艾滋病感染初期会有1-3个月的“窗口期”，这期间病人血清中没有足量的抗体产生反应，抗原抗体检测结果呈阴性或不确定性，不利于艾滋病病毒感染的早期诊断，造成漏检，可能导致hiv传播风险；艾滋病末期抗体也明显下降，不利于检测跟踪。普通pcr灵敏度较低，hiv变异度非常高，流行的亚型非常多，检出效果不理想。因此，本领域迫切需要开发能够高灵敏度，窗口期短hiv检测方法以满足临床需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒。本发明的第一方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)的pcr引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如seqidno.:1所示的正向引物；和，如seqidno.:2所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如seqidno.:4所示的正向引物；如seqidno.:5所示的正向引物；和，如seqidno.:6所示的反向引物。本发明的第二方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型的探针组，所述探针组包括：如seqidno.:3所示的针对ltr基因保守序列的特异性的探针。在另一优选例中，所述探针组还包括：如seqidno.:7所示的针对gag基因保守序列的特异性的探针。本发明的第三方面，提供了一种用于检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，所述试剂盒包括hiv-1反应液a，所述hiv-1反应液a包括本发明第一方面所述的pcr引物对组。在另一优选例中，所述hiv-1反应液a还包括本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒还包括所述hiv-1反应液b，所述hiv-1反应液b包括选自下组的一种或多种组分：热启动taq酶、逆转录酶、和dntps。在另一优选例中，所述试剂盒还包括hiv-1定量参考品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括hiv-1强阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括hiv-1临界阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括内标质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括逆转录试剂。本发明的第四方面，提供了一种检测人类免疫缺陷病毒1型的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测样本，所述样本中含有hiv-1rna；(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应，绘制扩增曲线，并计算阈值循环值从而获得样本核酸的定量检测结果：其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、用于将待检测样本中hiv-1rna逆转录为cdna的逆转录试剂、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量。应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1：20份灵敏度参考品rt-pcr扩增曲线；图2：准确性参考品l0～l8的rt-pcr扩增曲线；图3：定量线性范围的标准曲线；图4：1.0×105iu/ml精密度参考品扩增曲线；图5：1.0×104iu/ml精密度参考品扩增曲线；图6：1.0×103iu/ml精密度参考品扩增曲线。图7针对ltr基因单重体系的扩增产物图8针对gag基因单重体系的扩增产物图9针对ltr基因和gag基因的双重扩增体系结果图10对照引物对1的临床检测结果图11对照引物对2的临床检测结果图12对照pcr引物对3单重体系对临床血浆样本检测结果图13对照pcr引物对3多重检测对临床血浆样本检测结果图14对照pcr引物对3多重检测的电泳结果具体实施方式本发明属于病原体分子检测领域，涉及一种高灵敏度的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)rna的检测试剂盒，本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对hiv-1rna核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒，可广泛应用于hiv病毒引起的艾滋病的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪，以及检验检疫和疫情防控等多个领域。血浆中hiv病毒核酸存在于所有感染者体内，高灵敏度的核酸检测可大大缩短抗原抗体检测的窗口期，荧光pcr技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，多重荧光pcr更因为同时检测多个基因拥有多重保障，大大避免了漏检风险，将多重实时荧光pcr技术应用于艾滋病病毒的快速检测，能提高检测鉴别效率，为临床快速诊断和针对性治疗提供支持和依据。尤其是对疑似感染hiv的新生儿(母婴传播)、无症状疑似感染者的自检诊断具有重大的临床应用价值、对血液制品的筛查具有重大意义和巨大的社会效益。多重实时荧光pcr技术是将pcr技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用不同荧光基团对特异性探针进行标记，配合多重pcr技术，可以在同一个pcr反应管中对多种类型的病毒同时进行扩增，荧光的增长信号与相应pcr产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于，荧光pcr技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光pcr技术应用于艾滋病病毒的快速检测，能提高检测鉴别效率，在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染艾滋病病毒及同时确诊所感染的型别，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，防止这些病毒继续传播，并提高诊疗效率，为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。多重pcr(multiplexpcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。影响多重pcr反应的因素有很多，比如：(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是dna聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行pcr反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方dna介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。在本发明的一个优选地实施方式中，提供了一种荧光定量pcr方法定量检测hiv-1rna的方案，具体涉及一种高灵敏度的利用实时荧光pcr技术对hiv-1rna核酸检测并且进行定量的试剂盒。本发明采用以下的技术方案：(1)针对hiv-1高度保守区设计了特异性的引物和探针(2)通过一步法逆转录样本rna得到cdna(3)通过单管多重pcr反应进行特异性扩增hiv的两个保守序列(4)通过仪器自动绘制扩增曲线和计算阈值循环值，得到样本核酸的定量检测结果。(5)通过阳控质控品、定量质控品、阴性质控品和内标质控品的质量控制，确保检测结果的有效性。本发明的具体实施方式如下：在对genbank和国际hiv数据库上已知的hiv-1的核酸序列进行比对的基础上，分别寻找各种亚型的核酸序列的特异性保守区，并选定在相距较远的ltr区和gag区两个基因保守区上分别设计两个靶核苷酸探针和对应的引物。这些引物探针在含有耐热dna聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)的rt-pcr反应酶系以及含有mg2+等成份的rt-pcr反应液中，通过荧光pcr仪实现体外核酸的循环扩增。根据本发明的实施方案，本发明所涉及的试剂盒主要组成成分包括：hiv-1反应液a，hiv-1反应液b，hiv-1定量参考品，阴性质控品，hiv-1强阳性质控品(含量1.0×105iu/ml)，hiv-1临界阳性质控品(含量1.0×103iu/ml)和内标质控品(含量1.0×103iu/ml)；hiv-1定量参考品包括了：hiv-1定量参考品1(1.0×106iu/ml)；hiv-1定量参考品2(1.0×105iu/ml)；hiv-1定量参考品3(1.0×104iu/ml)；hiv-1定量参考品4(1.0×103iu/ml)。根据本发明的实施方案，引物探针混合液由下述5条hiv特异性的正、反向引物，下述2条特异性的探针组成。根据本发明的实施方案，针对hiv-1型ltr基因保守序列的特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-cacggcaagaggcgagg-3’(seqidno:1)和5’-ccgcttaatactgacgctc-3’(seqidno:2)；针对hiv-1型ltr基因保守序列的特异性的探针的序列是5’-attttgactagcggaggctagaaggaga-3’(seqidno:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团fam和荧光淬灭基团eclipse+4zip。根据本发明的实施方案，针对hiv-1型gag基因保守序列的特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-tctttggcaacgacccctc-3’(seqidno:4)；5’-tctttgggacagacccctcgt-3’(seqidno:5)和5’-ctccaattccccctatcattt-3’(seqidno:6)；针对hiv-1型gag基因保守序列的特异性的探针的序列是5’-tttccatcttcctggcaaattcatt-3’(seqidno:7)，探针的两端分别结合有荧光发生基团fam和荧光淬灭基团3'eclipse+5zip。本发明的一个优选实施方案中，hiv-1反应液a中引物浓度均为0.1-0.2mmol/l，探针浓度为0.04-0.1mmol/l。本发明的另一个优选实施方案中，hiv-1反应液a含有tris-hcl(50mmol/l,ph8.0)、mgcl2(2-8mmol/l)、kcl(50-100mmol/l)。本发明的另一个优选实施方案中，hiv-1反应液b由热启动taq酶、逆转录酶、dntps组成。逆转录酶可选择mmlv等常用逆转录酶。热启动taq酶、逆转录酶、dntps均可采用市售产品，如promega公司的产品,其中每人份hiv-1反应液b中热启动taq酶的用量为3-10u，逆转录酶用量为2-4u，dntps用量为100-500μmol。根据本发明的实施方案，检测每一个单人份的pcr反应液由hiv-1反应液a和hiv-1反应液b按17μl、3μl的体积混合成总体积20ul的反应液混合物，加入40ul待测样本的核酸，然后进行实时荧光定量pcr反应。本发明的另一个优选实施方案是pcr扩增的条件为：步骤①逆转录50℃，15分钟，1个循环；步骤②预变性95℃，15分钟，1个循环；步骤③变性-退火94℃，15秒随后55℃45秒，45个循环；在每一次步骤③循环的55℃45秒完成后，进行收集荧光信号。根据本发明的实施方案，本发明的试剂盒还提供了质控品，分别为阴性质控品，hiv-1强阳性质控品，hiv-1临界阳性质控品，hiv-1定量参考品1(1.0×106iu/ml)；hiv-1定量参考品2(1.0×105iu/ml)；hiv-1定量参考品3(1.0×104iu/ml)；hiv-1定量参考品4(1.0×103iu/ml)和内标质控品。阴性质控品为已检测hiv-1抗体阴性、hiv-1rnapcr检测阴性的健康人血浆。阳性质控品和定量参考品为人工合成的病毒样颗粒，病毒样颗粒内含有本发明设计的引物所扩增的hiv-1目的基因片段，选择浓度分别为：1.0×106iu/ml、1.0×105iu/ml、1.0×104iu/ml、1.0×103iu/ml的rna病毒样颗粒制备成定量参考品。试剂盒中进行待检标本检测时，必须同时提取阴性质控品、阳性质控品和定量参考品，仅当阳性质控品检测时fam通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测荧光信号均呈阴性时，且在vic检测通道有对数增长期，待检标本的检测结果才有效。本发明的试剂盒反应液只含有a液和b液2种反应液，可方便搭配自动化型移液器的大量配置使用。本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量pcr仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了后续污染的发生。检测结果可用于hiv-1快速筛查、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。根据本发明的实施方案，引物探针混合液由5条hiv特异性的正、反向引物，2条特异性的探针组成。本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量pcr仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于hiv病毒快速诊断、辅助临床研究及常规监测等多个领域研究。本发明的主要优点在于：(1)可对hiv-1病毒不同亚型的核酸进行扩增检测，可反映出样本中hiv-1型病毒感染的状态，相对于抗体反应检测，大大缩短了检测的“窗口期”，有助于hiv-1病毒的早期诊断和治疗,对于hiv-1病毒的监测和防控及艾滋病的临床诊断有重大意义；(2)分别针对hiv-1病毒m群的a-h亚型、以及流行重组型crf-ae型等不同亚型的核酸保守序列，设计特异性的引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有覆盖性广、双重靶点保障等优点，确保检测结果的可靠性；(3)一份样本一次检测过程只需1.5-2h，相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；(4)试剂采用人工体外合成的包含hiv-1rna的病毒样颗粒作为阳性质控品，即可以对试剂进行质控，比质粒作为质控更具有效性和科学性，同时对操作者的安全性大大提高；(5)试剂盒中带有阴性质控品，阳性质控品和内标物质，可用于对样本核酸提取和pcr扩增全过程进行监控，减少假阴性的出现；(6)试剂采用rt-pcr反应液、引物探针混合液、rt-pcr反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。(7)本发明的方法所需样本少、性能稳定高效、准确性高。下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)本试剂盒应用荧光定量pcr的方法，对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒1型核酸(hiv-1)rna进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒1型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒1型感染者药物治疗的疗效监测。试剂盒包含的试剂：具体引物探针序列如上。检验方案：1.样本处理和核酸提取(样本处理区)本试剂盒中的阴性质控品、阳性质控品、定量参考品均参与提取，用于对环境进行监控和pcr检测试剂的质控。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，所以须配套提取试剂使用，建议使用量是向每一个待提取样本加入5μl内标溶液，用于提取过程的质控。阳性质控品和阴性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求。2.pcr试剂准备(试剂准备区)大包装规格试剂适用：从试剂盒中取出hiv-1反应液a、hiv-1反应液b，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。取n个(n＝待测样本个数+1个阴性质控品+1个强阳性质控品+1个临界阳性质控品+4个阳性定量参考品)pcr反应管，hiv-1单人份扩增体系配制如下表：组分hiv-1反应液ahiv-1反应液b总体积用量15μl5μl20μl将各组分充分混合，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将20μl扩增体系分装到pcr管中。3.加样(样本制备区)往上述hiv-1反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本、阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品以及hiv-1定量参考品核酸40μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。4.pcr扩增(扩增和产物分析区)将反应管放入仪器样品槽内。abiprism7500仪器设置(abiprism7300仪器参照此操作，具体操作见说明书)。打开“setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控(ntc)、阳性质控以及未知样本(unknow)、阳性定量参考品(standard)，并在“samplename”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：reporterdye1：fam，quencherdye1：tamra，reporterdye2：vic，quencherdye2：none，passivereference：none。打开instrument窗口，设置循环条件如下：50℃15分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒→55℃45秒(收集荧光)，45个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。5.结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在3～15、end值可设在5～20，在log图谱窗口设置threshold的value值，使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击analysis自动获得分析结果，在report界面察看结果，记录未知样本数值(c)。6.质量控制阴性质控品：fam检测通路扩增曲线无对数增长期，vic检测通路扩增曲线为对数增长期；hiv-1阳性质控品：fam检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型s型扩增曲线，以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。7.结果判断7.1如果fam检测通道无对数增长期，且在vic检测通道有对数增长期，则判样品的hiv-1rna浓度小于试剂盒的检测灵敏度。7.2如果fam荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型s型曲线，且ct值<45，则按以下方法判断：若样品的浓度为50≤c≤1.00e+009，则该样品的hiv-1rna浓度＝ciu/ml；若样品的浓度为c＞1.00e+009，则该样品的hiv-1rna浓度＞1.0×109iu/ml。如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的hiv-1rna浓度＝(c×稀释倍数)iu/ml；若样品的浓度为20≤c＜50，同时vic检测通道扩增曲线有对数增长期，则该样品的hiv-1rna阳性，浓度低于本试剂盒的定量下限，仅作参考；若样品的浓度为c＜20.0iu/ml，同时vic检测通道扩增曲线有对数增长期，则该样品的hiv-1rna阳性，浓度低于本试剂盒的检测下限，浓度仅作参考。8.结果解释8.1.每次实验均需检测阴性质控品，hiv-1强阳性质控品，hiv-1临界阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。8.2.阳性结果判定标准：扩增曲线在fam,vic检测通道均有对数增长期；或扩增曲线在fam检测通道有对数增长期，在vic检测通道无对数增长期。8.3.阴性结果判定标准：扩增曲线在fam检测通道无明显对数增长期，在vic检测通道有对数增长期。8.4.报告格式：阴性结果报告格式为：样本未检测到人类免疫缺陷病毒1型rna，浓度低于本试剂盒的灵敏度；阳性结果报告格式为：1)当样本试验结果hiv-1rna浓度在50≤c≤1.00e+009时，报告格式为：样本检测到人类免疫缺陷病毒1型rna，其浓度为ciu/ml；2)当样本的试验结果hiv-1rna浓度c＞1.00e+009时，报告格式为：样本检测到人类免疫缺陷病毒1型rna浓度大于1.0×109iu/ml，如经稀释后检测，则报告格式为：样本检测到人类免疫缺陷病毒1型rna，浓度为(c×稀释倍数)iu/ml。3)若样品的20iu/ml≤c＜50iu/ml，同时vic检测通道扩增曲线有对数增长期，报告格式为：样本的则该样品的人类免疫缺陷病毒1型rna载量较低，测量值仅供参考；4)当样本的试验结果hiv-1rna浓度c＜20，同时vic检测通道扩增曲线有对数增长期，报告格式为：人类免疫缺陷病毒1型rna含量低于试剂盒的检测下限；若内标检测通道扩增曲线无对数增长期或无ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。实施例2：灵敏度检测实验灵敏度参考品样本来自标称浓度为5×105iu/ml的国家参考品(中国食品药品检定研究院)，以hiv-1阴性血浆稀释国家参考品到20iu/ml作为灵敏度参考品，共20份。将20份灵敏度参考品与阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品和4个阳性定量参考品同时进行核酸提取。实验平行重复3次均取得同样的检出结果，表明本发明引物具有较好的特异性，体系具有良好扩增效率，灵敏度检测良好，本发明试剂盒的灵敏度20iu/ml重复20次测试，3次试验的阳性检出率都达到100％，阳性质控品检测结果为阳性，阴性质控品检测结果为阴性。实施例3：准确度检测实验准确性参考品样本是经过国家参考品标定浓度的人工合成的rna病毒样颗粒，以hiv-1阴性血浆稀释分别为1.0×109iu/ml、1.0×108iu/ml、1.0×107iu/ml、1.0×106iu/ml、1.0×105iu/ml、1.0×104iu/ml、1.0×103iu/ml、1.0×102iu/ml、50iu/ml，作为准确性参考品，共9份，分别编号为l0～l8。将9份准确性参考品与阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品和4个阳性定量参考品同时进行核酸提取。根据实例1中的步骤，从试剂盒中取出hiv-1反应液a、hiv-1反应液b，按单人份比例换算共配制16份(准确性待测样本9个+阴性质控品1个+强阳性质控品1个+临界阳性质控品1个+阳性定量参考品4个)pcr反应体系，之后将每人份20μl扩增体系分装到pcr管中。往上述hiv-1反应管中分别加入提取后的准确性参考品、阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品以及hiv-1定量参考品核酸40μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。根据实施例1中的pcr扩增步骤，将4个定量参考品的标准曲线对已知浓度的9个准确性样本进行定值，比较理论浓度和检测浓度结果。结果如下表所示。表1准确性参考品实验结果实验结果表明，9份准确性参考品l0～l8的定值结果均即不超过真实值±0.5log值，属于质量可控范围内，定值结果合格。对于病毒载量为50～1.0×109iu/ml范围内的病毒样本，均可以使用本发明的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒进行有效的定值检测，误差范围不超过0.5个log10对数值。本试剂盒具有质控品对每次定值实验的有效性进行控制，避免实验失误得出有偏差的病毒载量定值结果，结果可控有效。同时，本试剂盒的pcr体系具有较宽的定量线性范围，准确度高，可满足不同的临床检测需求。实施例4：精密度检测实验精密度参考品样本是经过国家参考品标定浓度的人工合成的rna病毒样颗粒，以hiv-1阴性血浆稀释分别为1.0×105iu/ml、1.0×104iu/ml、1.0×103iu/ml各10份作为精密度性参考品，共30份。将30份精密度性参考品与阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品和4个阳性定量参考品同时进行核酸提取。根据实例1中的步骤，从试剂盒中取出hiv-1反应液a、hiv-1反应液b，按单人份比例换算共配制37份(精密度待测样本30个+阴性质控品1个+强阳性质控品1个+临界阳性质控品1个+阳性定量参考品4个)pcr反应体系，之后将每人份20μl扩增体系分装到pcr管中。往上述hiv-1反应管中分别加入提取后的精密性参考品、阴性质控品、hiv-1强阳性质控品、hiv-1临界阳性质控品以及hiv-1定量参考品核酸40μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。根据实例1中的pcr扩增步骤，将4个定量参考品的标准曲线对精密度性样本进行定值，计算定值浓度log值的变异系数cv。结果如下表所示。表2精密度参考品实验结果结果显示，以定量参考品定值对1.0×105iu/ml、1.0×104iu/ml、1.0×103iu/ml各10份精密度性参考品定值，三种不同浓度的精密度参考品的浓度对数值的变异系数均小于5％，表明本发明方法对同一病毒载量的样本定值具有一致的ct值，标准偏差小，多次测定结果的稳定性和精密度评价良好。实施例5：扩增产物电泳检测本发明人针对hiv-1型ltr基因以及gag基因设计了pcr扩增引物，并对pcr体系的各个成分进行了优化已获得良好的扩增产物。本实例利用针对ltr基因设计优化的单重体系、针对gag基因设计优化的单重体系、以及针对ltr基因和gag基因的双重扩增体系，分别对临床血浆样本进行pcr扩增，电泳检测体系产物的扩增情况。具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，使用ltr基因设计的单重体系结果如图7所示，图7中最左侧泳道为marker，其余泳道为5个不同的临床血浆样本，样本均为靶基因阳性，产物条带单一明亮。使用gag基因设计的单重体系结果如图8所示，图8中最左侧泳道为marker，其余泳道为5个不同的临床血浆样本，样本均为靶基因阳性，产物条带单一明亮。使用ltr基因和gag基因的双重扩增体系结果如图9所示，图9中最左侧泳道为marker，其余泳道为10个不同的临床血浆样本和1个阴性血浆，样本均为靶基因阳性，产物条带单一明亮，而阴性样本无产物。检测结果表明本发明的引物和扩增体系达到优化，对临床样本靶基因正常扩增，扩增产物的专一性和特异性良好。对比例1本发明人针对hiv-1型ltr基因以及gag基因设计了十数对pcr扩增引物，其中绝大部分引物的灵敏度较低、特异性较差，存在漏检，无法满足检测需要，典型的普通pcr引物序列和检测效果数据如下：对照引物对1(针对hiv-1型ltr基因保守序列)上游引物:cccgcttaatactgacgc(seqidno.:8)；下游引物:gcacggcaagaggcga(seqidno.:9)对照rt-pcr引物对2(针对hiv-1型gag基因保守序列)：上游引物:acctccaattccccctatc(seqidno.:10)；下游引物:tggcaacgacccctc(seqidno.:11)。具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，使用对照引物对1的检测结果如图10所示，10个不同的临床血浆样本，其中3个为靶基因阳性，7个为检测阴性，检测结果表明对照引物对1的敏感性较差，漏检情况严重。使用对照引物对2的检测结果如图11所示，10个不同的临床血浆样本，其中5个为靶基因阳性，5个为检测阴性，检测结果表明对照引物对2在部分样本中无法检测出靶基因，灵敏度较差且特异性较差。对比例2为满足多重检测的需求，本发明人针对筛选出的多对pcr引物进行组合测试，其中绝大多数的组合无法满足多重检测需要，比如使用对照引物对3和本发明的针对hiv-1型gag基因保守序列的特异性引物进行组合，进行多重检测。对照pcr引物对3(针对hiv-1型ltr基因保守序列)：上游引物:ccgcttaatactgacgc(seqidno.:12)；下游引物:cacggcaagaggcga(seqidno.:13)。具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，其中，使用对照pcr引物对3对ltr基因保守序列进行检测，结果如图12，扩增10个不同的临床血浆样本，10个为靶基因均为阳性，表面体系具有良好的特异性和灵敏度。多重检测结果：多重检测的荧光pcr检测结果如图13所示。电泳产物结果如图14所示，最右泳道为marker，其余泳道为临床样本，没有目的条带并且有大片非特异性扩增产物，表明该两组引物对相互影响严重，无法进行多重检测。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒<130>00016<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cacggcaagaggcgagg17<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccgcttaatactgacgctc19<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3attttgactagcggaggctagaaggaga28<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tctttggcaacgacccctc19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tctttgggacagacccctcgt21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctccaattccccctatcattt21<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tttccatcttcctggcaaattcatt25<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cccgcttaatactgacgc18<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gcacggcaagaggcga16<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acctccaattccccctatc19<210>11<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tggcaacgacccctc15<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccgcttaatactgacgc17<210>13<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cacggcaagaggcga15当前第1页12