一种与小麦抗低温、干旱、ABA及高盐相关的基因及其应用的制作方法

本发明涉及到生物技术领域，特别涉及一种与小麦抗寒、干旱等相关的基因。

背景技术：

小麦(triticumaestivuml.)是我国重要的粮食作物，播种面积和总产量均占到全国粮食作物的22％左右，其在世界范围内也被广泛种植。低温、干旱、盐渍等非生物逆境严重制约着小麦的生产。发掘小麦的抗逆基因资源，改良品种的抗逆性是应对不良环境胁迫的重要途径。挖掘利用抗逆基因，培育突破性品种是提升小麦产量的有效途径。

cobra基因通过编码一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(gp-i)锚定蛋白，影响植物细胞壁中纤维素微纤丝的正确定位和细胞的定向伸长。其在植物根、茎、叶等机械组织细胞壁的生物合成中发挥重要的作用。拟南芥cobra基因的突变能引起根部细胞扩张方向的改变，同时伴随着纤维素含量的减少和纤维素排列方向的杂乱等。水稻和玉米中的cobra基因都在次生细胞壁的生物合成中发挥作用。近年来，不断有证据表明：细胞壁与细胞膜一起协同参与感知外界逆境信号的传递过程。cobra作为一类细胞表面蛋白遵循典型的gpi分泌路径，主要作用于植物细胞膜外表面，能感知细胞壁相关信息并传导到细胞膜上。通过糖基磷脂酰肌醇插入于内质网膜和质膜对细胞壁的生物合成及其对各种逆境胁迫发挥着重要的调控作用。

目前，小麦中尚无有关tacobl(cobra-like)参与逆境研究的报道。克隆小麦中的tacobl基因及研究该基因在逆境胁迫下的表达模式，分析品种间不同等位类型启动子的活性发掘优异等位变异，对抗逆性新品种分子辅助选择具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与小麦抗低温、干旱、aba及高盐相关的基因及其应用，以解决现有技术中不清楚小麦tacobl基因与小麦抗逆性是否相关等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种与小麦抗低温、干旱、aba及高盐相关的基因，所述基因具体为小麦5b染色体上的tacobl基因，所述tacobl基因的核苷酸序列序列具体为seqidno1或seqidno2，当其核苷酸序列为seqidno1时该序列命名为hap5b-a；当其序列为seqidno2时，该序列命名为hap5b-b。

进一步，本发明还提供一种上述基因在在低温、干旱、aba及高盐环境下表达模式的分析方法，该方法包含以下具体步骤：

步骤一：挑选籽粒饱满的小麦种子，用1/2hoagland培养液进行水培至两叶一心期，选取1/5为对照株，4/5为胁迫株；

其中：对照株不进行任何胁迫处理

胁迫株分为四份并进行如下四种胁迫处理：

含有100μmol·l^-1aba的hoagland培养液处理；

含有20％peg6000的hoagland培养液处理；

含有100mmol·l^-1nacl溶液的hoagland培养液处理；

4℃光照下hoagland培养液处理；

步骤二：分别剪取胁迫处理1、2、6、12和24h的胁迫株的叶片和根系，置于液氮中，用于胁迫过程中基因的表达特性分析；

步骤三：对步骤二获取的组织分别提取对应的rna，然后分别进行反转录，以反转录的cdna为模板，分别进行实时荧光定量pcr扩增，其中实时定量pcr扩增引物为：

f：ataggaccttcaccttcagcc

r：caggagcagcacgagcaa；

以小麦taactin作为内参基因，引物为：

actinf：atgtaccgtggtgatgtt

actinr：cctggtggctggtagttg。

步骤四：反应结束后根据循环阈值ct，用2^-δct方法计算基因的相对表达量。

进一步，所述实时定量荧光pcr扩增的20μl反应体系包括：10μmol/l的上游引物f1μl、10μmol/l的下游引物r1μl、thunderbirdsybrqpcrmix10μl、模板cdna2.0μl、去离子水6μl。

进一步，所述实时定量荧光pcr的反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环，实验设置3次重复。

本发明还提供一种上述tacobl基因启动子活性的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、获取小麦dna，利用以下引物对小麦dna进行pcr扩增

5bf：5'acgaagcttttgcggcccttgcatgtt3'

5br：5'acgggatcccgttgcactcccctgctaat3'

步骤2、取pcr产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测并纯化回收目的基因；

将回收的目的基因与pmd19-tsimplevector连接，获得连接产物，验证后抽提目的质粒；

步骤3、以pcambia1391作为双元载体，构件含有目的质粒的启动子-gus融合表达双元载体；

步骤4、将获得的启动子-gus融合表达双元载体转入农杆菌eha105，获得含有目标载体的农杆菌菌株；

步骤5、对4周龄烟草倒3-倒6叶叶下注射含有目标载体的农杆菌菌株，暗培养24h后进行低温处理；将注射后植株置入培养箱处理24h,在0h、1h、8h和24h分别取样，获得取样材料；

步骤6、定性检测：各取样材料通过gus染色12h，乙醇梯度脱色后对gus染色拍照；

步骤7、定量检测：各取样材料提取叶片总蛋白，通过荧光法测定gus活性。

进一步，步骤1中，20μlpcr扩增的反应体系为：去离子水12.8μl、含mg⁺的10xpcrbuffer2.0μl、2.5μmol/l的底物dntps2.0μl、10μmol/l的上游引物f0.5μl、10μmol/l的下游引物r0.5μl、5u/μl的easytaqdnapolymerase0.2μl、模板dna2.0μl。

进一步，步骤1中，pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火45s且每个循环降0.3℃，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸8min，4℃保存。

进一步，步骤2中将回收的目的基因与pmd19-tsimplevector连接获得目的质粒的具体过程为：

10μl反应体系为：pcr产物4.5μl、tsimplevector0.5μl、solutioni5.0μl，反应体系16℃反应4小时；取5μl连接产物至一干净离心管中，加入50μl感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min后加入300μl不含amp的lb培养基，37℃，180rpm震荡培养1.5h；取50μl培养液涂布于含有amp、iptg和x-gal的lb平板上，静置30min后，37℃倒置培养16h；挑取白色的单菌落，接种于1ml含amp的lb培养基中，37℃，180rpm震荡培养6h；取1μl进行菌液pcr鉴定；对鉴定出的阳性克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆一部分加50％的甘油保存，一部分大摇提质粒。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明采用荧光定量pcr的方法解析小麦tacobl的表达模式，结果表明该基因受低温诱导上调表达，受干旱、aba和高盐诱导下调表达。并利用农杆菌介导的遗传转化法，通过gus活性测定及组织化学染色分析两种等位变异类型启动子的活性，结果表明：在低温诱导下hap5b-a型启动子活性高于与hap5b-b型启动子。证明启动子区tata四个碱基的插入能增强启动子的活性。可推测该基因在小麦的抗寒中发挥一定的作用。基因型hap5b-a在小麦抗寒中是一种优异的等位变异。

说明书附图

图1为小麦tacobl在低温、干旱、aba及高盐下的表达模式；

图2为5b染色体上的tacobl的两种等位变异；

图3为2种等位类型启动子序列的克隆，1为杨158，2为皖麦38，m为分子标准marker2000；

图4为对构建好的启动子-gus融合表达双元载体进行双酶切验证；

图5为通过荧光法测定gus活性；

图6为gus组织化学染色。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、小麦tacobl基因的表达模式分析

挑选籽粒饱满的小麦种子，用1/2hoagland培养液进行水培至两叶一心期，进行如下处理：(1)对照(ck)不进行任何胁迫处理；(2)胁迫处理：一部分幼苗在常温下分别用含有aba(100μmol·l^-1)、20％peg6000(20％)、nacl(100mmol·l^-1)溶液的hoagland培养液处理。另一部分幼苗直接置于温度为4℃光照培养箱中培养。分别剪取胁迫处理1、2、6、12和24h的叶片和根系，置于液氮中，用于胁迫过程中基因的表达特性分析。根据rna提取试剂盒的说明书提取总rna，进行浓度测定后，将不同组织提取的rna浓度统一调到200ng/μl，根据反转录试剂盒进行反转录。以反转录的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr扩增，实时定量引物为f：ataggaccttcaccttcagcc，r：caggagcagcacgagcaa；以小麦taactin作为内参基因，引物为actinf：atgtaccgtggtgatgtt，actinr：cctggtggctggtagttg。反应体系(20μl反应体系)包括：上游引物f(10μmol/l)1μl、下游引物r(10μmol/l)1μl、thunderbirdsybrqpcrmix10μl、模板cdna2.0μl、去离子水6μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环。实验设置3次重复，反应结束后根据循环阈值(ct值)，用2^-δct方法计算基因的相对表达量。不同组织不同处理下的表达分析结果表明：该基因受低温诱导上调表达，受干旱、aba和高盐诱导下调表达(图1)。可推测该基因在小麦的抗寒中发挥一定的作用。

实施例2、一种小麦tacobl基因启动子活性鉴定的方法

对20份小麦材料进行序列分析，发现位于5b染色体上的该基因在不同材料间存在两种等位变异，即上游调控区-550bp处存在tata四个碱基的插入缺失(图2)。将这2种等位类型分别命名为hap5b-a(含tata)和hap5b-b(缺失tata)。根据5b染色体上的该基因的全长序列设计一对引物分别从皖麦38(含hap5b-a等位类型)和扬麦158(含hap5b-b等位类型)中克隆2种等位类型的启动子序列。上游引物位于atg前-1670bp处，下游引物为atg前20bp碱基的反义链序列。在上游引物的5’端加上hindlll酶切位点(aagctt)和保护碱基acg，下游引物的5’端加上bamhi酶切位点(ggatcc)和保护碱基acg。引物序列为：5bf：5'acgaagcttttgcggcccttgcatgtt3'，5br：5'acgggatcccgttgcactcccctgctaat3'。pcr扩增的反应体系(20μl反应体系)为：去离子水12.8μl、10xpcrbuffer(含mg⁺)2.0μl、底物dntps(2.5μmol/l)2.0μl、上游引物f(10μmol/l)0.5μl、下游引物r(10μmol/l)0.5μl、easytaqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl、模板dna2.0μl。pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，64℃(每个循环降0.3℃)退火45s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸8min，4℃保存。取pcr产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测(图3)。用上海生工的胶回收试剂盒回收dna片段，具体操作见试剂盒说明书。

将回收的目的片段与pmd19-tsimplevector连接。反应体系为(10μl)：pcr产物4.5μl、tsimplevector0.5μl、solutioni5.0μl，将上述反应体系16℃反应4小时。取5μl连接产物至一干净离心管中，加入50μl感受态细胞，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min后加入300μl不含amp的lb培养基，37℃，180rpm震荡培养1.5h。取50μl培养液涂布于含有amp、iptg和x-gal的lb平板上，静置30min后，37℃倒置培养16h。挑取白色的单菌落，接种于1ml含amp的lb培养基中。37℃，180rpm震荡培养6h。取1μl进行菌液pcr鉴定。对鉴定出的阳性克隆，交测序公司测序。将测序正确的阳性克隆一部分加50％的甘油保存，一部分大摇提质粒。

利用pcambia1391作为双元载体，通过bamhi和hindiii双酶切、连接，分别构建含两种等位类型启动子-gus融合表达双元载体，并通过双酶切(图4)及测序验证，转入农杆菌eha105，通过pcr验证，获得含有目标载体的农杆菌菌株。

将农杆菌在培养基和前处理液中培养至目标浓度，制备转化溶液。取4周龄烟草倒3-倒6叶，进行叶下注射，暗培养24h后进行低温处理。在暗培养箱里设置4度处理，将注射后植株置入培养箱处理24h,在0h、1h、8h和24h分别取样。定性检测：各点材料通过gus染色12h，乙醇梯度脱色后对gus染色拍照。定量检测：各点材料提取叶片总蛋白，通过荧光法测定gus活性。gus活性测定(图5)及组织化学染色(图6)结果表明在低温诱导下，该基因的启动子能大幅度的提高gus基因的表达水平，说明该基因的启动子属于诱导型启动子；且在低温诱导下hap5b-a型启动子活性高于与hap5b-b型启动子。证明启动子区tata四个碱基的插入能增强启动子的活性。基因型hap5b-a在小麦抗寒中是一种优异的等位变异。

序列表

<110>安徽省农业科学院作物研究所

<120>一种与小麦抗低温、干旱、aba及高盐相关的基因及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2112

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml)

<400>1

atggatattttttttcatcgcacacatggatttagcgtgcctctgtgccatttggcgcaa60

cggtccactagtattgtataatgggcaaggtagcaaatccgaggagtagaagtctagacc120

aagtttaatgatgtgtaagcgtgtatacacatcaaaatacagtacatatttaatgattgc180

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ccgtcgttgtcagaggaagtaagccgagatgattccgttgcaatggcccatcagctttga300

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<210>2

<211>2108

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<213>小麦(triticumaestivuml)

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atgatcca2108