细胞的制作方法

发明领域本发明涉及表达嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的工程化细胞；特别是涉及控制此类细胞的增殖和存活的方法。发明背景可以通过选择性扩增天然对靶抗原具有特异性的外周血t细胞生成抗原特异性t细胞。但是，对大多数癌症抗原，选择和扩增具有特异性的大量t细胞非常困难，且常常是不可能的。使用整合载体的基因疗法为该问题提供了解决方案，因为嵌合抗原受体(car)的转基因表达允许通过大量外周血t细胞的离体病毒载体转导而生成对任何表面抗原具有特异性的大量t细胞。tnf家族共刺激分子为t细胞在其个体发生期间提供存活和扩增信号。这些tnf受体(tnfr)经由tnf受体相关因子(traf)第二信使进行信号传导。然而，这些共刺激信号的情况是关键且截然不同的：为了使t细胞接收此类信号，受体和配体两者必须在同一时间，同一地点表达。例如，对于接收cd27信号的t细胞，它必须表达cd27受体，而同源配体cd70必须由t细胞本身或与其接触的其他细胞表达。这是非常严格控制的：例如，只有在存在抗原的情况下，4-1bb/4-1bbl和ox40/ox40l两者才在cd8+和cd4+t细胞/抗原呈递细胞上激活后的短时间内表达。例如，这种编排是针对病毒感染的生理免疫应答的关键。然而，cart细胞应答通常不涉及一系列辅助免疫细胞，而是cart细胞必须在具有极少免疫学信号的不利微环境的情况中存活。cart细胞的功效取决于cart细胞的增殖和植入。因此，仍然需要改善工程化细胞在可能不提供适当的免疫学信号的微环境中增殖、存活和/或移植的功效的方法。发明概述在本发明的第一方面提供了细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)嵌合tnf受体(tnfr)，其包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr信号传导结构域。本发明提供的嵌合tnfr的使用使得tnfr信号传导的严格的时间和/或空间控制能够解偶联，从而为工程化细胞例如cart细胞提供改善的存活信号。因此，本发明的嵌合tnfr可以补偿肿瘤微环境中完整生理免疫应答的缺乏。举例来说，可以构建嵌合tnfr，使得在要求工程化细胞活性的预期的微环境中抗原结合结构域得以衔接，并因此诱导所需的共刺激信号。嵌合tnfr的抗原结合结构域可以包含tnfr的配体结合结构域。例如，抗原结合结构域可以包含d3r、hvem、cd27、cd40、rank或fn14的配体结合结构域。嵌合tnfr的信号传导结构域可以是激活信号传导结构域。例如，信号传导结构域可以能够经由tnfr相关因子(traf)进行信号传导。例如，激活信号传导结构域可以包含4-1bb、ox40或gitr胞内域的信号传导部分。激活信号传导结构域可以包含4-1bb胞内域的信号传导部分。信号传导结构域可以不能在细胞中产生信号1。例如，信号传导结构域可以不包含cd3胞内域。信号传导结构域可以不包含cd3zeta胞内域。在一个实施方案中，嵌合tnfr选自d3r-4-1bb(seqidno:1)、hvem-4-1bb(seqidno:2)、cd27-4-1bb(seqidno:3)、rank-4-1bb(seqidno:4)、fn14-4-1bb(seqidno:5)和cd27-d3r(seqidno:6)，或与seqidno:1-6的任一项具有至少80％序列一致性的变体。在进一步的方面，本发明包括细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。外源多核苷酸可以表达cd27、cd40、d3r、hvem、rank或fn14。外源多核苷酸可以表达cd27或cd40。细胞可以是alpha-betat细胞、nk细胞、gamma-deltat细胞或细胞因子的诱导杀伤细胞。在另一方面，本发明提供了嵌合tnf受体(tnfr)，其包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)不能产生信号1的tnfr信号传导结构域。信号传导结构域可以不包含cd3胞内域。信号传导结构域可以不包含cd3zeta胞内域。嵌合tnfr的抗原结合结构域可以不能结合cd70。在进一步的方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其编码嵌合tnf受体(tnfr)，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr信号传导结构域。第二核酸序列可以编码如本发明提供的任何嵌合tnfr。第一和第二核酸序列可以由共表达位点分开。本发明进一步提供了核酸序列，其编码根据本发明的嵌合tnf受体(tnfr)。在另一方面，本发明提供了核酸序列的试剂盒，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其编码嵌合tnf受体(tnfr)，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr信号传导结构域。嵌合tnfr可以是如本发明提供的任何嵌合tnfr。本发明还提供了载体，其包含根据本发明的核酸构建体。在另一方面，本发明提供了载体的试剂盒，其包含：(i)第一载体，其包含编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)的核酸序列；和(ii)第二载体，其包含编码嵌合tnf受体(tnfr)的核酸序列，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)如本发明所定义的tnfr信号传导结构域。在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明的细胞，核酸构建体，第一核酸序列和第二核酸序列；载体或第一和第二载体。在进一步的方面，本发明提供了根据本发明的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。在另一方面，本发明涉及治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明的药物组合物施用于有此需要的受试者的步骤。方法可以包括以下步骤：(i)分离含有细胞的样品；(ii)用根据本发明的核酸构建体，载体或第一和第二载体对细胞进行转导或转染；和(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。细胞可以是自体的。细胞可以是同种异体的。在另一方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。疾病可以是癌症。在另一方面，本发明涉及用于制备根据本发明的细胞的方法，其包括将以下引入到细胞中的步骤：本发明的核酸构建体，第一核酸序列和第二核酸序列，载体或第一和第二载体。细胞可以来自从受试者分离的样品。附图简要说明图1-a)阐明经典car的示意图。(b)至(d)：car胞内域的不同代和排列：(b)最初的设计通过fcεr1-γ或cd3ζ胞内域传输单独的itam信号，而后来的设计则在同一个复合胞内域中传输另外的(c)一个或(d)两个共刺激信号。图2-阐明tnfr的示意图。图3-tnf超家族的概述。图4-在存在或不存在呈递配体light的细胞，以及存在表达靶抗原或不表达靶抗原的细胞的情况下，比较有和没有hvem-4-1bb嵌合tnf受体共表达的表达gd2car的细胞的活性：a)增殖；b)针对靶细胞的细胞毒性。图5-在存在或不存在呈递配体rankl的细胞，以及存在表达靶抗原或不表达靶抗原的细胞的情况下，比较有和没有rank-4-1bb嵌合tnf受体共表达的表达gd2car的细胞的活性：a)增殖；b)针对靶细胞的细胞毒性。发明详述嵌合tnf受体(tnfr)在第一方面，本发明提供了细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)嵌合tnf受体(tnfr)，其包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr信号传导结构域。如本文所用，嵌合tnfr是指包含(a)能够结合第一tnfr的tnfr配体的结合结构域；和(b)第二tnfr的tnfr信号传导结构域的tnfr。因此，在通常与第一tnfr结合的tnfr配体的衔接之后，本发明的嵌合tnfr能够传输通常由第二tnfr提供的共刺激信号。这使得tnfr信号传导的严格的时间和/或空间控制能够解偶联，从而为工程化细胞例如cart细胞提供改善的存活信号。举例来说，本发明的嵌合tnfr可以包含能够与tnfr配体如cd70、ranl或tweak结合的结合结构域和不同tnfr如41-bb或ox40的激活信号传导结构域。通过将肿瘤微环境中丰富的tnfr配体的识别与通常仅以严格调节的方式提供的第二tnfr的共刺激信号偶联，此类嵌合tnfr可以用于靶向某些癌症。例如，只有存在抗原的情况下，4-1bb/4-1bbl和ox40/ox40l两者才在cd8+和cd4+t细胞/抗原呈递细胞上激活后的短时间内表达。举例来说，在淋巴瘤中cd70丰富，因此可以表达cd27-4-1bb嵌合体；在溶骨性转移中rankl丰富，因此可以表达rank-4-1bb。在实体癌中，tweak丰富，因此可以表达fn14-4-1bb。不希望受理论的束缚，与没有嵌合tnfr的相应的工程化细胞相比，表达响应于存在于肿瘤微环境中的配体的存在而传输存活和/或增殖信号的嵌合tnfr的工程化细胞将具有改善的植入和扩增。tnf受体tnf受体超家族(tnfrsf)的成员通常是i型跨膜糖蛋白(细胞外部的n端)。tnf超家族的细胞质结构域中的结构基序基于其信号传导特性将其分为两组：含有死亡结构域(dd)的成员和其他衔接tnfr相关因子(traf)的成员。存在第三组，其缺乏膜锚定结构域，并从表面经蛋白水解切割，或经由糖脂连接锚定，并被称为“诱饵受体”。tnfr包含当tnfr在细胞中表达时位于细胞膜胞外侧的结合结构域和当tnfr在细胞中表达时在细胞膜细胞质侧表达的信号传导结构域。tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)和tnfrsf14(gitr)将存活信号传输到t细胞。tnfrsf7(cd27)和tnfrsf14(hvem)由初始t细胞表达。ox40和4-1bb的表达响应于抗原刺激得以诱导，这些tnfr已经提出是效应t细胞的标志物。尽管cd27和gitr可以由常规t细胞组成性表达，但它们的表达在t细胞活化后也强烈上调，可能与ox40和4-1bb表达的上调同时发生。ox40、4-1bb和gitr表达的诱导或上调发生在初始t细胞识别抗原并活化后的24小时内，而记忆t细胞则快得多；这些受体的表达可以持续数小时或甚至数天。tnf受体tnfrsf35/死亡受体3(d3r)由通过发炎的组织瞬时上调的tl1a激活，并且这种相互作用对于已建立的免疫应答后的t细胞活性的后期阶段似乎很重要。cd40不由t细胞表达，但cd40l由t细胞表达，且cd40/cd40l对于b细胞的分化和扩增尤其重要。tnfrsf11a(rank)不由t细胞表达，但rank/rank-l途径对于免疫发育很重要，以及是破骨细胞活性的关键途径，且在骨转移期间有活性。tnfrsf12a(fn14)不由t细胞表达，而是与它的配体tweak一起表达于受损或发炎的组织以及大多数癌症中。tnf家族配体tnf相关细胞因子(tnf家族配体)是ii型跨膜蛋白(细胞内n端)，其具有短的细胞质尾(长度为15至25个残基)和较大的细胞外区域(～50个氨基酸)，该胞外区含有受体结合位点所位于的签名tnf同源性结构域的。tnf同源性结构域组装成三聚体，即配体的功能性单元。对家族几个成员的原子分析表明，配体具有高度保守的折叠成β片状三明治的三级结构，但在家族成员中，氨基酸序列保守性限制为<35％。定义该超家族的保守残基主要位于形成分子支架的内部β链内，其促进组装成三聚体。外部β链之间的环中的残基是可变的，并且在特定的环中与受体接触。表2中提供了tnfr及其配体的概述。表2tnfr结合结构域嵌合tnfr结合结构域可以是能够结合tnfr配体的任何结构域。结合结构域可以例如包含tnfr的配体结合结构域或能够结合tnfr配体的抗体或其部分。结合结构域可以能够结合如表2中所列的tnfr配体。结合结构域可以能够结合在肿瘤微环境中存在的tnfr配体。结合结构域可以能够结合选自以下的tnfr配体：cd70、nfκb的受体激活物(rankl)、tnf相关弱凋亡诱导物(tweak)、tnfsf14(light)、tnfsf1(lta)、btla(cd272)、cd160、ox40l、4-1bbl、cd30l、gitrl、tl1a和cd40l。结合结构域可以能够结合cd70。结合结构域可以能够结合rankl。结合结构域可以能够结合tweak。结合结构域可以能够结合light、lta、btla和/或cd160。合适地，结合结构域可以包含与tnfr配体结合的tnfr的配体结合结构域。表2和图3中提供了tnfr/tnfr配体相互作用的概述。结合结构域可以包含选自以下的配体结合结构域：cd27、rankl、fn14、hvem、ox40、4-1bb、cd30、dr3、gitr或cd40配体结合结构域。结合结构域可以包含cd27的配体结合结构域。在早期t细胞分化期间，cd27表达受到严格控制。cd70作为cd27的配体，在活化的t细胞、b细胞和巨噬细胞上广泛表达。cd70还在恶性细胞上表达，如b细胞淋巴瘤、白血病和胶质瘤以及几种其它的肿瘤。说明性cd27的配体结合结构域显示为seqidno:7。合适地，cd27的配体结合结构域可以包含seqidno:7或其具有结合cd70的能力的变体。seqidno:7变体可以与seqidno:7具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与如seqidno:7所示序列等同或改善的cd70结合能力。seqidno:7结合结构域可以包含rank的配体结合结构域。rank系统在免疫系统中起重要作用，包括在淋巴结发育、淋巴细胞分化、树突细胞存活和t细胞活化以及耐受性诱导中。rankl在若干组织和器官中表达，包括：骨骼肌、胸腺、肝、结肠、小肠、肾上腺、成骨细胞、乳腺上皮细胞、前列腺和胰腺。rankl/rank系统的关键作用是介导破骨细胞依赖性骨重构，并因此介导骨转移性疾病的病理过程，并且在所有溶骨性骨肿瘤(包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌转移至骨和原发性骨髓疾病即骨髓瘤)中均有活性。rank通常不在例如t细胞上表达。例如，rank配体结合结构域在cart细胞上的表达可以导致广泛的激活，特别是在骨髓转移的情况下。说明性rank的配体结合结构域显示为seqidno:8。合适地，rank的配体结合结构域可以包含seqidno:8或其具有结合rankl的能力的变体。seqidno:8变体可以与seqidno:8具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与如seqidno:8所示序列等同或改善的rankl结合能力。seqidno:8结合结构域可以包含fn14的配体结合结构域。fn14可以在除淋巴细胞以外的几乎所有组织上诱导性表达。fn14的配体是在组织损伤时在组织中上调的tweak。tweak由活化的单核细胞产生。tweak也几乎在肿瘤微环境中普遍表达。考虑到t细胞不表达fn14，它们无法在微环境中解读tweak。能够结合tweak的嵌合tnfr将激活和存活信号传输至例如肿瘤微环境内的cart细胞。说明性fn14的配体结合结构域显示为seqidno:9。合适地，fn14的配体结合结构域可以包含seqidno:9或其具有结合tweak的能力的变体。seqidno:9变体可以与seqidno:9具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与如seqidno:9所示序列等同或改善的tweak结合能力。seqidno:9结合结构域可以包含hvem的配体结合结构域。尽管大多数tnf受体具有单个或至多两个配体，但hvem的独特之处在于它具有多个配体。这些包括light、lta、btla和cd160。这些配体由广泛的免疫细胞表达。hvem通常在初始和静息t细胞上表达，但不由活化的t细胞表达。包含hvem配体结合结构域的嵌合tnfr的表达允许cart细胞例如在其活化期间接收多个配体信号。说明性hvem的配体结合结构域显示为seqidno:10。合适地，hvem的配体结合结构域可以包含seqidno:10或其具有结合light、lta、btla和/或cd160的能力的变体。seqidno:10变体可以与seqidno:10具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与如seqidno:10所示序列等同或改善的light、lta、btla和cd160结合能力。seqidno:10结合结构域可以包含dr3的配体结合结构域。dr3共刺激t细胞活化，并通过细胞质内死亡结构域和衔接物蛋白tradd(tnfr相关死亡结构域)进行信号传导。tl1a共刺激t细胞产生多种细胞因子，并可以在体内促进活化和调节性t细胞的扩增。在自身免疫性疾病模型中，dr3还可以增强组织炎症部位处的效应t细胞增殖。包含dr3配体结合结构域的嵌合tnfr允许激活和存活信号在例如发炎的肿瘤微环境内的cart细胞中传输。说明性dr3的配体结合结构域显示为seqidno:11。合适地，dr3的配体结合结构域可以包含seqidno:11或其具有结合tl1a的能力的变体。seqidno:11变体可以与seqidno:11具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与如seqidno:11所示序列等同或改善的tl1a结合能力。seqidno:11如本文所用，“抗体”意指具有包含至少一个互补决定区(cdr)的抗原结合位点的多肽。抗体可以包含3个cdr并且具有与结构域抗体(dab)的抗原结合位点等同的抗原结合位点。抗体可以包含6个cdr并且具有与经典抗体分子的抗原结合位点等同的抗原结合位点。多肽的其余部分可以是任何序列，其为抗原结合位点提供合适的支架并以适当的方式展示它以使其结合抗原。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其部分，如fab、f(ab)’2、fv、单链fv(scfv)片段、纳米抗体或单链可变结构域(其可以是vh或vl链，具有3个cdr)。抗体可以是双功能抗体。抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的或完全人的。嵌合tnfr结合结构域可以包含不衍生自或不基于免疫球蛋白的结合结构域。已经开发了许多“抗体模拟物”设计的重复蛋白(drp)，以利用非抗体多肽的结合能力。此类分子包括锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白，例如darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)、anticalin、avimer和versabody。结合结构域可以“特异性结合”如本文定义的tnfr配体。如本文所用，“特异性结合”意指结合结构域与tnfr配体结合但不与其他肽结合，或以较低的亲和力与其他肽结合。两个分子(例如，tnfr结合结构域和tnfr配体)之间的结合亲和力可以例如通过确定解离常数(kd)来定量。可以例如通过表面等离子体共振(spr)方法(biacoretm)来测量在tnfr结合结构域和tnfr配体之间的复合物形成和解离的动力学来确定kd。对应于复合物的缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。kd通过等式kd＝kd/ka与ka和kd相关。与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同tnfr结合结构域和tnfr配体的结合亲和力可以通过比较各个tnfr结合结构域和tnfr配体的kd值来进行比较。tnfr信号传导结构域本嵌合tnfr进一步包含tnfr信号传导结构域。合适地，tnfr信号传导结构域可以是激活信号传导结构域。激活信号传导结构域可以能够经由tnfr相关因子(traf)进行信号传导。traf是将tnfr与信号传导途径偶联的衔接物蛋白。已经鉴定了traf家族的6个成员(traf1-6)。所有traf蛋白共享一个能够与受体的细胞质结构域以及其他traf蛋白结合的称为traf结构域的c端同源区域。此外，traf2-6具有ring和锌指基序，这对于信号传导下游事件是重要的。信号传导结构域可以包含基于来自如表2中所列的tnfr的信号传导结构域的结构域。信号传导结构域可以包含基于来自选自以下的tnfr的信号传导结构域的结构域：4-1bb、ox40、gitr、cd27、cd40、d3r、hvem、rank和fn14。信号传导结构域可以包含基于来自选自以下的tnfr的信号传导结构域的结构域：4-1bb、ox40、gitr、cd27、cd40和d3r。信号传导结构域可以基于4-1bb的信号传导结构域。4-1bb是一种共刺激免疫检查点分子，其为活化的t细胞提供共刺激活性。4-1bb信号传导增强t细胞增殖、il-2分泌、存活和细胞溶解活性。已显示4-1bb经由traf2进行信号传导。说明性4-1bb信号传导结构域显示为seqidno:12。合适地，4-1bb信号传导结构域可以包含seqidno:12或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力。seqidno:12变体可以与seqidno:12具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:12等同的信号传导特性。seqidno:12信号传导结构域可以基于ox40的信号传导结构域。ox40不在静息的初始t细胞上组成性表达，而是在激活后24至72小时后表达。例如，t细胞中的ox40信号传导对于激活后的t细胞存活和维持细胞因子的产生很重要。ox40信号传导结构域结合traf2、3和5以及pi3激酶。说明性ox40信号传导结构域显示为seqidno:13。合适地，ox40信号传导结构域可以包含seqidno:13或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供ox40共刺激信号的能力。seqidno:13变体可以与seqidno:13具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:13等同的信号传导特性。seqidno:13信号传导结构域可以基于gitr的信号传导结构域。gitr表达在t细胞活化后增加，并参与cd3驱动的t细胞活化和程序性细胞死亡的调节。特别地，它参与抑制t调节细胞的抑制性活性并延长t效应细胞的存活。说明性gitr信号传导结构域显示为seqidno:14。合适地，gitr信号传导结构域可以包含seqidno:14或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供gitr共刺激信号的能力。seqidno:14变体可以与seqidno:14具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:14等同的信号传导特性。seqidno:14信号传导结构域可以基于cd27的信号传导结构域。cd27是生成和长期维持t细胞免疫所必需的。它与配体cd70结合，在调节b细胞活化和免疫球蛋白合成中起关键作用。该受体转导导致nf-κb和mapk8/jnk激活的信号。已显示衔接物蛋白traf2和traf5介导该受体的信号传导过程。说明性cd27信号传导结构域显示为seqidno:15。合适地，cd27信号传导结构域可以包含seqidno:15或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供cd27共刺激信号的能力。seqidno:15变体可以与seqidno:15具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:15等同的信号传导特性。seqidno:15信号传导结构域可以基于cd40的信号传导结构域。cd40是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，且是其活化所必需的。th细胞上cd154(cd40l)与cd40的结合活化抗原呈递细胞并诱导多种下游效应。cd40信号传导结构域与traf1、traf2和traf6相互作用。说明性cd40信号传导结构域显示为seqidno:16。合适地，cd40信号传导结构域可以包含seqidno:16或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供cd40共刺激信号的能力。seqidno:16变体可以与seqidno:16具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:16等同的信号传导特性。seqidno:16信号传导结构域可以基于d3r的信号传导结构域。说明性d3r信号传导结构域显示为seqidno:17。合适地，d3r信号传导结构域可以包含seqidno:17或其变体，所述变体具有在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供d3r共刺激信号的能力。seqidno:17变体可以与seqidno:17具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:17等同的信号传导特性。seqidno:17可以用于确定如本文所述的变体信号传导结构域能够以与亲本序列相同的方式进行信号传导的测定法包括表征生产性t细胞功能的标准免疫学测定法。这些包括，例如，分化、耗竭和激活的流式细胞术分析；细胞毒性测定法；增殖测定法；释放的细胞因子和转录谱的测量(rnaseq)。合适地，例如当在t细胞中表达时，本嵌合tnfr的信号传导结构域不能提供“信号1”。因此，嵌合tnfr能够结合tnfr配体，但是嵌合tnfr的衔接不在细胞中导致生产性信号1信号传导。换句话说，嵌合tnfr的衔接能够向细胞提供共刺激信号传导，但是不足以诱导工程化细胞的完全活化(因为它不提供信号1)。因此，在本发明的细胞中，在car或转基因tcr衔接时提供信号1，而在嵌合tnfr衔接时提供其他共刺激信号。嵌合tnfr的信号传导结构域可以基本上由如本文所述的tnfr信号传导结构域组成或由其组成。合适地，嵌合tnfr不包含cd3胞内域。合适地，嵌合tnfr不包含cd3zeta胞内域(说明性cd3zeta胞内域显示为seqidno:31)。跨膜结构域嵌合tnfr进一步包含跨越膜的跨膜结构域。跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域可以用于提供跨膜部分。蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领域技术人员使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)确定。此外，考虑到蛋白质的跨膜结构域是相对简单的结构，即预测形成足够长的疏水性alpha螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工设计的tm结构域(us7052906b1描述了跨膜组分)。跨膜结构域可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以衍生自cd28，其提供良好的受体稳定性。跨膜结构域可以包含如seqidno:18所示的序列或其具有至少80％序列一致性的变体。seqidno:18变体可以与seqidno:18具有至少80、85、90、95、98或99％的序列一致性，条件是该变体序列保留横穿膜的能力。跨膜结构域可以基于来自tnfr，例如如本文所述的tnfr的跨膜结构域。合适地，跨膜结构域可以基于与嵌合tnfr中存在的信号传导结构域相同的tnfr。合适地，跨膜结构域可以包含seqidno:19-24的任一项或其具有至少80％序列一致性的变体。变体可以与seqidno:19-24具有至少80、85、90、95、98或99％的序列一致性，条件是该变体序列保留横穿膜的能力。seqidno:19(4-1bb跨膜结构域)seqidno:20(dr3跨膜结构域)seqidno:21(ox40跨膜结构域)seqidno:22(gitr跨膜结构域)seqidno:23(cd70跨膜结构域)seqidno:24(cd40跨膜结构域)结合第一tnfr的tnfr配体的结合结构域和来自第二tnfr的信号传导结构域的任何组合对于本发明都可以是适当的。不希望受到理论的束缚，例如，以下组合可以认为对工程化t细胞的功能具有特别的益处。例如，与hvem、cd27、rank和fn14的配体的非生理相互作用与生理tnf配体相互作用相当不同。关于信号传导结构域，已知4-1bb为t细胞功能提供特别重要的共刺激信号。本嵌合tnfr可以包含与hvem、cd27、rank、dr3或fn14的配体结合的结合结构域和4-1bb信号传导结构域。嵌合tnfr可以包含hvem结合结构域和4-1bb信号传导结构域。说明性hvem/4-1bb嵌合tnfr显示为seqidno:2。合适地，hvem/4-1bb嵌合tnfr可以包含seqidno:2或其具有结合hvem配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力的变体。seqidno:2变体可以与seqidno:2具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:2等同的信号传导特性。seqidno:2hvem胞外域为普通文本(uniprot；q92956)4-1bb跨膜结构域为粗体(uniprot；q07011)4-1bb胞内域为斜体(uniprot；q07011)嵌合tnfr可以包含cd27结合结构域和4-1bb信号传导结构域。说明性hvem/4-1bb嵌合tnfr显示为seqidno:3。合适地，cd27/4-1bb嵌合tnfr可以包含seqidno:3或其具有结合cd27配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力的变体。seqidno:3变体可以与seqidno:3具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:3等同的信号传导特性。seqidno:3cd27胞外域为普通文本(uniprot；p26842)4-1bb跨膜结构域为粗体(uniprot；q07011)4-1bb胞内域为斜体(uniprot；q07011)嵌合tnfr可以包含rank结合结构域和4-1bb信号传导结构域。说明性rank/4-1bb嵌合tnfr显示为seqidno:4。合适地，rank/4-1bb嵌合tnfr可以包含seqidno:4或其具有结合rank配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力的变体。seqidno:4变体可以与seqidno:4具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:4等同的信号传导特性。seqidno:4rank胞外域为普通文本(uniprot；q9y6q6)4-1bb跨膜结构域为粗体(uniprot；q07011)4-1bb胞内域为斜体(uniprot；q07011)嵌合tnfr可以包含fn14结合结构域和4-1bb信号传导结构域。说明性fn14/4-1bb嵌合tnfr显示为seqidno:5。合适地，fn14/4-1bb嵌合tnfr可以包含seqidno:5或其具有结合fn14配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力的变体。seqidno:5变体可以与seqidno:5具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:5等同的信号传导特性。seqidno:5fn14胞外域为普通文本(uniprot；q9np84)4-1bb跨膜结构域为粗体(uniprot；q07011)4-1bb胞内域为斜体(uniprot；q07011)嵌合tnfr可以包含d3r结合结构域和4-1bb信号传导结构域。说明性d3r/4-1bb嵌合tnfr显示为seqidno:1。合适地，d3r/4-1bb嵌合tnfr可以包含seqidno:1或其具有结合d3r配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供4-1bb共刺激信号的能力的变体。seqidno:1变体可以与seqidno:1具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:1等同的信号传导特性。seqidno:1tnfrsf25(d3r)胞外域为普通文本(uniprot；q93038)4-1bb跨膜结构域为粗体(uniprot；q07011)4-1bb胞内域为斜体(uniprot；q07011)嵌合tnfr可以包含cd27结合结构域和dr3信号传导结构域。说明性cd27/dr3嵌合tnfr显示为seqidno:6。合适地，cd27/dr3嵌合tnfr可以包含seqidno:6或其具有结合cd27配体并在嵌合tnfr结合结构域的衔接后提供dr3共刺激信号的能力的变体。seqidno:6变体可以与seqidno:6具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且具有与seqidno:6等同的信号传导特性。seqidno:6cd27胞外域为普通文本(uniprot；p26842)tnfrsf25(d3r)跨膜结构域为粗体文本(uniprot；q93038)tnfrsf25(d3r)胞内域为斜体文本(uniprot；q93038)在一方面，本发明提供了如本文定义的嵌合tnfr。合适地，本发明的细胞可以包含如本发明提供的多种不同的嵌合tnfr。例如，细胞可以包含两种、三种、四种或五种本发明的不同的嵌合tnfr。“不同的tnfr”意指与第二tnfr相比，第一嵌合tnfr可以包含不同的配体结合结构域和/或不同的信号传导结构域。tnfr过表达在一方面，本发明提供了细胞，其包含：(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。如本文所用，术语“外源多核苷酸”意指表达tnfr的多核苷酸不是细胞的内源基因组的一部分。例如，外源多核苷酸可以是工程化核酸构建体或载体。外源多核苷酸可以表达cd27、cd40、d3r、hvem、rank或fn14。在一个实施方案中，外源多核苷酸可以表达cd27或cd40。细胞可以是如本文定义的任何细胞。合适地，细胞可以是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。cd27、cd40、d3r、hvem、rank和fn14的配体通常存在于炎性肿瘤微环境中。但是，这些tnfr要么例如由t细胞以严格调节的方式表达(例如在t细胞发育的特定时期期间)，要么通常不由t细胞表达。因此，例如，cd27、cd40、d3r、hvem、rank或fn14在t细胞中的外源表达可以提供与本发明的嵌合tnfr相似的优点。例如，在通常与tnfr结合的tnfr配体的衔接之后，从外源多核苷酸表达的tnfr能够传输共刺激信号。这使得tnfr信号传导的严格的时间和/或空间控制能够解偶联，从而为工程化细胞例如cart细胞提供改善的存活信号。举例来说，在淋巴瘤中cd70丰富，因此可以提供过表达cd27的细胞。在溶骨性转移中rankl丰富，因此可以提供过表达rank的细胞。在实体癌中，tweak丰富，因此可以提供过表达的细胞。如本文所用，“过表达”是指与不包含能够表达tnfr的外源多核苷酸的相应未经修饰的细胞相比，tnfr的表达水平增加。表达水平可以通过本领域已知的方法来确定，例如实时定量pcr、western印迹和/或流式细胞术。与相应的未经修饰的细胞相比，本发明的细胞可以表达至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍的更高水平的tnfr。合适地，外源多核苷酸表达的tnfr可以在相应的未经修饰的细胞中不可检测。cd27、cd40、d3r、hvem、rank和fn14的说明性氨基酸序列显示为seqidno:25-30。外源多核苷酸序列可以能够表达包含如seqidno:25-30之一所示的序列或其与seqidno:25-30之一具有至少80％序列一致性的变体的多肽。变体可以与seqidno:25-30具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且与相应的亲本seqidno:25-30具有等同的配体结合和信号传导特性。变体可以与seqidno:25具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且与相应的亲本seqidno:25具有等同的配体结合和信号传导特性。变体可以与seqidno:26具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性，并且与相应的亲本seqidno:26具有等同的配体结合和信号传导特性。seqidno:25(cd27)seqidno:26(cd40)seqidno:27(d3r)seqidno:28(hvem)seqidno:29(rank)seqidno:30(fn14)外源多核苷酸可以例如作为核酸构建体或载体提供。可以使用本领域已知的方法，例如通过病毒转导，将核酸构建体和载体引入到细胞中。在一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其是能够表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。表达tnfr的外源多核苷酸可以是如本文定义的外源多核苷酸。本发明进一步提供了试剂盒，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其是能够表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。第一核酸序列和第二核酸序列可以由共表达位点分开，所述共表达位点使得来自单一核酸构建体的第一核酸序列和第二核酸序列能够表达，所述第一核酸序列编码嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；所述第二核酸序列是能够表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。合适地，共表达位点可以是如本文定义的共表达位点。本发明还提供了包含一种或多种核酸序列或核酸构建体的载体或载体试剂盒，其包含(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其是能够表达tnf受体(tnfr)的外源多核苷酸，所述tnf受体(tnfr)能够在配体与tnfr配体结合结构域结合后向细胞提供共刺激。载体可以是如本文定义的载体。核酸构建体或载体可以用于如本文所述的疗法中。嵌合抗原受体(car)图1中示意性显示的经典car是嵌合i型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式或靶抗原的配体。间隔区结构域可以是必要的以将结合物与膜分离并允许其呈合适的定向。使用的常见间隔区结构域是igg1的fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足，例如来自cd8α的茎部和甚至仅仅是igg1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。早期的car设计具有衍生自fcεr1或cd3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。结果，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发t细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化t细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将t细胞共刺激分子的细胞内部分融合至cd3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其能够在抗原识别后同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是cd28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发t细胞增殖。还已经描述了一些受体，其包括tnf受体家族胞内域，例如紧密相关的ox40和4-1bb，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代car，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。可以使用例如逆转录病毒载体将编码car的核酸转移至t细胞。以这种方式，可以生成大量癌症特异性t细胞用于过继细胞转移。当car结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面有其表达的t细胞。因此car将t细胞的特异性和细胞毒性引向表达靶向抗原的肿瘤细胞。抗原结合结构域抗原结合结构域是经典car的识别抗原的部分。本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体，抗体模拟物和t细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)；靶抗原的天然配体；对靶标具有足够亲和力的肽；单结构域结合物例如骆驼科动物的；人工结合物例如darpin；或衍生自t细胞受体的单链。各种肿瘤相关抗原(taa)是已知的，如下表1所示。用于本发明的抗原结合结构域可以是能够结合其中所示的taa的结构域。表1癌症类型taa弥漫性大b细胞淋巴瘤cd19、cd20乳腺癌erbb2、muc1amlcd13、cd33神经母细胞瘤gd2、ncam、alk、gd2b-cllcd19、cd52、cd160结直肠癌叶酸结合蛋白、ca-125慢性淋巴细胞性白血病cd5、cd19胶质瘤egfr、波形蛋白多发性骨髓瘤bcma、cd138肾细胞癌碳酸酐酶ix、g250前列腺癌psma肠癌a33跨膜结构域跨膜结构域是经典car的跨越膜的序列。其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以衍生自cd28，其提供良好的受体稳定性。信号肽car可以包含信号肽，使得当其在细胞如t细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后被引导至其得以表达的细胞表面。信号肽的核心可以含有长段的疏水性氨基酸，其倾向于形成单个alpha螺旋。信号肽可以以短的带正电荷的氨基酸段开始，该氨基酸段有助于在移位期间实施多肽的正确拓扑。在信号肽的末端处，典型地存在一段由信号肽酶识别并切割的氨基酸。信号肽酶可以在移位期间或移位完成后切割以生成游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。间隔区结构域car可以包含间隔区序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原结合。间隔区序列可以例如包含igg1fc区、igg1铰链或人cd8茎部或小鼠cd8茎部。或者，间隔区可以包含备选接头序列，其具有与igg1fc区、igg1铰链或cd8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。可以改变人igg1间隔区以去除fc结合基序。细胞内信号传导结构域细胞内信号传导结构域是经典car的信号传输部分。最常用的信号传导结构域组分是cd3-zeta胞内域的，其含有3个itam。这在抗原结合后向t细胞传输活化信号。cd3-zeta可以不提供完全有能力的活化信号并因此可以需要其他共刺激信号。例如，嵌合的cd28和ox40可以与cd3-zeta一起使用，以传输增殖/存活信号，或者可以将所有三种一起使用(如图1b中所示)。细胞内信号传导结构域可以是或包含t细胞信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可以包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。itam是四个氨基酸的保守序列，其在免疫系统的某些细胞表面蛋白的细胞质尾中重复两次。该基序含有由两个其他氨基酸从亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸，产生签名yxxl/i。在分子的尾部这些签名中的两个通常由6至8个氨基酸分开(yxxl/ix(6-8)yxxl/i)。itam对于免疫细胞中的信号转导是重要的。因此，它们存在于重要的细胞信号传导分子(如t细胞受体复合物的cd3和ζ链，b细胞受体复合物的cd79alpha和beta链以及某些fc受体)的尾部中。这些基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并形成参与细胞的信号传导通路的其他蛋白质的停靠位点。细胞内信号传导结构域组分可以包含含有三个itam的cd3-ζ胞内域，基本上由之组成，或由之组成。经典地，在抗原结合后，cd3-ζ胞内域将激活信号传输至t细胞。然而，在本发明的上下文中，在包含经工程化的b2m的mhc/肽复合物与不同t细胞上的tcr结合后，cd3-ζ胞内域将激活信号传输至t细胞。细胞内信号传导结构域可以包含另外的共刺激信号传导。例如，4-1bb(也称为cd137)可以与cd3-ζ一起使用，或者cd28和ox40可以与cd3-ζ一起使用以传输增殖/存活信号。因此，细胞内信号传导结构域可以包含单独的cd3-ζ胞内域，与选自4-1bb、cd28或ox40胞内域的一个或多个共刺激结构域组合的cd3-ζ胞内域和/或4-1bb、cd28或ox40的一些或全部的组合。胞内域可以包含以下的一种或多种：icos胞内域、cd2胞内域、cd27胞内域或cd40胞内域。胞内域可以包含如seqidno:31至34所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列一致性的变体，条件是该变体序列保留将激活信号传输至细胞的能力。两个多肽序列之间的一致性百分比可以容易地通过程序如blast(其可在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得)来确定。适当地，以完整的参考和/或查询序列中确定一致性百分比。seqidno:31-cd3-ζ胞内域seqidno:32–4-1bb和cd3-ζ胞内域seqidno:33-cd28和cd3-ζ胞内域seqidno:34-cd28、ox40和cd3-ζ胞内域合适地，car可以具有通用形式：抗原结合结构域-tcr元件。如本文所用，“tcr元件”意指tcr受体复合物的组分的结构域或其部分。tcr元件可以包含(例如具有)细胞外结构域和/或跨膜结构域和/或细胞内结构域例如tcr元件的细胞内信号传导结构域。tcr元件可以选自tcralpha链、tcrbeta链、cd3epsilon链、cd3gamma链、cd3delta链、cd3epsilon链.合适地，tcr元件可以包含tcralpha链、tcrbeta链、cd3epsilon链、cd3gamma链、cd3delta链或cd3epsilon链的细胞外结构域。合适地，tcr元件可以包含tcralpha链、tcrbeta链、cd3epsilon链、cd3gamma链、cd3delta链或cd3epsilon链的跨膜结构域。合适地，tcr元件可以包含tcralpha链、tcrbeta链、cd3epsilon链、cd3gamma链、cd3delta链或cd3epsilon链的细胞内结构域。合适地，tcr元件可以包含tcralpha链、tcrbeta链、cd3epsilon链、cd3gamma链、cd3delta链或cd3epsilon链。转基因t细胞受体(tcr)t细胞受体(tcr)是存在于t细胞的表面上的分子，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽的抗原的片段。tcr是由两个不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人类中，95％的t细胞中，tcr由alpha(α)链和beta(β)链组成(分别由tra和trb编码)，而在5％的t细胞中，tcr由gamma和delta(γ/δ)链组成(分别由trg和trd编码)。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)衔接时，t淋巴细胞通过信号转导活化。与常规的抗体针对的靶抗原不同，tcr识别的抗原可以包括潜在的细胞内蛋白质的整个阵列，所述蛋白质作为肽/mhc复合物得以加工并递送到细胞表面。通过使用载体人工将tra和trb基因；或trg和trd基因引入到细胞中，可以工程化改造细胞以表达异源(即非天然)tcr分子。例如，可以将经工程化改造的tcr的基因重新引入到自体t细胞中，并转移回患者中进行t细胞过继疗法。此类“异源”tcr在本文中也可以成为“转基因tcr”。细胞本发明的细胞可以是免疫效应细胞，如t细胞、自然杀伤(nk)细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。t细胞可以是alpha-betat细胞或gamma-deltat细胞。细胞可以衍生自患者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中，或来自不相关供体的外周血(第三方)。在用编码本发明的多肽的核酸分子转导之前，t或nk细胞例如可以活化和/或扩增，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理。或者，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞向t细胞的离体分化。或者，可以使用保留其裂解功能的永生化t细胞系。细胞可以是造血干细胞(hsc)。可以在通过施用药理剂量的细胞因子如g-csf进行活动化(mobilization)后通过外周血的白细胞单采术(leukopheresis)从合适匹配的供体的骨髓中[外周血干细胞(pbsc)]，或者从分娩后从胎盘收集的脐带血(ucb)获得用于移植的hsc。骨髓、pbsc或ucb可以不经处理而移植，或者可以通过用针对cd34表面抗原的单克隆抗体进行免疫选择来富集hsc。本发明的细胞是工程化细胞。因此，相应的未经修饰的细胞(例如，未经修饰的alpha-betat细胞、nk细胞、gamma-deltat细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞)不天然表达car或转基因和嵌合tnfr。核酸构建体/核酸序列的试剂盒本发明提供了核酸构建体，其包含：(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其编码嵌合tnf受体(tnfr)，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域。合适地，包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域的嵌合tnf受体(tnfr)可以在单一核酸序列上编码。本发明进一步提供了包含根据本发明的核酸序列的试剂盒。例如，试剂盒可以包含根据本发明的(i)第一核酸序列，其编码i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)第二核酸序列，其编码嵌合tnf受体(tnfr)，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域。如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。合适地，核酸构建体可以包含多个核酸序列，其编码如本发明提供的不同的嵌合tnfr。例如，核酸构建体可以包含编码本发明的不同的嵌合tnfr的两个、三个、四个或五个核酸序列。合适地，多个核酸序列可以由如本文定义的共表达位点分开。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。合适地，对本发明的多核苷酸进行密码子优化，以使其能够在哺乳动物细胞，特别是如本文所述的免疫效应细胞中表达。根据本发明的核酸可以包含dna或rna。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端处添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解，可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。关于核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括从该序列或对该序列的一个(或多个)核酸进行的任何取代、变化、修饰、替换、缺失或添加。共表达位点共表达位点在本文中用于指能够共表达如本文所定义的以下两者的核酸序列：i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和(ii)嵌合tnf受体(tnfr)，其包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域。共表达位点可以是编码切割位点的序列，使得工程化的多核苷酸编码通过切割位点接合的转基因合成生物学途径的酶。通常，共表达位点位于编码转基因合成生物学途径的单独酶的邻近的多核苷酸序列之间。合适地，在工程化的多核苷酸中存在多个共表达位点的实施方案中，可以使用相同的共表达位点。优选地，共表达位点是切割位点。切割位点可以是能够使两个多肽分开的任何序列。切割位点可以是自切割的，从而当产生多肽时，其立即切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。术语“切割”在本文中为了方便而使用，但是切割位点可以通过除经典切割外的机制将肽分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自身切割肽(参见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：由宿主-细胞蛋白酶蛋白水解，自体蛋白水解或翻译效应(donnellyetal(2001)j.gen.virol.82:1027-1041)。只要当位于编码蛋白质的核酸序列之间的切割位点导致蛋白质作为单独的实体表达时，此类“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要。切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)切割位点。弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是将潜伏的前体蛋白加工成其生物学活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在它们配对的碱性氨基酸加工位点有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原，转化生长因子β1前体，白蛋白原，β-分泌酶原，膜1型基质金属蛋白酶，神经生长因子原的β亚基和willebrand因子。弗林蛋白酶正好在基本氨基酸靶序列(典型地为arg-x-(arg/lys)-arg')的下游切割蛋白，并且在高尔基体中富集。切割位点可以是烟草蚀刻病毒(tev)切割位点。tev蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是糜蛋白酶样蛋白酶。它非常特异于其靶切割位点，因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有tev切割位点为enlyfq\s(其中“\”表示被切割的肽键)。哺乳动物细胞，如人类细胞，不表达tev蛋白酶。因此，在本核酸构建体包含tev切割位点并且在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，必须在哺乳动物细胞中也表达外源tev蛋白酶。切割位点可以编码自切割肽。“自切割肽”是指下述肽，该肽发挥功能使得当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其立即被“切割”或分离成独特的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。自切割肽可以是来自口蹄病毒或心脏病毒的2a自切割肽。口蹄病毒和心脏病毒的主要2a/2b切割由在其自身c端“切割”的2a介导。在口蹄病毒例如口蹄疫病毒(fmdv)和马鼻炎a型病毒中，2a区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白2b的n端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表了能够在其自身c端介导“切割”的自主元件(donellyetal(2001)，如上文)。已经在除口蹄病毒或心脏病毒外的小核糖核酸病毒，“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒，c型轮状病毒，锥虫属物种中的重复序列和细菌序列中发现了“2a样”序列(donnellyetal.,2001)，如上所述。共表达序列可以是内部核糖体进入序列(ires)。共表达序列可以是内部启动子。载体本发明还提供了包含本发明的一种或多种核酸序列或核酸构建体的载体或载体的试剂盒。此类载体可以用于将核酸序列或构建体引入到宿主细胞中，使得它表达car或转基因tcr以及嵌合tnf受体(tnfr)，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域。合适地，载体可以包含多个核酸序列，其编码如本发明提供的不同的嵌合tnfr。例如，载体可以包含编码本发明的不同的嵌合tnfr的两个、三个、四个或五个核酸序列。合适地，多个核酸序列可以由如本文定义的共表达位点分开。载体可以例如是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。载体可以能够转染或转导细胞。药物组合物本发明还涉及含有本发明的细胞、核酸构建体、第一核酸序列和第二核酸序列；载体或第一和第二载体的药物组合物。特别地，本发明涉及含有根据本发明的细胞的药物组合物。药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类剂型可以是例如适合用于静脉内输注的形式。治疗方法本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞、核酸构建体、第一核酸序列和第二核酸序列；载体或第一和第二载体(例如在如上所述的药物组合物中)施用于受试者的步骤。合适地，用于治疗和/或预防疾病的本方法可以包括将本发明的细胞(例如在如上所述的药物组合物中)施用于受试者。治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗性用途。在这方面，可以对患有现有疾病或病况的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防性用途。在这方面，可以对尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的起因，或减少或预防至少一种与此类病有关的症状的形成。受试者可以具有疾病的素因，或认为有形成疾病的风险。方法可以包括以下步骤：(i)分离含有细胞的样品；(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；(iii)对受试者施用来自(ii)的细胞。本发明提供了本发明的细胞、核酸构建体、第一核酸序列和第二核酸序列、载体或第一和第二载体，其用于治疗和/或预防疾病。特别地，本发明提供了本发明的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。本发明还涉及本发明的细胞、核酸构建体、第一核酸序列和第二核酸序列、载体或第一和第二载体在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。特别地，本发明涉及细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌症。癌症可以是如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。本发明的细胞，特别是car细胞可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞。可以通过taa的表达来识别靶细胞，例如以上表1中提供的taa的表达。癌症可以是表1中列出的癌症。制备细胞的方法可以通过许多方式之一引入编码car或tcr以及嵌合tnf受体(tnfr)来生成本发明的表达car或转基因tcr的细胞，所述嵌合tnf受体(tnfr)包含(a)能够结合tnfr配体的结合结构域；和(b)tnfr激活信号传导结构域，所述方式包括用病毒载体转导，用dna或rna转染。本发明的细胞可以通过以下制备：(i)从受试者或以上列出的其他来源之一中分离含有细胞的样品；和(ii)在体外或离体用一种或多种如上定义的核酸序列或核酸构建体转导或转染细胞。然后可以纯化细胞，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达来选择。本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。在提供值的范围的情况下，应理解的是，也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，除非上下文另外明确指出，直到下限的单位的十分之一。在本公开中涵盖了在规定范围中任何规定值或中间值以及在该规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且其中任一、无一或两个限制包括在较小范围中的每个范围也涵盖在本公开中，受规定范围内任何明确排除的限制。在规定范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中。必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。如本文所用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未引用的成员、元素或方法步骤。术语“包含”也包括术语“由……组成”。仅针对本申请的提交日期之前的公开提供本文讨论的出版物。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成了所附权利要求的现有技术。现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1-cd27-4-1bb嵌合tnf受体的体外测试原代人t细胞经转导以表达cd19cart细胞，并且另外经工程化改造以共表达cd27-4-1bb嵌合tnf受体。cd19cart细胞和共表达cd27-4-1bb的cd19cart细胞与raji肿瘤细胞系共培养。表达cd70的自体单核细胞或树突细胞与cart细胞/raji细胞共培养。通过流式细胞术通过计数存活的靶细胞的数目来确定靶细胞的杀伤。通过流式细胞术确定cart细胞的增殖和表型。实施例2-cd27-4-1bb嵌合tnf受体的体内测试通过尾静脉注射将同基因a20鼠淋巴瘤工程化细胞系(经工程化改造以表达萤火虫萤光素酶)植入小鼠。10-14天后，将a20细胞系植入骨髓、脾和淋巴结组织中。用抗-(鼠)-cd19car转导或用共表达抗-(鼠)-cd19car与(鼠)cd27-4-1bb嵌合tnf受体的双顺反子载体转导鼠t细胞。三组a20负荷的小鼠被给予无cart细胞、抗cd19cart细胞或抗cd19/cd27-4-1bbcart细胞。通过连续生物发光成像测量a20肿瘤的进展。在实验结束时，处死小鼠，并进行尸检。通过血液、骨髓、脾和淋巴结组织的流式细胞术确定cart细胞植入。还通过这些组织中的流式细胞术以及骨髓的免疫组织化学确定了剩余的肿瘤负荷。实施例3-rank-4-1bb嵌合体的体内测试nsg小鼠接受经尾静脉注射的经工程化改造以表达萤火虫萤光素酶的骨髓瘤细胞系(mm1s)。该细胞系归巢于小鼠的骨髓，并引起溶骨性病变。用bcma特异性car或共表达bcmacar与rank-4-1bb嵌合tnf受体的盒转导原代人t细胞。12天后，小鼠接受非转导的t细胞、bcma-cart细胞或bcma-car/rank-4-1bb嵌合体t细胞。通过系列生物发光成像确定肿瘤的进展。也通过微型ct测量溶骨性病变。实验结束时处死动物。通过骨髓的流式细胞术和免疫组织化学确定疾病负担。也可以通过骨髓的组织化学测量溶骨性病变。通过骨髓、脾、血液和淋巴结的流式细胞术确定t细胞的植入和持久性。实施例4-fn14-4-1bb嵌合体的体外测试用egfrviiicar或共表达egfrviiicar和fn14-4-1bb嵌合tnf受体的双顺反子载体转导原代人t细胞。与非转导的t细胞、cart细胞或car/fn14-4-1bbt细胞进行共培养以包括经工程化改造以表达egfrviii的人胶质瘤细胞系(如a172细胞系、ln-18细胞系或ln-229细胞系)。也相同地进行平行共培养，但是添加了分泌tweak的基质细胞。通过流式细胞术确定靶细胞的杀伤和t细胞的增殖/分化。实施例5-fn14-4-1bb嵌合体的体内测试使用立体定向注射将表达鼠egfrviii的鼠胶质瘤细胞系gl261原位植入小鼠。使用微型mri确定和测量肿瘤的植入和进展。用egfrviiicar或共表达egfrviiicar和fn14-4-1bb嵌合tnf受体的双顺反子载体转导同基因脾细胞。另外转导脾细胞以表达萤火虫萤光素酶。用低剂量(5gy)全身辐照对携带gl261的小鼠进行辐射，携带gl261的小鼠分为三组：无cart细胞、egfrviiicart细胞和egfrviii/fn14-4-1bbcart细胞。通过连续生物发光成像通过实验确定t细胞的运输、扩增和增殖。使用微型mri确定肿瘤反应。实验结束时，处死小鼠。系统性地通过骨髓、血液、脾和淋巴结的流式细胞术确定t细胞的植入。收获小鼠的大脑。一半固定，并通过免疫组织化学确定肿瘤反应/t细胞浸润。将其他小鼠大脑匀浆，并使用percoll分离t细胞。通过流式细胞术确定分离的t细胞数目和质量。实施例6-rank-4-1bb或hvem-4-1bb嵌合tnf受体的体外测试转导原代人t细胞以表达单独的第一代gd2car或共表达gd2car与rank-4-1bb或hvem-4-1bb嵌合tnf受体。在存在或不存在呈递嵌合tnf受体的配体的细胞的情况下，将car-t细胞与表达特定肿瘤抗原(靶细胞)或不表达特定肿瘤抗原(非靶细胞)的靶细胞共培养。通过流式细胞术通过计数存活的靶细胞数目来确定靶细胞的杀伤。还通过流式细胞术确定cart细胞的增殖。结果显示在图4和5中。对于hvem-4-1bb嵌合tnf受体(图4a)和rank-4-1bb嵌合tnf受体(图5a)两者，嵌合tnf受体的表达增加了t细胞的增殖，尤其是在存在呈递tnf受体的配体的细胞的情况下。嵌合tnf受体的表达也增加了car介导的靶细胞杀伤(图4b和5b)，特别是在存在呈递tnf受体的配体的细胞的情况下。细胞培养和试剂实验中使用的所有细胞系和原代t细胞均在补充有10％胎牛血清(fbs，biosera)和1％l-谷氨酰胺(glutamax，gibco)的rpmi1640培养基(lonza)中培养。supt1细胞购自atcc。t细胞是从nationalhealthservicebloodandtransplant(nhsbt；colindale，uk)获得的pbmc生成的。转导的t细胞在与前述相同的培养基中培养，其中进一步添加100u/ml的白介素-2(il-2)。逆转录病毒和质粒构建体使用重叠的寡核苷酸，使用密码子优化序列的从头基因合成的混合物进行分子克隆，并将其克隆到car主链中。将每个开放阅读框克隆到sfg逆转录病毒转移载体中。通过框内克隆基于口蹄2a自切割肽的(2a肽)多基因表达系统来共表达tnf-4-1bb序列。如wo2013/153391中所述，还使用了rqr8标志物基因。rqr8由qbend/10抗cd34mab识别。将这些标志物引入具有配置rqr8_car_tnf-4-1bb中的密码子摆动的2a肽的构建体中。转导通过使用genejuice(millipore)，用编码gag-pol的质粒(peq-pam3-e36)、编码rd114包膜的质粒(rdf37)和期望的逆转录病毒转移载体质粒瞬时转染293t细胞来产生逆转录病毒。如前所述，使用retronectin(takara)进行转导。基于rqr8染色(其使用qbend/10mab进行)的表达，通过流式细胞术对不同构建体的转导效率进行评价。使用macsquantanalyzer10(miltenyi)进行流式细胞术分析。使用bdfacs进行流式分选。t细胞增殖测定法在存在tnf配体呈递细胞(如图中所示为“rankl”或“light”)的情况下，进行celltraceviolet(ctv)染色以评价在与靶细胞supt1-gd2(或supt1-nt细胞作为对照)的共培养物中表达car和ctnfr序列(或仅car)的t细胞的增殖。在建立与靶细胞共培养物之前，用ctv标记表达不同car构建体的t细胞(ntt细胞用作对照)。根据制造商的说明，通过将t细胞重悬于含有ctv染料的新鲜pbs中进行染色。共培养物以1:2的效应物:靶标(e:t)细胞比率。5天后通过流式细胞术评价增殖。分别用7-aad和cd3对细胞进行染色以排除死细胞并检测t细胞。使用ctv染色的细胞通过死细胞的染料稀释程度来测量增殖。体外细胞毒性测定法根据制造商的说明，使用easysep人cd56阳性选择试剂盒(stemcelltechnologies)，耗竭表达car和tnf-4-1bb蛋白(或仅car)的t细胞中的表达cd56的自然杀伤细胞。然后在5和7天后将细胞用于细胞毒性测定法。在存在/不存在tnf配体呈递细胞(如图中所示为“rankl”或“light”)的情况下，使用表达靶标的supt1，以1：2效应物:靶标(e:t)细胞比率建立细胞毒性测定法。在相同的条件下使用supt1wt细胞作为对照。非转导(nt)t细胞在具有靶标的共培养物中用作阴性对照。5天后通过流式细胞术评价car介导的细胞毒性。通过cd3和染色从靶细胞中鉴定出t细胞。7-aad活性染料用于排除死细胞。列举每种共培养条件下的活靶细胞。通过将每种条件的活靶细胞数目相对于从与ntt细胞进行的共培养中回收的活靶细胞数目(100％)进行标准化，来计算剩余靶细胞的百分比。以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的是描述的用于实施本发明的方式的各种修改都旨在所附权利要求的范围内。序列表<110>奥托路斯有限公司<120>细胞<130>p113661pct<150>gb1720949.5<151>2017-12-15<160>37<170>patentinversion3.5<210>1<211>268<212>prt<213>人工序列<220><223>d3r/4-1bb嵌合tnfr<400>1metgluglnargproargglycysalaalavalalaalaalaleuleu151015leuvalleuleuglyalaargalaglnglyglythrargserproarg202530cysaspcysalaglyaspphehislyslysileglyleuphecyscys354045argglycysproalaglyhistyrleulysalaprocysthrglupro505560cysglyasnserthrcysleuvalcysproglnaspthrpheleuala65707580trpgluasnhishisasnserglucysalaargcysglnalacysasp859095gluglnalaserglnvalalaleugluasncysseralavalalaasp100105110thrargcysglycyslysproglytrpphevalglucysglnvalser115120125glncysvalserserserprophetyrcysglnprocysleuaspcys130135140glyalaleuhisarghisthrargleuleucysserargargaspthr145150155160aspcysglythrcysleuproglyphetyrgluhisglyaspglycys165170175valsercysprothrserthrleuglysercysprogluargcysala180185190alavalcysglytrpargglnileileserphepheleualaleuthr195200205serthralaleuleupheleuleuphepheleuthrleuargpheser210215220valvallysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnpro225230235240phemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercys245250255argpheproglugluglugluglyglycysgluleu260265<210>2<211>271<212>prt<213>人工序列<220><223>hvem/4-1bb嵌合tnfr(tnf受体)<400>2metgluproproglyasptrpglyproproprotrpargserthrpro151015argthraspvalleuargleuvalleutyrleuthrpheleuglyala202530procystyralaproalaleuprosercyslysgluaspglutyrpro354045valglyserglucyscysprolyscysserproglytyrargvallys505560glualacysglygluleuthrglythrvalcysgluprocyspropro65707580glythrtyrilealahisleuasnglyleuserlyscysleuglncys859095glnmetcysaspproalametglyleuargalaserargasncysser100105110argthrgluasnalavalcysglycysserproglyhisphecysile115120125valglnaspglyasphiscysala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