用于筛选剪接变异体或事件的方法与流程

本发明涉及一种筛选至少一个靶基因的剪接变异体或事件的方法。具体地，该方法涉及高通量筛选靶基因的剪接变异体或亚型作为药物靶标或用于表征其在全转录组范围内的生物学功能。在各种实施例中，该方法采用使用剪接转换空间位阻反义寡核苷酸来筛选和鉴定由选择性剪接或异常剪接产生的亚型作为药物靶标。本方法使用这种剪接转换空间位阻反义寡核苷酸来表征由选择性剪接或异常剪接产生的亚型的生物学功能。
背景技术：
：下一代测序(ngs)的成本降低迅速发现了全转录组范围的不同的选择性剪接(as)和环状剪接(cs)事件，该全转录组范围以特定肿瘤(比如)与其对应正常细胞(参见图1a)之间数百至数千个亚型变异体和剪接事件计数。在前者中，癌症相关亚型所翻译的蛋白质具有与从其正常对应物中表达的亚型翻译的蛋白质相反的生物学功能。比如，缺乏外显子16的从癌细胞中表达的亚型翻译的短型ig20/madd蛋白质抑制了细胞死亡，而在正常细胞中表达的保留外显子16的长型亚型翻译促进细胞死亡的蛋白质。在另一示例中，具有外显子12a包含的bin1的长亚型在黑色素瘤中表达，而短亚型(没有外显子12a)在黑素细胞中表达(一些示例，参见图2)。对于后者，已经观察到健康细胞和患病细胞之间以及处于各种生理状态的细胞之间circrna的差异表达。重要的是，特定circrna的表达或缺乏与包括动脉粥样硬化、癌症和帕金森氏病在内的疾病相关。尽管研究已经表明选择性剪接在生成蛋白质多样性中发挥主要作用，并且其失调与人类疾病有关，但是标准分析不可能实现全面审视选择性剪接和异常剪接如何调节基因功能。后基因组学时代的巨大挑战在于缺乏用于高通量功能基因组学研究的经验证的平台技术，该技术可以与大量数据生成保持同步。在这种背景下，非常需要用于对数千种选择性剪接亚型、剪接事件和/或环状剪接circrna中的每个进行功能研究以鉴定作为用于进行治疗靶向的疾病驱动机制的平台技术。在本说明书中列举或讨论显然是现有出版的文档不一定应当看作是承认该文档是现有技术的一部分或是公知常识。本文中所引用的任何文档的全部内容均通过引用并入。技术实现要素：在本发明的一方面中，提供了一种用于筛选靶基因的剪接变异体或事件的方法，该方法包括：(a)提供能够在靶基因上诱导第一剪接事件以表达第一剪接变异体的第一反义寡核苷酸以及能够在靶基因上诱导第二剪接事件以表达第二剪接变异体的第二反义寡核苷酸；(b)使第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mrna杂交；以及(c)表征剪接事件的效应。具体地，本发明的方法包括：鉴定细胞组之间亚型的差异表达或鉴定在细胞组中相似表达的亚型的表达。可以包括用药物和/或生物试剂或过程处理之前或之后的细胞之间或在经受生物学过程(诸如发育或分化)之前和之后的无病细胞和有病细胞之间的差异表达。在各种实施例中，本发明提出了一种单向剪接转换筛选方法，其中，单个aon诱导或引起剪接事件发生，并且所述方法包括以下步骤：通过查看细胞的表型来表征该事件，该表型表达该亚型；并且确定剪接事件对细胞具有什么影响，即，剪接事件如何并且以何种状态改变细胞的表型。例如，aon可以引起剪接事件，该剪接事件导致靶基因的亚型的表达，该亚型导致原本健康的细胞患病或不健康。在下文进行详细描述的其他实施例中，公开了一种双向剪接转换筛选，其中，本发明的aon用于表征来回转换两个亚型的表达的剪接事件。“剪接变异体”意指包括源自单个靶基因或基因家族的任何蛋白质亚型。这些蛋白质亚型可以由任何这种“剪接事件”或机制(诸如选择性剪接或其他转录后修饰)来形成或产生。该术语还包括在结构和组成上都可以不同的任何多种蛋白质亚型。通过这种剪接事件，细胞机制能够从基因中选择不同蛋白质编码片段(外显子)，甚至从rna中选择外显子的不同部分以形成不同的mrna序列。为了适当表达绝大多数蛋白质编码基因，需要剪接前体mrna，因此，靶向该过程提供了一种操纵由基因产生蛋白质的手段。在本文中，术语“剪接变异体”和“亚型”可以互换使用。本文在下文描述了可能的剪接事件的完整列表。剪接过程实际上是由剪接因子介导的一系列反应，该反应在转录之后但在翻译之前对新生rna进行。因此，“前体mrna”是既包含外显子又包含一个或多个内含子的rna，而“mrna”是一个或多个内含子已经移除并且外显子依次接合在一起使得核糖体可以从中翻译出蛋白质的rna(成熟mrna)。由多个同时剪接事件中的一个剪接事件产生的靶基因的剪接变异体或选择性剪接变异体包括已知转录物和带注释的转录物以及新颖转录物和/或无带注释的转录物。“寡核苷酸”是指任何多核苷酸。“多核苷酸”是由核苷酸组成的寡聚物。多核苷酸可以由dna、其rna修饰形式、或其组合组成。本文中所使用的术语“核苷酸”或其复数可与本文中所讨论的或本领域已知的修饰形式互换。在某些实例中，本领域使用术语“核碱基”，其涵盖天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修饰。因此，核苷酸或核碱基意指天然存在的核碱基：腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)；以及非天然存在的核碱基，诸如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、n4,n4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、n’,n’-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mc)、5-(c[3]-c6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷、以及在bermer等人的美国专利第5,432,272号以及susanm.freier和karl-heinzaltmann于1997年《核酸研究(nucleicacidsresearch)》第25卷第4429至4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。此外，术语“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其他天然存在的核碱基和非天然存在的核碱基包括在美国专利第3,687,808号(merigan等人)公开的核碱基；sanghvi在《反义研究与应用(antisenseresearchandapplication)》的第15章公开的核碱基；ed.s.t.crooke和b.lebleu，crc出版社，1993中公开的核碱基；englisch等人，1991，angewandtechemie，国际版，30：613-722(尤其参见第622和623页，以及《高分子科学和工程学简明百科全书(conciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering)》，j.i.kroschwitzed.，johnwiley&sons，1990，第858至859页，cook，抗癌药物设计(anti-cancerdrugdesign)1991，6，第585至607页中公开的核碱基，其中每篇通过引用整体并入本文。在各个方面中，多核苷酸还包括一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，其包括可以用作核碱基的诸如杂环化合物之类的化合物，这些化合物包括某些“通用碱基”，它们在传统意义上不是核苷碱基，但是用作核苷碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯、可选取代的吲哚(例如，5-硝基吲哚)和可选取代的次黄嘌呤。其他理想通用碱基包括吡咯以及二唑或三唑衍生物，其包括本领域已知的通用碱基。多核苷酸还可以包括经修饰的核碱基。“经修饰的碱基”在本领域中理解为可以与天然碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或可以与非天然存在的碱基配对的碱基。在ep1072679和wo97/12896中描述了示例性的经修饰的碱基，其公开内容通过引用并入本文。经修饰的核碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-o-甲基衍生物、6-甲基衍生物和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(伪尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨代、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是，5-溴代)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他经修饰的碱基包括三环嘧啶，诸如吩恶嗪胞苷(1h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g夹子，诸如取代吩恶嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的碱基，例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。附加核碱基包括在美国专利第3,687,808号中公开的核碱基；《聚合物科学和工程的简明百科全书》，第858至859页，kroschwitz,j.i.,ed.johnwiley&sons，1990公开的核碱基；englisch等人，1991，angewandtechemie，国际版，30：613中公开的核碱基；以及sanghvi,y.s.，第15章，《反义研究和应用》，第289至302页，crooke,s.t.和lebleu,b.,ed.,crc出版社,1993公开的核碱基。这些碱基中的某些碱基用于增加多核苷酸的结合亲和力，并且包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶、以及n-2、n-6和o-6取代嘌呤，其包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，在某些方面中，与2'-o-甲氧乙基糖修饰组合。参见美国专利第3,687,808号、美国专利第4,845,205号、美国专利第5,130,302号、美国专利第5,134,066号、美国专利第5,175,273号、美国专利第5,367,066号、美国专利第5,432,272号、美国专利第5,457,187号、美国专利第5,459,255号、美国专利第5,484,908号、美国专利第5,502,177号、美国专利第5,525,711号、美国专利第5,552,540号、美国专利第5,587,469号、美国专利第5,594,121号、美国专利第5,596,091号、美国专利第5,614,617号、美国专利第5,645,985号、美国专利第5,830,653号、美国专利第5,763,588号、美国专利第6,005,096号、美国专利第5,750,692号、以及美国专利第5,681,941号，其公开内容通过引用并入本文。“反义寡核苷酸”意指包括经由watson-crick碱基配对以序列特异性方式与前体mrna杂交或碱基配对的任何短核酸序列：短核酸、合成核酸、反义核酸、经修饰的核酸，并且可以通过阻断剪接机制各成分与前体mrna之间发生的rna-rna碱基配对或蛋白质-rna结合相互作用，来破坏转录物的正常剪接库。该核酸被称为“反义寡核苷酸”(antisenseoligonucleotide，aon)，因为其碱基序列与靶基因的信使rna(mrna)互补，该信使rna(mrna)称为“正义”序列。aon-mrna异源双链体的形成触发rnaseh的活性，从而导致mrna降解，通过核糖体活性的空间位阻来诱导翻译停滞，通过抑制剪接来干扰mrna成熟，或使细胞核中的前体mrna不稳定，继而导致靶蛋白质表达的下调。aon在蛋白质靶的鉴定和验证中不仅是有用的实验工具，而且还是用于蛋白质表达失调的疾病的高度选择性治疗策略。本领域技术人员可以容易设计根据本公开的反义多核苷酸。例如，本领域的一般教导包括但不限于wee等人，plosone.3:e1844(2008)；pramono等人，humangenether.23:781-790(2012)；aartsma-rus等人，methodsmolbiol.867:117-29(2012)；aartsma-rus等人，methodsmolbiol.867:97-116(2012)；vanroon-mom等人，methodsmolbiol.867:79-96(2012)，其各自通过引用并入本文。一般准则还包括：尝试避免3个连续的g或c核苷酸，选择有利于自身结构的长度和序列(避免发夹结构(hairpinning))，并且避免可能形成引物二聚体的那些序列。在一些实施例中，本公开的反义多核苷酸是被设计为与外显子或内含子或内含子-外显子边界特异性杂交的反义多核苷酸，使得反义多核苷酸与完全在核酸外显子内的序列特异性杂交，或者当反义多核苷酸与核酸特异性杂交时，反义多核苷酸的约一个核苷酸跨越所述内含子-外显子边界。在其中反义多核苷酸与完全在外显子内的序列特异性杂交的一些实施例中，应当设想反义多核苷酸的末端是来自外显子末端的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。在其他实施例中，本公开的反义多核苷酸是被设计为与靶核酸的内含子-外显子边界特异性杂交的反义多核苷酸，使得反义多核苷酸的约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸跨越所述内含子-外显子边界。应当理解，核苷酸可以在外显子侧或内含子侧上“跨越内含子-外显子边界”。因此，主要与内含子序列特异性杂交并且仅与邻接外显子的一个核苷酸杂交的反义多核苷酸可能“跨越内含子-外显子边界”一个核苷酸。同样，与外显子序列特异性杂交并且仅与邻接内含子的一个核苷酸杂交的反义多核苷酸可能“跨越内含子-外显子边界”一个核苷酸。在任何上述实施例中，反义多核苷酸的长度为至少约10个核苷酸并且至多约15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在各种实施例中，反义寡核苷酸可以包括经修饰的多核苷酸主链。经修饰的多核苷酸主链可以包括取代至少一个多核苷酸的糖的修饰部分。还考虑使用经修饰的多核苷酸，其中，多核苷酸中的核苷酸单元的一个或多个糖和/或一个或多个核苷酸间连键分别被“非天然存在的”糖(即，除核糖或脱氧核糖以外的糖)或核苷酸间连键取代。在一个方面中，该实施例考虑了肽核酸(pna)。在pna化合物中，多核苷酸的糖主链被含酰胺的(例如，n-(2-氨乙基)-甘氨酸单位之间的肽键)主链取代。参见，例如，美国专利第5,539,082号、美国专利第5,714,331号和美国专利第5,719,262号以及nielsen等人，science，1991，254，1497-1500，其公开内容通过引用并入本文。经修饰的多核苷酸还可以包括一个或多个取代糖基。在一个方面中，糖的修饰包括锁核酸(lna)，其中，2'-羟基链接到糖环的3'或4'碳原子，从而形成双环糖基。在某些方面中，该链接为桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-ch[2]-)[n]基团，其中，n为1或2。在wo98/39352和wo99/14226中对lna及其制备进行了描述，其公开内容通过引用并入本文。在本发明中，优选地，反义寡核苷酸包括经修饰的多核苷酸主链。经修饰的多核苷酸主链可以包括取代至少一个多核苷酸的糖的经修饰的部分。经修饰的部分可以选自包括以下各项的组：磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholinooligomer，pmo)、肽缀合的磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(peptide-conjugatedphosphorodiamidatemorpholinooligomer，ppmo)和非肽树枝状八胍部分标记的吗啉代寡聚物。在各种实施例中，经修饰的多核苷酸主链包括至少一个经修饰的核苷酸间连键。该经修饰的核苷酸间连键包括经修饰的磷酸盐。更优选地，经修饰的磷酸盐是选自包括以下各项的组中的任一个：取代硫原子的非桥接氧原子、膦酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯、吗啉代磷酸酯、哌嗪代磷酸酯、以及氨基磷酸酯。在本发明的各种实施例中，反义寡核苷酸包含选自包括以下各项的组的主链：核糖核酸、脱氧核糖核酸、dna硫代磷酸酯、rna硫代磷酸酯、2'-o-甲基-寡核糖核苷酸和2'-o-甲基-寡脱氧核糖核苷酸、2'-o-烃基核糖核酸、2'-o-烃基dna、2'-o-烃基rna硫代磷酸酯、2'-o-烃基dna硫代磷酸酯、2'-f-硫代磷酸酯、2'-f-磷酸二酯、2'-甲氧乙基硫代磷酸酯、2-甲氧乙基磷酸二酯、脱氧亚甲基(甲亚氨基)(脱氧mmi)、2'-o-烃基mmi、脱氧甲基膦酸酯、2'-o-烃基甲基膦酸酯、吗啉代、4'-硫代dna、4'-硫代rna、肽核酸、3'-酰胺化物、脱氧3'-酰胺化物、2'-o-烃基3'-酰胺化物、锁核酸、环己烷核酸、三环dna、2'氟代-阿拉伯糖核酸、n3'-p5'氨基磷酸酯、链接的氨基甲酸酯、链接的磷酸三酯、尼龙主链修饰、以及前述主链的混合物。反义寡核苷酸的长度(即，其中的核苷酸的数目)并非至关重要，只要它选择性地结合到预期位置即可，并且可以根据常规过程确定。一般而言，反义寡核苷酸的长度为8、10或12个核苷酸，长度至多为20、30或50个核苷酸。可以根据已知技术制备不激活rnaseh的反义寡核苷酸。参见例如授予pederson等人的美国专利第5,149,797号(本文中所引用的所有专利参考文献的公开内容通过引用并入本文)。可以作为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列的这种反义寡核苷酸仅包含任何结构修饰，该结构修饰在空间上阻碍或阻止rnaseh与包含寡核苷酸作为其一个成员的双链体分子结合，该结构修饰基本上不会阻碍或破坏双链体形成。因为双链体形成所牵涉到的寡核苷酸的各个部分与将rnaseh与其结合所牵涉到的那些部分实质上不同，所以可以获得不激活rnaseh的许多反义寡核苷酸。例如，这种反义寡核苷酸可以是其中核苷酸间桥接磷酸残基中的至少一个或全部是经修饰的磷酸盐(诸如甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、吗啉代磷酸酯、哌嗪代磷酸酯、以及氨基磷酸酯)的寡核苷酸。例如，核苷酸间桥接磷酸残基每隔一个可以根据描述进行修饰。在另一非限制性实例中，这种反义寡核苷酸是其中至少一个或所有核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，c1-c4烷基、直链或支链烷基、饱和或不饱和烷基，诸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、以及异丙基)的寡核苷酸。例如，核苷酸每隔一个可以根据描述进行修饰。还参见p.furdon等人，nucleicacidsres.17,9193-9204(1989)；s.agrawal等人，proc.natl.acad.sci.usa87,1401-1405(1990)；c.baker等人，nucleicacidsres.18,3537-3543(1990)；b.sproat等人，nucleicacidsres.17,3373-3386(1989)；r.walder和j.walder，proc.natl.acad.sci.usa85,5011-5015(1988)。在各种实施例中，本发明的反义寡核苷酸是空间位阻反义寡核苷酸(staon)。本发明的staon被设计为诱导剪接事件。这些包括通过但不限于以下各项调节选择性剪接：(1)一个或多个(连续或非连续)外显子排除；(2)一个或多个(连续或非连续)外显子包含；(3)选择一对互斥外显子之间的近端外显子；(4)选择一对互斥外显子之间的远端外显子；(5)使用一个或多个外显子的近端选择性5'剪接位点；(6)使用一个或多个外显子的远端选择性5'剪接位点；(7)使用一个或多个外显子的近端选择性5'剪接位点和远端选择性5'剪接位点之间的剪接位点；(8)使用一个或多个外显子的近端选择性3'剪接位点；(9)使用一个或多个外显子的远端选择性3'剪接位点；(10)使用一个或多个外显子的近端选择性3'剪接位点和远端选择性3'剪接位点之间的剪接位点；(11)保留一个或多个内含子；(12)恢复一个或多个内含子；(13)使用位于一个外显子内或多个外显子上的选择性或竞争翻译起始密码子(aug)；(14)使用位于一个外显子内或多个外显子上的选择性或竞争终止密码子(uag、uaa和uga)；(15)使用可以位于一个外显子内、多个外显子上、一个内含子内或多个内含子上的选择性或竞争聚腺苷酸化位点(例如但不限于aauuaaa、uguaa及其简并形式)；(16)环状剪接或反向剪接一个外显子；(17)环状剪接或反向剪接两个或更多个连续外显子，该两个或更多个连续外显子可以包括一个或多个内含子，其中，每个内含子的侧面是其中的一对连续外显子；和/或(18)线性剪接包含一个或多个连续外显子的环状rna。在不失一般性的前提下，上述非限制性的选择性剪接方式适用于包括5'和3'utr处的外显子和内含子在内的编码外显子和非编码外显子，还适用于包括长非编码rna(lncrna)在内的非编码rna。staon可以被其他形式的试剂取代，例如，crispr/cas系统sgrna(单链引导rna)，以调节一种或多种上述选择性剪接方式。本发明中所靶向的基因的序列如下：seqid1apaf1_gdnaapaf1基因seqid2bag4_gdnabag4基因seqid3bclaf1_gdnabclaf1基因seqid4bin1_gdnabin1基因seqid5birc5_gdnabirc5基因seqid6bmf_gdnabmf基因seqid7casp10_gdnacasp10基因seqid8eed@ensg00000074266.17_gdnaeed基因seqid9kat6a@ensg00000083168.9_gdnakat6a基因seqid10krbox4_gdnakrbox4基因seqid11mcl1_gdnamcl1基因seqid12nr1h2_gdnanr1h2基因seqid13prkab2_gdnaprkab2基因seqid14znf304_gdnaznf304基因seqid15znf548_gdnaznf548基因下文的表1a示出了用于靶向上述基因的那些aon的序列。表1a在各种实施例中，剪接事件可以是以下各项中的任一项：a)一个或多个(连续或非连续)外显子排除；b)一个或多个(连续或非连续)外显子包含；c)选择一对互斥外显子之间的近端外显子；d)选择一对互斥外显子之间的远端外显子；e)使用一个或多个外显子的近端选择性5'剪接位点；f)使用一个或多个外显子的远端选择性5'剪接位点；g)使用一个或多个外显子的近端选择性5'剪接位点和远端选择性5'剪接位点之间的剪接位点；h)使用一个或多个外显子的近端选择性3'剪接位点；i)使用一个或多个外显子的远端选择性3'剪接位点；j)使用一个或多个外显子的近端选择性3'剪接位点和远端选择性3'剪接位点之间的剪接位点；k)保留一个或多个内含子；l)恢复一个或多个内含子；m)环状剪接或反向剪接一个或多个连续外显子；以及n)线性剪接包含一个或多个连续外显子的环状rna。在一些实施例中，剪接事件是外显子跳跃，其中，外显子跳跃通过反义寡核苷酸所施加的空间位阻诱导。这些反义寡核苷酸对一个或多个rna结合剪接调节子施加空间位阻效应。例如，在各种实施例中，寡核苷酸可以通过空间位阻阻止mrna的翻译。每个staon可以被设计为在特定位点处与新生mrna互补结合，并且对rna结合剪接调节子施加空间位阻效应，这对于外显子识别及其剪接至关重要。从机理上讲，当staon诱导排除特异性框外外显子(out-of-frameexon)时，其中特异性框外外显子在成熟rna中产生许多下游提前终止密码子的，对所得mrna进行靶向以经由无义介导的衰变过程进行降解。可以在pct公开号wo2011078797a2中获得适用于本发明的设计、选择和验证staon的技术，其全部内容在此通过引用并入。如本文中所使用的，“杂交”意指根据watson-crickdna互补性、hoogstein结合、或本领域已知的其他序列特异性结合的规则，在两个或三个核酸链之间通过氢键进行的相互作用。可以在本领域已知的不同严格性条件下执行杂交。所使用的杂交的严格性水平可以依据所需的敏感性水平、特定探针特点(诸如探针长度和/或退火温度)、或探针序列与感兴趣序列之间的同源性程度而变化。因此，敏感性和特异性的考虑将确定特定测定所需的杂交严格性。本领域普通技术人员容易确定杂交反应的“严格性”，其通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度才能进行适当的退火，而较短的探针则需要较低的温度。杂交通常取决于变性dna在低于其解链温度的环境中存在互补链时重新退火的能力。探针和可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。关于杂交反应严格性的更多细节和说明，参见ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology(wileyintersciencepublishers,1995)或者线上协议url:www.protocol-online.net/molbio/index.htm)。在示例中，杂交可以于55℃和70℃之间的温度下在包含介于0.1xssc和6xssc之间的水溶液中执行。本领域中众所周知的是，温度越高或ssc浓度越低，杂交条件就越严格。“高严格性”意指2xssc和65℃。1xssc为0.15mnacl/0.015m柠檬酸钠。在高严格性的情况下杂交的aon包括在所要求保护的发明的范围之内。在各种实施例中，本发明的方法可以在具有孔阵列的板模板中进行。如此，第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mrna的杂交可以在板模板中的单独孔中进行。稍后示出其示例。在各种实施例中，第一剪接事件和第二剪接事件是相反事件，第一反义寡核苷酸诱导剪接事件，而第二反义寡核苷酸逆转剪接事件。在图1a所示的示例中，一个细胞可以具有两个或更多个状态。状态1可能是健康状态，而状态2可能是患病状态。这两个或更多个状态可能取决于单个感兴趣的靶基因所表达的亚型。如已经理解的，选择性剪接可以产生细胞中单个靶基因所表达的不同亚型。为了便于描述，让我们考虑由单个基因的选择性剪接产生的两种亚型：亚型a和亚型b。亚型a可能在健康细胞中表达(状态1)，而亚型b(表达时)产生患病细胞(状态2)。图1b进一步图示了根据本发明的实施例的aon的用途，其中，本发明包括剪接事件对靶基因的细胞的表型(基于亚型的表达)的效应的筛选和表征方法。如此，在本发明中，“相反事件”意指基于可能由单个靶基因由于选择性剪接而产生/表达的两个或更多个亚型的表达而可能出现的细胞的两个或更多个状态。因此，在本发明的非限制性实施例中，第一反义寡核苷酸诱导剪接事件，该剪接事件导致产生亚型，其导致该亚型的表达并且产生细胞的所述状态(例如，从状态1到状态2)，而第二反义寡核苷酸诱导逆转，即，诱导剪接事件，该剪接事件导致产生亚型，其导致亚型的表达并且产生细胞的另一状态(例如，从状态1到状态2)，在处于健康状态的细胞中观察到的基因的至少一个亚型的表达或选择性剪接事件“转换”到在处于患病状态的细胞中观察到的基因的至少一个亚型的表达或选择性剪接事件，反之亦然；或者增加在用药物和/或生物过程处理之前和之后的在一个或多个细胞的健康状态和患病状态下或在不同细胞类型之间观察到的基因的至少一个亚型的表达或剪接事件，反之亦然。在同一细胞组中，同一基因可能表达两个或更多个不同的亚型。如此，在各种实施例中，该方法还包括(a)提供细胞组，该细胞组具有靶基因的两个或更多个剪接变异体或事件；(b)使第一反义寡核苷酸与靶基因的前体mrna杂交，并且使第二反义寡核苷酸与所表达的靶基因的前体mrna杂交。本文中，仅存在细胞组，并且靶基因表达至少两个亚型。在该特定实施例中，筛选被称为双向筛选。这意味着本发明的方法来回转换两个亚型的表达。第一反义寡核苷酸诱导剪接事件，而第二反义寡核苷酸诱导对同一细胞组内相同靶基因的另一剪接事件。第一反义寡核苷酸将表达第一剪接变异体的靶基因的剪接事件转换为表达第二剪接变异体的剪接事件，而第二反义寡核苷酸将表达第二剪接变异体的靶基因的剪接事件转换为表达第一剪接变异体的剪接事件。在各种实施例中，该方法还包括：(a)提供第一细胞组和第二细胞组，每个细胞组具有靶基因的不同剪接变异体或事件；以及(b)使第一反义寡核苷酸与在第一细胞组中表达的靶基因的前体mrna杂交，并且使第二反义寡核苷酸与在第一细胞组中表达的靶基因的前体mrna杂交。所选择的不同细胞组的状态可能已知，例如，它们是处于健康状态还是处于患病状态。因此，基于本发明进行的实验实现了相对于不同亚型的表达来表征剪接事件，因此表征细胞的表型。每个细胞组的杂交可以在板模板中的单独孔中进行。该细胞集合可以是任何不同类型的细胞，只要它们适合于本发明的实践即可。与先前参考细胞的不同状态所描述的，这种细胞组的非限制性示例包括处于健康状态的细胞(例如，未转化的细胞或天然存在的细胞)和处于患病状态的细胞(例如，癌细胞)、用物质或药物(例如，化学试剂或生物试剂)或过程处理过或未处理过的细胞。对本文中所描述的筛选中使用的细胞集合的数目没有限制。在各种实施例中，第一反义寡核苷酸将在第一细胞组中表达的靶基因的剪接事件转换为第二细胞组的剪接事件，而第二反义寡核苷酸将在第二细胞组中表达的靶基因的剪接事件转换为第一细胞组的剪接事件。在各种实施例中，表征剪接变异体的效应的步骤包括：基于检测或观察到细胞的表型来鉴定/分析/表征由靶基因表达的剪接变异体。具体地，确定剪接事件的效应的步骤包括：检测剪接变异体所表达的细胞的表型，检测没有表达剪接变异体的细胞的表型，检测没有表达剪接变异体所源自的靶基因的细胞的表型，并且将剪接事件与它们在至少两个细胞组中的相对表达相关联。鉴定蛋白亚型的方法可以有很多种。可以使用用于鉴定基因表达的方法，诸如northern和southern印迹技术。可替代地，可以使用本领域中众所周知的方法，诸如使用电泳、抗体和质谱分析。在本发明中，通过检测剪接变异体所表达的细胞的表型并且将剪接事件与其在至少两个细胞组中的相对表达相关联，可以鉴定剪接变异体或事件。细胞的表型包括检测选自由以下各项组成的非限制性组的细胞的特点：细胞形态、细胞活力、细胞增殖、细胞死亡、细胞周期、细胞迁移、侵袭性或衰老、对药理或生物试剂的敏感性、或细胞标记物、分子标记物、生化标记物、代谢标记物、表观遗传学标记物、或生物能学标记物。在各种实施例中，该方法还包括：提供和使用第三反义寡核苷酸以抑制靶基因的表达。在各种实施例中，该方法还包括：提供至少一个“抑制试剂”以抑制、压抑或敲除靶基因；该试剂可以作用于靶基因的mrna(诸如诱导无义介导的衰变的staon、sirna、shrna、经由rnaseh介导的降解诱导靶基因的mrna降解的gapmer、或rnai)上；可以经由化学分子、抗体、肽或适体作用于靶基因的蛋白质上；或可以经由诸如crispr/cassgrna(引导rna)之类的dna编辑工具作用于靶基因的dna上。该试剂与细胞组接触，以确定压抑、抑制或敲除靶基因的效应。在最后步骤中，该方法包括：比较“剪接转换staon”和抑制试剂对细胞的效应。在各种实施例中，抑制试剂与至少两个细胞组接触，每个细胞组必须表达靶基因。在一些实施例中，抑制试剂可以是抑制靶基因表达的反义寡核苷酸。在各种实施例中，第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mrna的杂交在板模板中的单独孔中进行。在各种实施例中，至少一个反义寡核苷酸与至少两个细胞组接触，每个细胞组在靶基因的特定剪接事件的丰度上不同。抑制试剂与至少两个细胞组接触，每个细胞组必须表达靶基因。在备选实施例中，两个细胞组不必在靶基因的特定剪接事件的丰度上有所不同。比如，在鉴定合成致死药物靶标的筛选中，相同的反义寡核苷酸可以与两个细胞组接触，这两个细胞组在靶基因特异性剪接事件的丰度上没有差异，从而希望(或在该事件中)当对剪接事件进行诱导或逆转时，一个细胞组受到的影响相当大。在各种实施例中，该方法还包括：提供能够在一个或多个靶基因上诱导至少一个剪接事件的多个反义寡核苷酸。在各种实施例中，可以独立或组合使用对感兴趣特定剪接变异体具有相同效应的两个或更多个staon。在各种实施例中，可以使用可以对靶基因的一个以上的剪接事件具有效应的一个staon。在各种实施例中，可以组合使用两个或更多个staon，其中，每个staon对靶基因的不同剪接事件具有各自的效应。在各种实施例中，可以组合使用两个或更多个staon，其中，每个staon对一个或多个靶基因的一个或多个剪接事件具有各自的效应。在各种实施例中，本方法是实现同时确定一个或多个靶基因的若干个不同剪接变异体或剪接事件的多重方法。在实施例中，该方法在96孔板、192孔板或384孔板中进行，并且能够高通量表征独立或组合所筛选的10至1,000,000,000,000,000或更多个剪接变异体和选择性剪接事件的治疗价值和/或生物学功能。在其他实施例中，通过统计学方法将10个或更多个剪接变异体和/或剪接事件的筛选与每个剪接变异体或剪接事件对细胞的效应的比较和排序或整理捆绑在一起。在各种实施例中，该方法提供：获得微阵列表达水平数据。例如，该方法可以提供：应用数学算法(诸如数学方程式)来确定靶基因的亚型表达。本领域技术人员应当理解，本方法可能包括：使用任何合适的阳性对照和/或阴性对照，例如，乱序staon。本发明提供了一种基于空间位阻反义寡核苷酸(staon)技术的技术平台，其用于高通量双向表征每个差异剪接事件的治疗价值。应用包括药物靶标发现、药物增强子靶标发现、合成致死药物靶标发现、以及全基因组功能基因组研究。如此，有利地，本发明提供了一种双向剪接转换筛选平台，其用于针对特定靶基因来表征在两个或更多个状态或细胞组之间表达的亚型。该平台实现一种发现新种类的药物靶标的新范例，这些药物靶标无法使用既定的筛选平台来开发。独特的双向筛选方法降低传统单向敲低筛选固有的假阳性药物靶标，鉴定具有广泛治疗指数的靶，并且提供对所鉴定的靶的机理洞察力。附图说明为了能够完全理解本发明并且容易地将其付诸于实践，现在，仅通过非限制性示例对本发明的优选实施例进行描述，参照说明性附图进行描述。在附图中：图1a是两个细胞样品之间的差异剪接事件的数目；图1b是示出了根据本方法的实施例的在表征剪接转换事件中使用aon的示意图。图2是经受as以表达与人类癌症高度相关的两种亚型的代表性基因；图3是双向剪接转换筛选；图4是96孔staon筛选板；图5和图6是基于表型的癌症药物靶标筛选的示意图；图7示出了诱导剪接事件转换和敲低后a549细胞活力的结果；图8示出了casp10、bin1和mcl1中诱导剪接事件转换后相对a549细胞活力(rcv)的结果；图9示出了诱导剪接事件转换和敲低后imr90细胞活力的结果；图10示出了诱导剪接事件转换和敲低后hela细胞活力的结果；图11示出了a549细胞中bclaf1外显子5的双向剪接事件转换的结果。a5ss(l->s)：将选择性5'的使用从远端剪接位点转换到近端剪接位点，导致表达较短的靶外显子。a5ss(s->l)：将选择性5'的使用从近端剪接位点转换到远端剪接位点，导致表达较长的靶外显子。表a1(如上所示)总结了每个经调节的剪接事件的细节。图11a是当用乱序对照staon，nc2处理时，通过观察到的细胞活力进行标准化的细胞活力(垂直轴)。当细胞活力(标准化)分别小于1、等于1、以及大于1时，该效应是抑制性的、无、以及增殖性的。图11b是当靶基因被敲低时，通过使用对应的效应对其对活力的效应进行标准化而获得的来自剪接事件转换的rcv；图12示出了a549、imr90和bmf细胞中bmf外显子5的双向剪接事件转换的结果。a3ss(l->s)：将选择性3'的使用从近端剪接位点转换到远端剪接位点，导致表达较短的靶外显子。a3ss(s->l)：将选择性3'的使用从远端剪接位点转换到近端剪接位点，导致表达较长的靶外显子。表a1总结了每个经调节的剪接事件的细节。图12a是当使用乱序对照staon，nc2处理时，通过观察到的细胞活力对细胞活力(垂直轴)进行标准化。当细胞活力(标准化)分别小于1、等于1、以及大于1时，该效应是抑制性的、无、以及增殖性的。图12b是当靶基因被敲低时，通过使用对应的效应对其对活力的效应进行标准化而获得的来自剪接事件转换的rcv；以及图13示出了模拟细胞中hnrnpm相关的线性剪接事件抑制细胞生长的结果。图13a是示出了与乱序staon处理的细胞相比较staon处理的细胞的细胞生长和外显子排除/包含结果的示意图。图13b是在特定staon(以数字给出)的处理后总体细胞生长产量(y轴)相对于外显子排除/包含水平(x轴)的散点图。基于通过fla-pcr确定的靶峰面积来测量和计算相对外显子包含水平。示出了相对于用乱序aon处理的细胞的值。标签(更多细节在表1a中)：scr：乱序aon；772-773：staon分别诱导znf548外显子3排除；773-776：staon分别诱导znf548外显子3包含；760：staon诱导prkab2外显子8排除；761-765：staon分别诱导prkab2外显子8包含。具体实施方式定义关于特定实施例并且参考某些附图对本发明进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，出于说明性目的，一些元件的尺寸可能被放大并且未按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”的情况下，它不排除其他元件或步骤。当提及单数名词时，使用不定冠词或定冠词，例如，“一”、“一个”、或“该”，除非特别说明，否则这包括该名词的复数形式。更进一步地，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元件，而不必用于描述顺序次序或时间次序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文中所描述的本发明的实施例能够以不同于本文中所描述或示出的其他顺序来操作。仅提供以下术语或定义以帮助理解本发明。除非本文中具体定义，否则本文中所使用的所有术语与本发明领域的技术人员具有相同的含义。对于本领域的定义和术语，从业者具体涉及sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborpress,plainsview,newyork(1989)；以及ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology(supplement47),johnwiley&sons,newyork(1999)。本文中所提供的定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。本发明提供了一种双向剪接转换筛选平台，其使得能够对每个差异剪接事件的治疗价值和生物学作用进行高通量双向表征。为了解释双向剪接转换筛选，以bin1基因为例，该bin1基因的外显子12a保留在黑色素瘤细胞中，但是黑色素细胞中却不存在(图2)。如图3所示，staon#1(空间位阻反义寡核苷酸)被设计为诱导黑色素瘤细胞中bin1外显子12a的排除，并且将bin1表达“转换”为正常亚型，从而逆转了与肿瘤发生相关联的剪接事件。另一方面，staon#2将bin1表达转换为黑素细胞中的癌症亚型。staon#3通过在两个细胞中诱导无义介导的衰变(nmd)(在单独实验中进行的)来抑制bin1表达。随后，将bin1外显子12a的剪接的治疗价值与在每个筛选方向上观察到的一个或多个特定细胞标记物的标准化幅度改变相关联；当抑制bin1表达时，使用观察到的改变对幅度改变进行标准化。如稍后所详细描述的，根据本发明实施例的表征和筛选剪接变异体和/或事件(鉴定哪些亚型以供筛选)的一般步骤如下：1.表征剪接事件以供筛选。这可以分为以下步骤：a.对在不同状态/表型、生理条件、治疗计划等下从细胞中提取的至少两个rna样品执行rna测序。优选读长(read)非常长(每个读长至少20,000个碱基)的深配对末端rna测序或单分子测序平台。b.对来自rna测序的原始读长执行生物信息学分析，以获得所有样品中发生的剪接事件、差异剪接事件(即，仅在其中一个样品中发生的差异剪接事件)、以及两个样品中均没有发生的剪接事件。这种生物信息学分析包括使用开源比对软件包或可商购的比对软件包(例如，tophat(http://tophat.cbcb.umd.edu/)、star(https://github.com/alexdobin/star)等)将原始读长映射到参考基因组。然后，对经比对的读长进行量化以使用例如cufflinks(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/)和edger(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edger.html)进行表达。基因被认为在p<0.05和abs(log2[fpkm])比例>1时有明显差异表达；fpkm＝每百万个映射读长的转录物的每千碱基片段。为了确定差异剪接事件，使用rmats(http://rnaseq-mats.sourceforge.net/)对接合读长和落入ensembl基因定义内受测区域的读长进行计数。如果支持特异性事件的读长之和超过十个读长并且p<0.05，则剪接事件被标记为显着。应当指出：可以依据严格要求更改p值标准；较低的p值对应于更严格的标准。c.(可选步骤)通过实验验证在上一步中获得的剪接事件。这可以通过使用传统pcr和sanger测序来进行。d.(可选步骤)缩小剪接事件列表以进行筛选。这可以通过文献调查、基因本体数据、蛋白质结构域数据等来进行。当存在数以万计的剪接事件以供筛选时或依据研究预算，该步骤是必需的。2.设计、合成和验证以下三个筛选库。a.诱导剪接事件以供筛选的staon。b.逆转剪接事件以供筛选的staon。c.敲低或敲除靶基因。实现该步骤的试剂类型取决于实验室的偏好。对于敲低，我们可以设计诱导无义介导的衰变的staon，或设计诱导rnaseh降解的gapmer，或设计诱导rnai的sirna/shrna。对于基因敲除，将设计基于crispr的引导rna(grna)。3.执行筛选。a.每个剪接事件转换的staon以最终浓度为100nm将被放置于多孔(例如，96孔或384孔)板中。依据所研究的细胞，staon可以经由试剂(诸如基于脂质体或聚合物的转染)或电穿孔转运到细胞中。b.用于敲除或敲低靶基因的每个试剂将被放置在每个孔中。最终浓度和转运方案取决于所使用的试剂。对于nmd诱导的staon和gapmer，条件与上述相似。c.将细胞放置在所有孔中。应当指出：i.依据筛选设计，可以以任意组合对步骤3(a)，3(b)和3(c)进行排序。ii.依据筛选设计，可以向细胞增加附加处理。比如，可以添加药物以筛选出将导致耐药性或增强药物功效的剪接事件。iii.在每个板中，必须存在用于乱序staon的至少一个孔以及用于未处理的staon的一个孔。d.重复上述步骤两次或三次。每次筛选重复三次。4.读出。细胞读出和/或分子读出的类型(因此使用的实验方案和设备)取决于筛选的目的。代表性示例是细胞活力、细胞周期分期、细胞死亡、细胞增殖、细胞迁移、细胞形态、细胞分化状态等。5.鉴定对一个或多个筛选目标有价值的特异性剪接事件的数据分析。本文中给出的标准化细胞活力和相对细胞活力(rcv)的定义可以很容易地推广到其他类型的读出中以用作参数。示例我们在下文列出本发明的具体示例。方法和材料staon和gapmer的合成。staon合成为由硫代磷酸酯主链链接的单链2'-o-甲基修饰的rna碱基(sigma-aldrich、sg和idt、sg)。gapmer合成为单链dna碱基，每个碱基的侧面有由硫代磷酸酯主链链接的三个2'-o-甲基修饰的rna碱基(sigma-aldrich、sg和idt、sg)。使用staon转染细胞。细胞以每孔1.0-1.5×105个细胞接种于含有1ml转染培养基的6孔板中，并且孵育过夜。细胞达到约40％汇合并且培养基在转染之前减至900μl。在opti-mem培养基(invitrogensingaporepteltd，新加坡)中制备10×转染混合物至总体积为100μl，其中staon(以100pmol为单位)和脂质体2000(以μl为单位)在各种浓度下的固定比例为1:2，在室温下孵育20分钟，然后加入到细胞培养物中。细胞活力测定。使用溴化噻唑蓝四唑(mtt)测定或celltiter-blue细胞活力测定(promega，新加坡)在96孔板(每孔100μl培养基中含有3.5×103个细胞)中执行细胞活力和增殖的测量。使用staon和脂质体2000的混合物在96孔板中对细胞进行转染。对于mtt测定(用于贴壁细胞)，培养基替换为含有mtt(0.5mg/ml)的dmem培养基(100μl/孔)，在37℃下孵育4小时，然后更换为100μl异丙醇。使用酶标仪(分子设备，sunnyvale，ca，usa)在570nm波长处测量吸光度，其中，在630nm处进行背景减除，并且使用吸光度与活细胞数的校准曲线将吸光度转换为活细胞数。对于celltiter-blue细胞活力测定(对于悬浮细胞)，加入cell-titerblue试剂(11μl/孔)并且在37℃下孵育4小时。使用酶标仪测量荧光，其中，激发波长为570nm，而发射波长为600nm。图4示出了96孔staon筛选板模板。除实验对照外，每个孔均由诱导一个特异性剪接事件的一个或多个staon组成。依据要转换的剪接事件的数目以及筛选中所需的staon的数目，可以使用一个或多个96孔格式板、192孔格式板或384孔格式板。每个筛选板的设计描述如下：1.每个孔中都装满0.1ml的培养基中10皮摩尔的staon，以获得100nm的单次转染剂量。2.每个staon都是单靶向或双靶向。3.在给定板中，保留四个孔用于阴性对照，即，水、仅转染试剂、乱序staon#1、以及乱序staon#2。4.多于一个的不同的staon可以用于诱导特异性剪接转换。它们可以一起装在孔中，还可以装在单独孔中。5.对于多个剪接事件的组合转换，每个相应staon都串联或连续地填充在孔中。6.重复实验可以通过板或孔或两者执行。在使用staon孵育细胞后，所得细胞表型的特征在于在每个筛选方向观察到的一个或多个特定细胞标记物的幅度改变，并且当抑制靶基因表达时使用观察到的幅度改变进行标准化。依据所研究的所需细胞表型，执行相应细胞处理测定/方案。示例包括细胞活力、细胞增殖、细胞死亡、细胞周期、细胞迁移等，只要能够测量一个或多个特定细胞标志物即可。每个孔的读出将使用阴性对照的孔进行内部标准化，并且在两个方向的筛选结果之间进行比较。因为从双向筛选结果计算得出剪接事件的所得相关强度，所以在来回转换时以相反方式改变了细胞标志物的剪接事件的治疗价值高于仅影响单向改变的剪接事件的治疗价值。以下数学算法用于表征细胞的表型：ri,j,s：(对数或线性标度)使用staon将亚型i转换为亚型j时的标准化读出；标准化伴随当抑制目标基因表达时读出的幅度改变。δrij＝ri,j,s1-rj,i,s2；如果δrij≠0且sgn(ri,j,s1)≠sgn(rj,i,s2)，则亚型i和j对特定细胞表型的读数有相反效应；如果δrij≠0且sgn(ri,j,s1)＝sgn(rj,i,s2)，则亚型i和j对特定细胞表型的读数有不同效应；如果δrij＝0，则亚型i和j对特定细胞表型的读数没有或没有差异效应。这有助于对来自转换每个剪接变异体或事件的效应进行客观比较。如前所述，本发明的方法用于药物筛选方法。图5和图6是可以与本发明方法一起使用的经典药物靶标筛选和合成致死药物靶标筛选的基于表型的癌症药物靶标筛选的示意图。图中所示的这些板模板提供了本方法如何放大为使用表征算法进行筛选的高通量方法的示例。参考图5和图6，(1)鉴定具有治疗价值的亚型或剪接事件的经典药物靶标筛选。库a中的staon被设计为将在非转化的细胞中观察到的剪接事件转换为在相应癌细胞中观察到的剪接事件。库b中的staon被设计为将在癌细胞中观察到的剪接事件转换为在相应的非转化的细胞中观察到的剪接事件。(2)鉴定对特定药物表现出敏感性或增强反应的亚型或剪接事件的增强子药物靶标筛选。库a和b中对staon的敏感性与(1)中的相同。(3)鉴定具有治疗价值的亚型或剪接事件的合成致命药物靶标筛选。仅使用单个staon库a。staon被设计为将在非转化细胞和癌细胞中均观察到的剪接事件转换为其他内源性剪接事件或选择性剪接事件。(4)这与上述(1)相似。区别在于筛选的目的是要鉴定发挥至关重要的生物学作用的亚型或剪接事件，这些生物学作用将细胞状态1转化为细胞状态2，反之亦然。在以下示例中，示出了如何进行本发明的单向剪接转换筛选和双向剪接转换筛选。单向剪接转换筛选特异性剪接事件的调节后的不同的细胞表型执行无偏剪接事件转换筛选以研究对细胞活力的影响，其中经由空间位阻反义寡核苷酸(staon)诱导特异性事件。在a549、imr90和hela细胞上筛选了9个靶基因中发生的20个剪接事件。a549是用作nsclc(非小细胞肺癌)模型的腺癌人类肺泡基底上皮细胞，imr90是正常人胎儿肺成纤维细胞，而hela是宫颈癌细胞。对于每个剪接事件，其对细胞活力的效应与相应靶基因的敲低进行比较，这是通过经由staon诱导的无义介导的衰变(nmd)或经由gapmer诱导的rnaseh降解来实现。通过我们专有的staon设计平台总共设计了20个剪接事件转换staon、7个nmd诱导staon、以及2个gapmer，它们都是新颖分子。两个实验读出具有特定相关性，即，对细胞活力的方向性影响(即，抑制性或增殖性)以及细胞活力的改变幅度。图7描绘了来自剪接事件转换筛选的不同的a549细胞活力。细胞活力(垂直轴)通过用乱序对照staon、nc2处理时观察到的细胞活力进行标准化。当细胞活力(标准化)分别小于1、等于1、以及大于1时，该效应是抑制性的、无、以及增殖性的。图例：kd-敲低，es-外显子跳跃事件，ir-内含子保留事件。表a1总结了每个经调节的剪接事件的细节。结果和讨论总结如下：·apaf1：敲低(kd)和外显子跳跃(es)剪接事件导致幅度相似的细胞增殖。·birc5：两个es剪接事件中的每个es剪接事件对细胞活力的抑制效应实质上大于敲低的抑制效应。·bmf和casp10：在靶基因的不同es剪接事件中观察到对细胞活力的不同抑制效应。·bin1：这两个es剪接事件对细胞活力产生相反效应，即，es(1)具有增殖效应，而es(2)具有抑制效应。·mcl1：与敲低和es剪接事件产生的较大抑制效应相比较，ir(内含子保留)剪接事件并未显着影响细胞活力。·bag4，bclaf1和nr1h2：敲低和es剪接事件产生的抑制效应相似。为了进一步领会对a549细胞活力的不同效应，计算出来自casp10，bin1和mcl1的剪接事件转换的相对细胞活力(rcv)(图8)。在本发明中，rcv与上文所描述的“治疗价值”相同，其从对细胞活力的效应中推断出。具体地，rcv将剪接事件转换对细胞活力的幅度与敲低靶基因时的对应幅度进行比较，如此，它不能从剪接事件转换中识别出对细胞活力的效应的绝对方向性。rcv的生物学解释描述如下：·rcv>1。与靶基因的敲低相比较，来自剪接事件转换的对细胞活力的效应具有相对增殖性，并且相对增殖效应随rcv而增加。应当指出，在这种情况下，来自剪接事件转换和靶基因敲低的标准化的细胞活力效应不一定都具有增殖性。实际上，(剪接事件转换、靶基因敲低)标准化的细胞活力效应的可能组合是(具有增殖性，具有增殖性)、(具有增殖性，具有抑制性)、(具有抑制性，具有抑制性)，而非(具有抑制性，具有增殖性)。·rcv<1。与靶基因的敲低相比较，来自剪接事件转换的对细胞活力的效应具有相对抑制性，并且相对抑制效应随rcv降低而增加。应当指出，在这种情况下，来自剪接事件转换和靶基因敲低的标准化的细胞活力效应不必同时具有抑制性。实际上，(剪接事件转换，靶基因敲低)标准化的细胞活力效应的可能组合是(具有增殖性，具有增殖性)、(具有抑制性，具有增殖性)、(具有抑制性，具有抑制性)，而非(具有增殖性，具有抑制性)。·rcv＝1。剪接事件转换和靶基因敲低对细胞活力的效应没有差异。如图8所描绘的，不同类型的剪接事件(mcl1中的es和ir)和不同的外显子(bin1和casp10中)的跳跃均对相对细胞活力产生不同效应。另外，效应可能相反。bin1中的es(2)与es(1)，而casp10中的es(2)与其余。再次参考图8，通过使用敲低靶基因时的对应效应对其对活力的效应进行标准化，获得来自剪接事件转换的rcv，并且表a1总结了每个经调节的剪接事件的细节。接下来，筛选的子集应用于imr90细胞。图9(与图7相同的图例)描绘了来自剪接事件转换筛选的不同的imr90细胞活力。由于imr90细胞是非致瘤性的，所以感兴趣的是使用肿瘤a549细胞比较和鉴定筛查结果的差异，两者均起源于肺。显着差异总结如下。apaf1：与来自kd和es剪接事件的a549细胞相比较，imr90细胞的增殖性几乎是该a549细胞的两倍。birc5：两个es剪接事件中的每个es剪接事件均对imr90和a549细胞活力产生相似的抑制效应。然而，由于kd在imr90中具有增殖性，但在a549中具有抑制性，所以es(1)和es(2)对细胞活力的方向效应在imr90细胞中相反。casp10：在靶基因的不同es剪接事件中观察到对细胞活力的不同抑制效应。bin1：虽然在imr90和a549细胞中，es(1)，es(2)和kd对细胞活力的方向效应相同，但其幅度却不同。如此，es(1)和es(2)的rcv在两个细胞系中都存在很大差异。bclaf1、casp10、nr1h2：与a549类似。值得注意的是，来自特定剪接事件的转换的imr90细胞和a549细胞之间的活力差异可能有助于扩大治疗窗口，通过该治疗窗口，可以选择性地消除肿瘤细胞。因此，剪接转换筛选具有将剪接事件鉴定为药物发现和开发的治疗靶的能力和优势，这些治疗靶可以导致具有更高治疗指数的更有效的药物。同样，筛选的子集应用于hela细胞。图10(与图7相同的图例)描绘了来自剪接事件转换筛选的不同的hela细胞活力。与a549和imr90细胞相比，来自剪接事件转换对hela细胞活力的效应都具有抑制性。对于导致对hela和a549细胞活力均具有抑制效应的剪接事件，幅度相似。总之，与基因敲低相比较，我们观察到了不同细胞系、不同类型的剪接事件转换、es中的靶外显子、以及靶基因中的方向性以及对细胞活力的效应的幅度范围的广泛性。双向剪接转换筛选通过设计诱导特定剪接事件的staon和逆转该剪接事件转换的另一staon来实现双向剪接事件转换筛选。在第一示例中，我们转换了在a549细胞中使用bclaf1外显子5的选择性5'剪接位点(表1a)。图11a和图11b描绘了bclaf1敲低(kd)，转换至使用近端5'剪接位点以表达短外显子5(a5ss(l->s))，转换至使用远端5'剪接位点以表达长外显子5(a5ss(s->l))后对a549细胞活力的效应。各个rcv表明，来自a5ss(s->l)转换的相对细胞活力与a5ss(l->s)转换相反，即，在前者中具有增殖性，而在后者中逆转时具有抑制性。在双向筛选的第二示例中，我们转换了在a549、imr90和hela细胞中使用bmf外显子5的选择性3'剪接位点(表1a)。图12描绘了bmf敲低(kd)，转换至使用近端3'剪接位点以表达长外显子5(a3ss(s->l))，转换至使用远端3'剪接位点以表达短外显子5(a3ss(l->s))后对细胞活力的效应。虽然对活力的效应在每个细胞系中都具有抑制性，但rcv显示出有趣的发现。在a549细胞中，来自a3ss(l->s)转换的相对细胞活力与来自a3ss(s->l)转换的相对细胞活力相反，即，在前者中具有抑制性，而在后者中逆转时具有增殖性。然而，尽管在imr90细胞中也观察到了这种相反效应，但是抑制到增殖效应被互换(代替增殖到抑制)。假设a549和imr90细胞均起源于肺，其中，前者是肿瘤细胞，而后者是非致瘤性的，那么从双向剪接事件转换中观察到的互换效应表明bmf外显子5从长版到短版的表达转换可能具有治疗价值。因此，双向筛选具有提供关于所鉴定的药物靶标的机理信息的高度价值优势。作为第三示例，我们诱导了lncap前列腺癌细胞系中znf548外显子3、prkab2外显子8、kat6a外显子2、eed外显子10、znf304外显子2和krbox4外显子6的包含和排除(表1a)。图13示出了znf548外显子3和prkab2外显子8对细胞活力的效应。对于筛选的其余部分，未观察到表型改变。在这两个基因中，相应外显子的包含会导致细胞活力丧失，而当诱导逆转(外显子排除)时，细胞活力得以维持。讨论所描述的本发明的方法调节基因的特异性剪接，以筛选出从基因表达的亚型或剪接变异体。因此，还可以说，比“靶基因”更精确的术语是“靶基因亚型”或“靶基因剪接变异体”。用于亚型和选择性剪接事件的单向高通量功能筛选是新颖且非显而易见的。筛选平行化的最有价值的益处是除了大大提高生产率之外还可以通过样品(亚型或剪接事件)对所需细胞生理学或生物学现象的效应进行比较，从而对样品进行整理或分类，这些样品在相同的实验条件下进行观察/测量，其中，系统误差相似。因为统计测量(例如，p值、fdr等)对于识别样品之间的差异而言必不可少且非常重要，这些差异是真实的且并非偶然的，所以在筛选上至少需要10个独立样品。另一条件是使用来自靶基因表达抑制的读出对来自剪接事件转换的生物学读出进行的标准化。又一条件是使用来自靶基因表达抑制的读出对来自剪接事件转换的生物学读出进行的标准化。应当指出，本发明由于以下原因而具有创造性：a.调节单个选择性剪接事件或亚型不应视为筛选。b.将单个样品实验扩展到10个或更多各样品以符合筛选实验的要求并不容易。c.每个样品的同时调节，其中，由一个或多个靶基因编码的一个以上亚型和/或选择性剪接事件由样品中的多个空间位阻反义寡核苷酸同时调节，以筛选出协同效应。本发明还提供了一种双向剪接转换筛选平台，其是发现新型种类的药物靶标的新范例，这些新型药物靶标无法使用既定筛选平台进行开发；后者筛选出约20,000个人类基因，而非约100,000个人类剪接事件或变异体。双向靶发现方法降低了传统单向敲低筛选固有的假阳性。双向筛选不仅仅是两个单向筛选。与单向筛选相比，双向筛选的能力和价值是能够将亚型和/或选择性剪接事件鉴定为具有机理基础的候选药物靶标，这是fda对新药的要求，并且治疗窗口广泛。为了实现这些优点，双向筛选的设计如下：1.最简单的双向筛选(例如，仅在两个细胞状态(例如，健康状态和患病状态)下应用)需要四个筛选。(筛选数＝2*细胞状态数)a.细胞状态1下的剪接转换筛选。b.细胞状态1下的敲低/敲除筛选。c.细胞状态2下的剪接转换筛选d.细胞状态2下的敲低/敲除筛选。2.水平分析：对应双向样品对的治疗价值是对细胞生理学现象或生物学现象的净效应，为了简单起见，该效应线性定义为(1a-1b)-(1c-1d)，对其进行统计分析；它可以非线性地用公式表示。3.垂直分析：在水平分析之后，对双向样品对的治疗价值进行比较，从而对其进行整理或分类。4.水平和垂直比较都会随着所研究的细胞状态数目迅速变得复杂。在通常的药物靶标筛选或发现项目中，一般会筛选10种以上的细胞状态。该方法还解决了用于靶发现、药物发现和开发的既定平台中的关键限制，并且可以用于以下应用：1.药物靶标发现。差异剪接事件的治疗价值的双向表征。2.药物增强子靶标发现。治疗协同效应的双向表征和差异剪接事件的索引。本文中，每个孔中的细胞使用staon和药物进行孵育。另外四个阴性对照孔用于仅药物、仅药物+转染试剂、药物+乱序staon#1、以及药物+乱序staon#2。3.合成致死药物靶标发现。非差异剪接事件的合成致死效应的双向表征。本文中，staon用于将均在两种细胞状态下观察到的亚型转换为一种或多种其选择性亚型。4.功能基因组研究。差异剪接事件的生物学功能的双向表征。现有候选药物筛选方法(例如，靶发现筛选平台中采用的敲低方法)无法区分从基因表达的选择性/异常剪接的线性/环状亚型；如此，所有亚型同时被敲低。因此，没有并且不能使用传统平台筛选亚型作为药物靶标。鉴于剪接调节在正常生理中发挥至关重要的作用，而选择性和/或异常剪接事件在人类疾病中很普遍，所以这是个很大的限制。此外，四大类治疗剂(化学抑制剂、单克隆抗体、gapmer、以及肽)通常仅适用于靶抑制。这严重限制了治疗策略和方法的范围。本发明针对广泛治疗指数。剪接转换staon的机理作用是将其靶的表达从疾病形式转换为正常形式，协同实现了两种治疗效应，即，敲低患病形式和恢复正常形式的表达。与传统治疗抑制剂相比，该治疗策略可以产生协同治疗结果和/或具有广泛的治疗指数。除上述以外，本发明还描述了反义用作改变基因亚型和选择性剪接事件的表达的试剂，目的是表征其治疗价值和/或生物学功能。应当设想，发现新型靶将赋予下一代治疗策略和方法以力量，并且使之成为可能。因此，系统化的合理方法显着减少了靶发现和药物开发的时间和资源，从而降低了投资风险。尽管在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节做出许多变化或修改。当前第1页12