基于环形分布电极的生物细胞刺激系统的制作方法

本实用新型涉及一种可以产生任意方向和多种模式电场的生物细胞刺激系统，具体说是结合了环形分布电极的电场均一性、方向可控性，以及多通道双向脉冲电源的任意通道分别、同步控制性而实现可变生物细胞刺激电场。主要用于生物细胞电刺激促进生长分化、肌细胞收缩运动调控与电刺激响应特性检测，在生命科学领域具有重要的潜在应用，如心肌、骨骼肌组织工程、药物筛选、及以肌细胞为驱动单元的类生命机器人的研究。

背景技术：

由生命系统和机电系统有机深度融合所形成的类生命机器人系统可能具有生物与机器各自的优点，例如生命体所独有的多自由度、高能量转换效率、高能量密度、生物兼容性、和自修复特性，以及机电系统所拥有的高精准性、高强度、高重复性、和良好的可控性等特点。因此，对于以活体肌肉细胞为驱动主体的类生命机器人研究吸引了大量的关注，现已实现以活性分子马达、微生物、肌肉细胞、昆虫背血管组织等为驱动单元的微小机器人。而其中骨骼肌作为哺乳动物主要的动力来源，具有收缩力大及可控性好的优点，有望成为新一代类生命机器人的主要驱动单元。但是，成肌细胞需分化为肌管才能在外界刺激(如电刺激)下产生收缩运动，而较低的分化率限制了骨骼肌细胞驱动类生命机器人研究的发展。已有研究表明，仿神经电脉冲刺激可以促进肌细胞生长，如成肌细胞的增殖、分化、肌管的成熟度、排列性、以及肌管的收缩特性。在目前的电刺激促进细胞生长分化的研究中，多采用U型电极、平行板电极、以及基底电极，而它们在应用中均存在着某些局限性，例如，当使用一对平行电极放置在介质中用来刺激肌肉细胞时，电场会因培养基的固有电阻而减小，因此，需要高电压来极化和刺激细胞。而由非均匀电场引起的局部高电流可能会损伤靠近电极的细胞。并且，电极之间的高电压可能会加剧培养基的电解，并在电极附近形成局部酸碱度巨变并生成气体，这也可能对细胞造成伤害。此外，若想使用一对平行电极在液体中形成平行电场，要求电极长度是极间距的两倍以上。然而，基底电极可以减少对介质和细胞的伤害，但是一旦电极被制造出来，电场的方向就会变不可变，因此无法用来研究活体肌细胞/组织的电刺激响应及控制特性。因此从物理原理上开发基于环形分布电极的生物细胞刺激系统在实现生物细胞/组织培养与调控等研究方面具有重要作用。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供基于环形分布电极的生物细胞刺激系统，实现促进细胞生长分化与肌细胞跳动特性调控，以及基于肌细胞驱动的类生命机器人的制造和运动控制。此外，与现有测量技术相配合，可实现肌细胞电刺激响应特性检测。应用基本物理原理推进细胞生物学相关学科与产业的快速发展。

本实用新型为实现上述目的所采用的技术方案是：基于环形分布电极的生物细胞刺激系统，包括电极以及与其连接的多通道双向脉冲电源；

所述电极为多个，成环形分布，设于培养皿内。所述培养皿的侧壁在底面上的投影为圆形。所述电极均匀分布于培养皿内的侧壁或底面上。任意相邻两个电极间的距离相等。所有电极在培养皿内的高度相同。所述电极个数为偶数。

在所有电极构成的平面上，以所有电极构成的圆的某直径为中心线，中心线两侧对应的两个电极为一对。构成一对的两个电极到中心线的垂直距离相等。构成一对的两个电极的连线与该中心线垂直。

构成一对的两个电极分别通过导线与多通道双向脉冲电源的正输出端、负输出端连接。

电极个数为不少于4个的偶数，为稳定金属或非金属电极；所有电极尺寸相同，以相同间隔均匀分布在圆形培养皿的内部，高度相同，每个电极均通过导线与多通道双向脉冲电源的输出端相连。

通电时的任意时刻，在所有电极构成的平面上，以所有电极构成的圆中某直径为中心线，中心线两侧对应的两个电极为一对，且电压相反。

所述对应为两个电极到中心线的垂直距离相等，两个电极的连线与该中心线垂直。

每对电极间产生的电场线方向平行。

本实用新型具有以下有益效果及优点：

1.本实用新型利用环形分布电极可产生电势梯度均匀、电场分布均匀、局部高电流区域小的特点，将环形分布电极应用于生物细胞刺激中，可实现促进细胞生长分化。

2.本实用新型利用环形分布电极和多通道双脉冲电源可产生方向可变和多模式电场，可实现肌细胞或以肌细胞为驱动单元的类生命机器人运动调控；与细胞测量装置配合使用，可实现细胞电刺激响应特性检测。

3.由于本实用新型在细胞培养、调控与检测的应用中无特殊要求，无需对细胞样品进行复杂的处理、标记，并且可以实现高通量、非侵入、无损的细胞培养与检测，因此在生命科学领域具有重要的潜在应用，如心肌、骨骼肌组织工程、药物筛选、及以肌细胞为驱动单元的类生命机器人的研究。

附图说明

图1a为本实用新型的系统结构原理示意图一；

图1b为本实用新型的系统结构原理示意图二；

图1c为本实用新型的系统结构原理示意图三；

其中1是培养箱，2是导线，3是培养皿，4是电极，5是细胞跳动测量装置，6是多通道双向脉冲电源，7是计算机；8是细胞跳动测量装置控制器。

图2为利用本实用新型促进细胞生长分化结果图片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本实用新型做进一步的详细说明。

本实用新型涉及基于环形分布电极的生物细胞刺激系统，包括可装配于生物培养皿的环形分布电极和多通道双向脉冲电源，可实现电刺激促进细胞生长分化与肌细胞、肌管收缩运动调控功能，与细胞跳动检测装置配合可实现细胞电刺激响应特性检测。在基于环形分布电极的生物细胞刺激系统中各电极片可装配于不同型号生物培养皿，均匀分布于培养皿内壁，通过导线将各电极片分别与多通道双向脉冲电源输出端相连，通过改变多通道双向脉冲电源各输出端的输出的信号参数,包括脉冲的幅值、脉宽及频率等，可调节环形分布电极所产生的电场分布，从而产生可变电刺激模式。当将系统应用于电刺激促进细胞生长分化(如成肌细胞向肌管分化)时，将环形电极装配在培养皿上，并将其置于培养箱中，通过导线连接到生物培养装置即培养箱外的双脉冲直流电源实现电刺激；当将所述系统应用于肌细胞收缩运动调控时，通过改变多通道双向脉冲电源各输出端的输出的信号参数(脉冲幅值、脉宽及频率)，可调节施加于细胞的电刺激模式，从而调控细胞的收缩运动；同时与原子力显微镜、激光干涉仪、相差测量仪、多普勒激光测量仪等测量装置相集成，可实现生物样本(如心肌细胞、骨骼肌细胞)的电刺激响应检测。

基于环形分布电极的生物细胞刺激系统，包含环形分布电极和多通道双向脉冲电源。环形分布电极可装配于不同型号培养皿上，各电极片分别与多通道双脉冲电源的相应输出电极相连。并根据使用目的，将装配有环形分布电极的培养皿置于培养箱内，或与细胞跳动测量装置配合使用。

环形分布电极包含不少于4个的偶数导电电极(稳定金属或非金属)，各电极片尺寸一致(如10mm长、5mm宽、1mm厚)，以相同间隔均匀分布在圆形培养皿的内部，且保证高度一致，均能够与培养皿中的培养基接触。每个电极均通过导线与多通道双向脉冲电源的各输出端相连，从而可产生可变电场分布和刺激模式；

所述环形分布电极可与不同尺寸、型号和种类的生物培养皿相装配；

所述多通道双向脉冲电源具有4个以上输出通道，且各通道均可产生正负双向脉冲，脉冲幅值至少可在-10V到10V可调，分度值小于等于0.1V；脉冲宽度至少可在0s到20ms范围内可调，分度值小于等于1ms；脉冲频率至少可在0Hz到5Hz范围内可调，分度值小于等于1Hz；

所述细胞收缩检测系统(细胞跳动测量装置)为非侵入、无损检测系统，如原子力显微镜、激光干涉仪、相差测量仪、多普勒激光测量仪等中的一种或多种，在控制器和计算机的控制下测量并记录细胞运动状态及机械特性。

主要包括环形分布电极4和多通道双向脉冲电源6，可实现生物细胞的可变电脉冲刺激与收缩运动调控；与生物培养装置(培养箱)配合，可用于促进细胞生长分化，如图1a所示；与细胞跳动测量装置5配合，可用于细胞电刺激响应检测如图1c所示；

当将系统用于促进细胞生长分化时如图1a所示，将装配有环形分布电极的培养皿置于细胞培养箱1中，通过导线2将各电极片分别与细胞培养箱外的多通道双向脉冲电源6的正负极相连。以4对电极(8个电极片)的环形分布电极装配与直径为60mm的培养皿为例，如图1b所示，将电极片1-4与电源正极相连，电极片5-8与电源负极相连，电极片1和8为一对电极，电极片2和7为一对电极，电极片3和6为一对电极，电极片4和5为一对电极。为实现方向性一致的梯度电场，每对电极两电极片之间的电压与其距离成正比。如为实现方向单一的电场强度为2V/cm的均匀电场，电极片1和8，4和5之间距离均为23mm，则施加到电极片1和4的脉冲电势为+2.3V,电极片8和5的脉冲电势为-2.3V；电极片2和7，3和6之间的距离均为55mm，则施加到电极片2和3的脉冲电势为+5.5V，电极片7和6的脉冲电势为-5.5V。为减少电极对细胞培养基的电解，本实用新型可施加双向交替脉冲，如以电脉冲刺激频率为1Hz为例，第一秒时电极片1-4施加脉冲电势为正，电极片5-8施加脉冲电势为负，第二秒则电极片1-4施加脉冲电势为负，电极片5-8施加脉冲电势为正，如此交替施加电脉冲刺激，实现促进细胞生长分化。

当将所述系统应用于肌细胞收缩运动调控时如图1b所示，以4对电极(8个电极片)的环形分布电极装配于直径为60mm的培养皿为例，为实现单一方向的强度为2.0V/cm的均匀电场，各电极片与电源输出端的初始连接方式和所施加的电势与上一段所述相同。当需要通过改变电场方向对细胞收缩运动进行调控时，则需改变各电极片所施加的电脉冲电势。如初始状态为电极片1-4施加正脉冲电势，电极片5-8施加负脉冲电势，现将电极片2-5施加正脉冲电势，电极片6-1施加负脉冲电势，则电场方向将沿顺时针旋转45度。如需改变电场强度，则需成立比改变施加于各电极片的电势。此外，可通过同时调节多通道双向脉冲电源6各输出端的信号参数(脉宽及频率)，可调节施加于细胞的电刺激模式，从而调控细胞的收缩运动；

当将所述系统用于肌细胞电刺激响应检测时如图1c所示，将肌细胞收缩运动调控系统置于细胞跳动测量装置5下方，可实现生物细胞电刺激响应检测如图1c所示；以采用原子力显微镜(AFM)作为细胞跳动测量装置为例，将AFM探针置于肌细胞上，在环形电极4的电刺激下，肌细胞产生收缩运动，肌细胞的横向收缩引起其纵向运动，从而驱动AFM针尖运动，使得探针悬臂梁弯曲，进而使得打在悬臂梁背面的激光杠杆产生位移，导致反射到位置敏感探测器(PSD)的信号仿生变化。而为减少AFM作用力对细胞收缩运动的影响，可采用AFM的0扫面范围的接触测量模式，即采用AFM的接触模式扫描细胞，但是扫描范围设置为0，因此在PSD信号发生变化时，AFM控制器8为使悬臂梁维持在一定的形变，将驱动AFM扫面头随细胞上下运动，并通过计算机7记录细胞上下运动轨迹，从而实现细胞运动的原位无损测量。因此，通过将基于环形分布电极的生物细胞刺激系统与细胞跳动测量装置5相结合，可实现肌细胞电刺激响应检测；

当将所述系统用于促进细胞生长分化时如图1a所示，将环形分布电极4装配于细胞培养皿中，将装配有环形分布电极的培养皿3置于细胞培养箱1中，通过导线2将各电极片与细胞培养箱外的多通道双向脉冲电源6多对输出电极相连，调节电源输出脉冲，实现对培养皿中细胞的电脉冲刺激(图1a)，从而促进细胞的生长分化(图2)；调节多通道双向脉冲电源6各通道的电脉冲参数(频率、幅值、脉宽、方向)，可对肌细胞/肌管进行可变方向和模式的电脉冲刺激，从而实现肌细胞/肌管的收缩运动调控(图1b)；将装配有环形分布电极的培养皿3置于细胞跳动测量装置5下方，调节多通道双向脉冲电源6的输出脉冲，实现采用不同参数电脉冲(频率、幅值、脉宽、方向)对培养皿中细胞的电刺激，并采用细胞跳动测量装置5对细胞的跳动模式进行测量记录，从而实现生物细胞的实时电脉冲刺激响应特性检测(图1c)。

实施例一

1)取冻存的成肌细胞(C2C12),复苏后，采用5毫升细胞增殖培养基(89％体积的高糖DMEM培养基+10％体积的胎牛血清+1％体积的青链霉素混合液)以每毫升10000个细胞的密度培养于直径为60毫米的细胞培养皿中，并在37摄氏度，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养；

2)每天更换新的细胞增殖培养基，直至细胞增殖到铺满培养皿底部面积的80％；

3)吸出培养皿中的细胞增殖培养基，用无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗细胞3次，每次3分钟，加入细胞分化培养基(97％体积的高糖DMEM培养基+2％体积的马血清+1％体积的青链霉素混合液)，继续在37摄氏度，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养；

4)培养24小时后，将灭菌后的环形分布电极(8片)装配于含有细胞的培养皿中，并通过8根导线，将每个电极片与多通道双脉冲电源的8个输出电极相连，将含有细胞的装配有环形分布电极的培养皿放入培养箱继续培养，将多通道双脉冲电源置于培养箱外；

5)调节电源各通道的输出参数，如：脉冲电场强度设置为1.5V/cm、频率设为1Hz、脉冲宽度设为10ms，并将输出脉冲设置为正负交替输出，刺激时间为每刺激1小时，间歇1小时，持续时间为12小时；

6)电刺激12小时后，在无电刺激的条件下继续培养4天，并每天更换新的细胞分化培养基；

7)取出一个含有细胞的装配有环形分布电极的培养皿，观测肌管分化情况并进行免疫英冠染色，标记肌管特异性蛋白(如肌球蛋白重链)，并对染色结果进行免疫英冠成像、记录与分析(图2)；

8)取出另一个含有细胞的装配有环形分布电极的培养皿，将其置于细胞跳动测量装置(原子力显微镜系统)下方，通过调节多通道双脉冲电源各通道的输出参数，实现采用不同参数(脉冲频率、脉冲幅值、脉冲宽度、电场方向)电脉冲对培养皿中肌管进行收缩运动调控,并采用原子力显微镜的恒力零扫描范围进行细胞跳动的测量，从而实现生物肌管的促进生长分化、收缩运动调控与电刺激响应检测。