基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法与流程

本发明涉及猪病毒的检测技术领域，尤其涉及猪德尔塔冠状病毒(pdcov)的检测技术。

背景技术：

猪德尔塔冠状病毒(pdcov)是2009年新发现的一种带包膜的单链正链rna病毒，deltacoronavirus属。pdcov基因组大约为25kb长，包含5`和3`非翻译区及7个开放性阅读框，分别编码多聚酶蛋白1a/1b、纤突蛋白、小膜蛋白、膜蛋白、非结构蛋白6、核衣壳蛋白及非结构蛋白7。2012年，首次在中国香港被报道，但它到2014年2月才从美国母猪腹泻仔猪和粪便中分离。随后，韩国、中国大陆和泰国的患有腹泻症状的病猪中也发现了pdcov。随后在世界范围内爆发，给养猪业造成了巨大的经济损失。pdcov会造成急性，高度传染性和破坏性的肠道疾病，感染pdcov的病猪会出现呕吐、水样腹泻及引起仔猪死亡的腹泻症状，各个年龄段均可发生，仔但猪对pdcov的易感性和死亡率非常高，在感染病毒后21-24h内会出现症状或者死亡，死亡率可高达30-40％。pdcov的临床症状与猪流行性腹泻(pedv)和猪传染性胃肠炎(tgev)非常相似，它们在临床上难以区分。研究表明，在大面积仔猪腹泻中，pdcov的比例高于pedv。因此，建立一种快速、有效的临床检测方法，对临床诊断、监测和流行病学调查具有重要意义。

目前，实验室检测pdcov的分子方法有多种。例如：rt-pcr，实时荧光定量pcr，环介导等温扩增技术(lamp)和免疫组织化学。然而，rt-pcr，实时荧光定量pcr所需要的时间较长和昂贵的仪器，免疫组织化学技术复杂且需要阳性血清或者抗体，可能造成高额的成本。等温扩增是最近几年新出现的热门检测技术，因为快捷、方便所被人用于实地临床检测上，具有广阔的发展前景。lamp也是其中之一，但lamp并且需要多对引物，容易造成气溶胶污染，使检测结果不准确和可靠。重组酶介导链替换核酸扩增(raa)是近年来常出现的一种恒温扩增核酸的技术。因为快速、不需要昂贵仪器，它已被开发用于各种病原微生物的快速诊断，如寄生虫、细菌和病毒raa扩增。rpa利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链dna的同源靶序列的结合启动dna复制；重组酶从复合体释放后dna聚合酶与引物结合促进新链合成；ssdna结合蛋白可以使非模板链和置换链稳定，扩增产物以指数级增长。在30到42℃的恒定温度下进行20-30min的核酸扩增。目前基于raa扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:raa与琼脂糖凝胶检测技术相结合(基础型raa)、raa与荧光检测技术相结合(real-timeraa)、raa与侧向流动免疫技术相结合(raa-lfd)。研究一种简单、快速检测pdcov方法在诊断意义上具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测方法，能够简单、快速、低成本地检测出pdcov。

为了达到上述目的，本研究结合实时荧光检测与反转录重组酶介导链替换核酸扩增(rt-raa)技术，研发出实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增(real-timert-raa)技术，建立了一种现场可检测pdcov的快速检测体系，开发并评价了一种特异、灵敏的检测平台。本研究使用的实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增(real-timert-raa)技术无需配套检测卡，无需电泳跑胶，只需要一台带有恒温模块的荧光信号收集仪器即可。

本发明采用如下技术方案：

基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法，

包括如下实验步骤：

(1)提取pdcov病毒rna，作为模板rna；

(2)设计realtimert-raa引物与探针；

(3)建立realtimert-raa反应体系，对病毒rna进行realtimert-raa反应，实时荧光检测结果。

进一步地，所述real-timert-raa引物所用的模板的gc含量为30％-70％，tm值在40-60℃之间；real-timert-raa引物长度为30-35个碱基；探针长度为46-52个碱基；

探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、相应的淬灭基团、c3-spacer，探针中部有两个胸腺嘧啶，两个胸腺嘧啶之间间隔1-4个碱基，所述两个胸腺嘧啶之间任一碱基由所述四氢呋喃取代，形成空碱基位；

荧光基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上，淬灭基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上；或者荧光基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶上，淬灭基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶上；从5’端到荧光基团之间至少有30个碱基，从淬灭基团到3’端之间至少有15个碱基；c3-spacer标记在3’端末端。

进一步地，所述realtimert-raa引物和探针如下：

pdcov-raa-f：tacttgggttaagggttcgggagctgayac；

pdcov-raa-r：ctgaggtcttcctctagcgttgaaggggtc；

pdcov-raa-probe：

attcccaaccggagatggcccagctcaagg(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)cagagttgacccct(c3spacer)。

进一步地，所述realtimert-raa反应体系为50μl：rehydrationbuffer29.5μl；上游引物2μl，420nm；下游引物2μl，420nm；探针0.6μl，120nm；2μl模板rna；1μl反转录酶；ddh2o补齐至47.5μl；再加入2.5μl的醋酸镁溶液。

进一步地，所述realtimert-raa反应过程：将rehydrationbuffer29.5μl；上游引物2μl，420nm；下游引物2μl，420nm；探针0.6μl，120nm；2μl模板rna；1μl反转录酶；ddh2o补齐至47.5μl；轻微震荡后离心数秒；再加入2.5μl的醋酸镁溶液；放置39℃金属浴中反应，时间为20min；当扩增到4分钟时拿出来轻微震荡后离心数秒，使反应更充分。

进一步地，还包括制备dsrna阳性标准品，以进行灵敏度、特异性测试；

制备dsrna阳性标准品的过程：提取pdcov病毒rna，设计rt-pcr引物，进行rt-pcr扩增基因获得目的dna，dna与pgem-t载体连接，得到重组子，转化重组子进dh5a大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性菌落扩大培养；提取重组子质粒；转录出pdcovdsrna阳性标准品。

进一步地，所述提取pdcov病毒rna的过程：使用tguide总核酸提取病毒dna/rna试剂盒和核酸自动提取仪从本实验室培养并分离的猪睾丸细胞中提取pdcov病毒rna。

进一步地，根据genbank中pdcov公布的n序列，设计所述rt-pcr引物：

上游引物：5`～gctactcatcctcagtttcgtg～3`；

下游引物：5`～acgctgctgattcctgct～3`。

进一步地，所述rt-pcr的反应体系是：2×1stepbuffer25μl，primescript1stepenzymemix2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板rna2μl，用dh2o17μl；

rt-pcr程序为50℃反转录30min；95℃灭活2min；95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。

进一步地，所述dna与载体连接的过程是：跑凝胶核酸电泳、回收rt-pcr目的基因产物、rt-pcr目的基因产物与pgem-tvector、2*buffer、t4dna酶连接过夜；

重组子转化、扩大培养的操作是：将10μl重组子加入100μl感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min；金属浴42℃热激90sec后冰浴5min；加入1mllb培养基后在200rpm、37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养。

本发明的优点有：简单、快速、低成本地检测出pdcov，realtimert-raa检测方法与rt-qpcr检测方法灵敏度一致，都是10²copies/μl。特异性好。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是rt-pcr扩增产物实验结果图；

图2是realtimert-raa灵敏度试验结果图；

图3是rt-qpcr灵敏度试验结果图；

图4是特异性试验结果图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

1材料和方法

1.1制备dsrna阳性标准品

使用tguide总核酸提取病毒dna/rna试剂盒和核酸自动提取仪从本实验室培养并分离的猪睾丸细胞中提取pdcov病毒(genebankno.ky363868.1)rna，作为模板rna。根据genbank中pdcov公布的n基因序列，设计rt-pcr引物：

上游引物：5`～gctactcatcctcagtttcgtg～3`；

下游引物：5`～acgctgctgattcctgct～3`；

使用onestepprimescript^tmrt-pcrkit(takara公司)，按说明书建立反应体系，利用该引物反转录扩增基因。

反应体系为：2×1stepbuffer25μl，primescript1stepenzymemix2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板rna2μl，用dh2o17μl。扩增程序为：50℃反转录30min；95℃灭活2min；95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。

采用凝胶核酸电泳后，如图1所示，扩增出958bp的目的基因。

按照omega公司gelextractionkit试剂盒说明书进行回收rt-pcr目的基因产物。回收步骤如下：

在紫外灯的照射下，用刀片切下与目的片段大小相当的胶；加入与胶等体积的bindingbuffer约400μl，在55℃金属浴下溶胶，直至胶完全溶解；将混合液移至hb离心柱，放置2min；10000rpm下离心1min，倒掉废液；加入300μl的bindingbuffer，12000rpm下离心1min，弃滤液；加入700μlspwbuffer，12000rpm下离心1min，弃滤液；重复上一步；12000rpm下空管离心2min；打开盖子，室温下放置2min，充分挥发酒精；加入30μlelutionbuffer，放置2min；将离心柱移至1.5ml的离心管在12000rpm下离心2min，离心后的液体就是纯化好的dna，得到回收产物。

将3μl回收产物与1μlpgem-tvector(线性载体)、5μl2*buffer、t4dna酶1μl总体积共10μl混匀，放4℃连接过夜，得到重组子。

将10μl重组子转化dh5a大肠杆菌感受态细胞中：将10μl重组子加入100μldh5a大肠杆菌感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min；金属浴42℃热激90sec后冰浴5min；加入1mllb培养基后在200rpm、37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养。

提取质粒：按照omega公司的plasmidminikiti试剂盒说明书进行提取。将提取后的质粒送至上海生工生物股份有限公司广州分公司测序。

按照ribomax^tmlargescalernaproductionsystems说明书将提取后的质粒转录为pdcovdsrna阳性标准品。

1.2real-timert-raa引物与探针的设计

我们基于pdcov的n基因序列设计了realtimert-raa引物和探针，以扩增特定的片段。设计realtimert-raa引物所用的模板的gc含量为30％-70％，tm值在40-60℃之间。real-timert-raa引物长度为30-35个碱基；探针长度为46-52个碱基，探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团(fam)、四氢呋喃(thf)、相应的淬灭基团(bhq1)、c3-spacer，探针中部有两个胸腺嘧啶(t)，两个胸腺嘧啶(t)之间间隔1-4个碱基，所述两个胸腺嘧啶(t)之间任一碱基由所述四氢呋喃取代，形成空碱基位；

荧光基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶(t)上，淬灭基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶(t)上；或者荧光基团标记在空碱基位靠近3’一侧的胸腺嘧啶(t)上，淬灭基团标记在空碱基位靠近5’一侧的胸腺嘧啶(t)上；从5’端到荧光基团之间至少有30个碱基，从淬灭基团到3’端之间至少有15个碱基；c3-spacer标记在3’端末端。

以下是real-timert-raa引物、探针的序列：

pdcov-raa-f：5`～tacttgggttaagggttcgggagctgayac～3`；

pdcov-raa-r：5`～ctgaggtcttcctctagcgttgaaggggtc～3`；

pdcov-raa-probe：

5`～attcccaaccggagatggcccagctcaagg(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)cagagttgacccct(c3spacer)～3`；

1.3realtimert-raa反应体系的建立

realtimert-raa反应用rt-荧光型核酸扩增试剂(rt-raa法)(杭州众测生物科技有限公司)进行扩增，在50μl的体积内进行，体系为：rehydrationbuffer29.5μl；上游引物2μl(420nm)；下游引物2μl(420nm)；探针0.6μl(120nm)，2μl模板rna，1μl反转录酶，ddh2o补齐至47.5μl，将以上混合液轻微震荡后离心数秒；再加入2.5μl的醋酸镁溶液。放置39℃金属浴中反应，时间为20min；当扩增到4分钟时候应该拿出来轻微震荡后离心数秒，使反应更充分。结果可以使用一台带有恒温模块的荧光信号收集仪器实时进行监测。

1.5灵敏度试验

利用上述制备好的pdcovdsrna阳性标准品10倍比例稀释(10⁶copies/μl～1copies/μl)共7个梯度，ddh2o做空白对照。重复三次realtimert-raa实验，以确定建立的方法的灵敏度并与masudat等人所建立的荧光定量pcr方法(rt-qpcr)作对比。

从以上图2和图3结果所示，所建立的realtimert-raa检测方法与rt-qpcr检测方法灵敏度一致，都是10²copies/μl。

1.6特异性试验

通过检测rv,prv,fmdv,pedv,prrsv,csfv,pcv3,tgev,pprvandsads-cov等其它病原体的核酸，以确定所建立方法的特异性。

如图4结果所示，只有pdcov阳性核酸出现扩增，其他阴性核酸并没有出现扩增的现象，证明该方法特异性好。

1.7临床样品检测对比

利用核酸自动提取仪从在广东和广西的商业养猪场收集到的63例临床标本中提取核酸，其中脑12例，心脏10例，肝脏7例，肺10例，肾12例，其他组织12例。同时用rt-pcr、rt-qpcr和realtimert-raa对临床样品进行检测，比较这三种方法的阳性率，对realtimert-raa检测方法进行评估。见表1

表1.rt-pcr、rt-qpcr和realtimert-raa临床样本阳性率对比

从上表结果所示，普通rt-pcr阳性率比rt-qpcr和realtimert-raa要低，rt-qpcr与realtimert-raa结果一致。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

序列表

<110>广州动佰生物科技有限公司、浙江大学

<120>基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法

<130>2018

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctactcatcctcagtttcgtg22

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acgctgctgattcctgct18

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tacttgggttaagggttcgggagctgayac30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctgaggtcttcctctagcgttgaaggggtc30

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>荧光基团fam

<222>(31)..(31)

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>n=thf

<220>

<221>淬灭基团bhq1

<222>(33)..(33)

<220>

<221>c3spacer

<222>(47)..(47)

<400>5

attcccaaccggagatggcccagctcaaggtntcagagttgacccct47