抗体和生理活性物质的缀合方法与流程

本发明涉及fc位点特异性缀合肽，缀合肽修饰的生理活性物质，抗体与缀合肽修饰的生理活性物质共价连接的抗体缀合物，以及制造抗体缀合物的方法，其中在fc位点特异性缀合肽中，由氨基酸序列seqidno:1表示的fc结合肽的位置5、10或11被具有光反应性官能团的氨基酸置换。

背景技术：

在过去的20年中，由于基于在小鼠中研制单克隆抗体(mabs)的杂交瘤技术，用于制造嵌合抗体(嵌合mabs)、人源化抗体(人源化mab)和完整人类抗体(完整人类mab)的技术的开发，抗体工程已经取得进展，并且目前将抗体视为治疗性药物(治疗性mab)。fda已经批准了28种治疗性抗体，并且将这些治疗性抗体用作治疗多种疾病的药剂，例如移植排斥、癌症、自身免疫疾病、炎症、心脏病和感染，并且目前有约300种治疗性抗体处于临床开发阶段，预计未来将开发更多的治疗性抗体并使其商业化。此外，正在进行许多研究，以开发与常规抗体(裸mab)相比具有改进的效力的下一代治疗性抗体。在这些治疗性抗体中，对这样的缀合物进行了积极的研究，在该缀合物中，对特异性抗原具有结合亲和力的单克隆抗体和具有生物活性的物质连接。当开发这些抗体缀合物作为治疗性药物时，由于抗体的靶标特异性，因此可以预期物质的高效和降低的副作用，此外，诸如无体内毒性、免疫原性低和体内半衰期长之类的抗体的特征也是可以加速开发的抗体缀合物药物的商业化的因素。其中抗体和展现出细胞毒性的小分子药物连接的抗体-药物缀合物(adc)已经由制药公司开发并且用作肿瘤靶向治疗剂。

为了开发作为治疗性药物的抗体缀合物，该抗体缀合物应该保留未缀合的抗体和生物活性物质的性质。抗体缀合物必须能够维持与未缀合到物质上的(裸)抗体相同的亲和力。即，抗体与物质的连接不应该阻碍天然抗原-抗体结合。此外，抗体缀合物中的物质还应当能够在到达靶标之后展现出活性。即，在抗体缀合物中，必须维持单克隆抗体和生物活性物质各自的固有性质，这是由这两种分子的缀合方法确定的。此外，用于缀合的接头必须在血液中是稳定的，以防止物质与抗体分离并到达靶标组织/细胞。通常，用于抗体缀合物的接头为酸不稳定的腙、蛋白酶可切割的肽和对还原剂敏感的二硫化物。也使用不可切割的硫醚接头。为了使抗体和物质缀合，通常使用利用抗体的反应性基团(赖氨酸的ε-氨基或半胱氨酸的巯基)的方法，或者通过突变将半胱氨酸残基引入抗体并利用巯基的反应性的方法。使用抗体自身的官能团的方法不能指定物质的连接位置，并且抗体与物质的摩尔比不可控，因此产生了异源抗体缀合物。在使用人工引入到抗体中的半胱氨酸的巯基的情况下，需要使抗体突变，并且难以预测对抗体自身的结构和活性的影响。

最近，已经报道了通过将光反应性人工氨基酸引入到fc结合肽中，然后使用fc缀合肽修饰药物来制造抗体-药物缀合物，从而来制造低分子量的fc缀合肽的方法(韩国专利公开no.10-2014-0004530(2014.01.13))。然而，必须通过化学合成制备上述发明中使用的肽材料，因此，缀合方法限于使药物与抗体缀合的情况，并且难以用于诸如蛋白质之类的物质和抗体的缀合。此外，用于上述发明的光反应性氨基酸(实验例：使用光-亮氨酸、光-甲硫氨酸)的非特异性反应性使得难以开发作为药物的抗体缀合物(yoshihitotanaka等人,molecularbiosystems,4(6):473-480,2008)。

因此，本发明的发明人开发了一种fc位点特异性缀合肽，其中用具有光反应性官能团的氨基酸(对苯甲酰基苯丙氨酸(pbpa))取代能够与抗体的fc结构域结合的fc结合肽的位点，并制备用缀合肽修饰的生理活性物质，并且通过基于引入的光反应性氨基酸的反应使抗体和物质共价连接，确认了物质以位点特异性方式高效率地与抗体缀合，从而完成了本发明。

提供在背景技术部分中描述的上述信息仅是为了提高对本发明的背景的理解，因此可以不包括本发明所属技术领域中的普通技术人员已知的信息。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明的目的是提供一种能够通过光反应进行抗体和物质的位点特异性缀合的肽。

本发明的另一个目的是提供肽修饰的物质。

本发明的又一个目的是提供一种制造抗体缀合物的方法，其中肽修饰的物质与抗体连接。

本发明的又另一个目的是提供通过使用所述制造方法制造的抗体缀合物。

[技术方案]

为了实现上述目的，本发明提供了fc位点特异性缀合肽，其中由氨基酸序列seqidno:1表示的fc结合肽的位置5、10或11被具有光反应性官能团的氨基酸置换。

本发明还提供了一种缀合肽修饰的物质，其中该物质与肽直接连接或通过接头与肽连接。

本发明还提供了一种制造抗体缀合物的方法，该方法包括：(a)将被缀合肽修饰的物质与含fc结构域的分子混合；(b)用光照射混合物以诱导光反应，然后制造抗体缀合物，在该抗体缀合物中，缀合肽修饰的物质的光反应性官能团和含fc结构域的分子共价连接；以及(c)获得制造的抗体缀合物。

本发明还提供了一种抗体缀合物，其中抗体与缀合肽修饰的物质连接。

附图说明

图1为示出了根据本发明的用于缀合抗体和物质的技术的示意图。

图2示出了抗体和本发明的光反应性肽修饰的物质之间的光反应之后的电泳结果，以确定fc结合肽(seqidno:1)中对苯甲酰基苯丙氨酸的置换位点。

图3为示出了表达本发明的fc缀合肽修饰的β-内酰胺酶(fciii-β-内酰胺酶)的质粒和在该质粒中表达的fciii-β-内酰胺酶的示意图。

图4为示出了表达本发明的fc缀合肽修饰的β-内酰胺酶酶原(fciii-β-内酰胺酶酶原)的质粒和在该质粒中表达的fciii-β-内酰胺酶酶原的示意图。

图5为示出了表达本发明的fc缀合肽修饰的pe24(fciii-pe24)的质粒和在该质粒中表达的fciii-pe24的示意图。

图6a示出了根据本发明的表达重组trna合成酶的质粒。

图6b示出了表达脯氨酸trna合成酶的质粒。

图7示出了将本发明的各融合蛋白和抗体(西妥昔单抗)缀合的电泳结果。

图8示出了z-结构域抑制抗体(西妥昔单抗)和本发明的融合蛋白之间的缀合的结果，这证明了光反应的位点特异性。

图9示出了通过lc-ms/ms确认本发明的fc缀合肽和抗体(西妥昔单抗)缀合的位点的结果。

图10示出了通过电泳观察西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的分离的结果，在该西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物中，本发明的融合蛋白和抗体(西妥昔单抗)以1:1缀合。

图11示出了确认本发明的西妥昔单抗-fciii-pe24的ef2核糖基化活性的结果。

图12示出了确认本发明的西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的细胞生长抑制活性的结果。

图13示出了通过电泳观察本发明的融合蛋白和抗体(曲妥珠单抗)之间的位点特异性缀合和曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的分离的结果，其中在该曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物中，融合蛋白和抗体以1:1结合。

图14示出了确认本发明的曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的细胞生长抑制活性的结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和下述实验方法是本领域公知和常用的。

在本发明中，通过使fc位点特异性缀合肽修饰的物质与抗体共价连接，证实了与常规抗体结合肽不同，形成了不可逆的化学键，并且取决于光反应性官能团的引入位点，缀合肽修饰的物质与抗体的缀合效率得以增强(参见图2)，其中在fc位点特异性缀合肽中，fc结合肽的位置5、10或11被具有光反应性官能团的氨基酸置换。

因此，一方面，本发明涉及fc位点特异性缀合肽，其中由氨基酸序列seqidno:1表示的fc结合肽的位置5、10或11被具有光反应性官能团的氨基酸置换。

在本发明中，fc结合肽(氨基酸序列为seqidno:1，基因序列为seqidno:2)是由13个氨基酸组成的短肽，其与人源抗体(igg1)的fc结构域的ch3-ch2界面区域位点特异性结合(w.l.delano等人，science,2000)。该肽具有u形结构，因为两个半胱氨酸形成二硫键。

在本发明中，被具有光反应性官能团的氨基酸置换的位置可为位置10。

在本发明中，可以通过以下方式制造被具有光反应性官能团的氨基酸置换的fc位点特异性缀合肽：鉴定fc结合肽的氨基酸序列，使用已知方法表达肽，例如，通过构建能够表达肽的表达载体，将该载体转化到宿主细胞中，并使用重组技术表达肽；或者可以通过以下方式制造被具有光反应性官能团的氨基酸置换的fc位点特异性缀合肽：进行人工合成，然后用具有光反应性官能团的氨基酸置换至少一个氨基酸残基或引入具有光反应性官能团的氨基酸；或者可通过在人工合成中包括具有至少一个光反应性官能团的氨基酸从而合成被具有光反应性官能团的氨基酸置换的fc位点特异性缀合肽。

可以使用公知的基因操作方法进行基因的引入。例如，可以使用的方法有：物理方法，例如使用诸如病毒之类的载体的方法；使用合成磷脂或合成阳离子聚合物的非病毒方法；以及通过对细胞膜施加暂时的电刺激而引入基因的电渗透方法，但是本发明不限于此。

在本发明中，“扩增”概念上包括相应基因的某个碱基的突变、置换或缺失，某个碱基的引入，或源自编码相同酶的其他微生物的基因的引入，以增加相应酶的活性。

在本发明中，“载体”是指包含这样的dna序列的dna构建体，其中该dna序列与能够在合适的宿主中表达dna的合适的调节序列可有效地连接。载体可为质粒、噬菌体颗粒或仅为潜在的基因组插入物。一旦载体转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主的基因组而复制并发挥作用，或者在一些情况下，载体可以与基因组自身整合。由于质粒是目前最常用的载体形式，因此术语“质粒”和“载体”在本发明的整个说明书中可以互换使用。然而，本发明包括具有与本领域已知或尚未已知的那些载体相同的功能的其他形式的载体。

在本发明中，“表达载体”通常是指重组载体，其中插入了异源dna的片段，并且通常是指双链dna的片段。在本文中，异源dna是指宿主细胞中非天然存在的外源dna。一旦表达载体存在于宿主细胞中，表达载体就可以独立于宿主染色体dna而复制，并且可以制造载体和在载体中插入(异源)dna的几个拷贝。如本领域公知的，为了提高宿主细胞中转基因的表达水平，必须将基因有效连接到在选择的表达宿主中起作用的转录/翻译表达调节序列上。优选地，在一个表达载体中包括表达调节序列和相应的基因，表达载体包括细菌选择性标记和复制起点。当表达宿主为真核细胞时，表达载体应进一步包括在真核表达宿主中有用的表达标记。

在本发明中，“整合载体”是指通过整合酶在核酸中进行整合或插入的载体。整合载体的实例包括(但不限于)逆转录病毒载体以及转位子相关病毒载体和腺相关病毒载体。

本发明的另一个实施方案提供了用载体转化或转染的宿主细胞。本文使用的术语“转化”是指将dna导入宿主，并使dna通过染色体外因子或染色体整合复制。这包括将核酸导入生物体、细胞、组织或器官的任何方法，并且如本领域公知的，可以通过选择适合于宿主细胞的标准技术来进行。这些方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、peg、硫酸葡聚糖、脂质体和干燥/抑制介导的转化方法，但本发明不限于此。本发明的宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。此外，通常使用具有高dna导入效率和所导入dna的高表达效率的宿主。可以使用的宿主细胞的实例包括：公知的真核宿主和原核宿主，如大肠杆菌(e.coli)、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、链霉菌(streptomyces)、真菌、酵母；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda,sf9)细胞；动物细胞，如cho和小鼠细胞；非洲绿猴细胞，如cos1、cos7、bsc1、bsc40和bmt10；以及组织培养的人类细胞。

当然，应当理解，不是所有的载体在表达本发明的dna序列中都发挥相同的功能。同样地，不是所有宿主对相同表达系统都发挥相同的功能。然而，本领域技术人员将能够从各种载体、表达调节序列和宿主中进行适当的选择，而没有过度的实验负担，并且不脱离本发明的范围。例如，应当在考虑宿主的情况下进行载体的选择，因为载体必须在宿主中复制。还应考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应的载体编码的其他蛋白质的表达，例如抗生素标记的表达。在选择表达调节序列时，需要考虑各种因素。例如，应当考虑序列的相对强度、调节的可能性和与本发明的dna序列的相容性，特别是关于可能的二级结构。可考虑以下因素选择单细胞宿主，例如选择的载体、由根据本发明的dna序列编码的产物的毒性、分泌特性、精确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及由根据本发明的dna序列编码的产物的纯化容易性。在这些变量的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大规模动物培养中表达本发明的dna序列的各种载体/表达调节序列/宿主组合。作为通过表达克隆来克隆nsp蛋白的cdna的筛选方法，可以应用结合法、淘选法、膜乳化法等。

在本发明中，“原生质体融合”是指去除诸如植物细胞或细菌之类的原生质体的细胞壁，并使用原生质体融合具有不同特征的两种细胞的技术。对于原生质体融合，有如下方法：化学方法，例如向高浓度的渗透溶液中添加诸如钙或镁之类的金属离子；或者物理方法，例如将原生质体暴露在电击中，以在细胞膜中暂时产生小孔，从而增加原生质体的dna吸收。

在本发明中，“光反应性官能团”可以为在光照射时能够吸收特定波长的光，从而与相邻反应性官能团形成共价键的官能团。

当根据本发明的具有光反应性官能团的fc位点特异性缀合肽与抗体混合时，由于缀合肽的作为固有性质的结合特异性，因此缀合肽位于抗体的fc结构域附近或与抗体的fc结构域结合。此后，当用光照射混合物时，混合物可吸收特定波长的光，从而通过光反应性官能团与对抗体的fc结构域上的光反应性具有反应性的基团的残基相邻而形成共价键。即，本发明的fc位点特异性缀合肽可以在光照射时通过光反应性官能团而与fc结构域的特异性官能团共价连接。

在本发明中，具有光反应性官能团的氨基酸可为对苯甲酰基苯丙氨酸。具有光反应性官能团的人工氨基酸可以包括光-亮氨酸、光-甲硫氨酸、叠氮基苯丙氨酸等，但是本发明中使用的光反应性官能团优先作用于特异性官能团，并且具有通过长波长的光(即，低光能量)激活共价键的特异性。

由下式1表示本发明的对苯甲酰基苯丙氨酸。

[式1]

在另一方面，本发明涉及缀合肽修饰的物质，其中该物质与上述肽直接连接或通过接头与上述肽连接。

在本发明中，该物质可为治疗剂或诊断剂，并且治疗剂或诊断剂可选自由酶、激素、细胞因子、抗体、抗体片段、止痛剂、退热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、作用于中枢神经系统的药物、影响肾功能和电解质代谢的药物以及化疗剂组成的组。

本发明的物质可为治疗剂或诊断/检测剂。特别地，用作该物质的抗体可为治疗性抗体。目前，fda批准了约30种的治疗性抗体，并且由于这些治疗性抗体的性质与体内存在的igg的性质几乎相同，因此其安全性非常高。抗体用作多种病症(例如，移植排斥、癌症、自身免疫疾病和炎症、心脏病和感染)的治疗剂。特别地，当包含fc结构域的分子为治疗性抗体时，治疗性抗体识别并结合特异性存在于患病组织中的受体蛋白或抗原蛋白，因此具有非常高的特异性。因此，当分子成像探针或药物载体作为物质与治疗性抗体组合时，这可以转化为能够监测治疗过程和药物联合效果的治疗剂。此外，通过将分子成像探针或药物递送系统与简单的靶向抗体联合，能够开发用于诊断、治疗或同时诊断和治疗的治疗剂。

治疗剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放射性同位素。

诊断/检测剂的非限制性实例包括放射性同位素、染料(例如，生物素-链亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(mri)的增强剂(例如，顺磁离子)。优选地，诊断剂包括放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁性离子负载抗体组分，可能需要使抗体组分与具有长尾部的试剂反应，其中该长尾部附接至用于结合离子的多个螯合基团。尾部可为聚合物，例如聚赖氨酸或多糖，或者为具有可以与螯合基团结合的侧基的衍生化链或可衍生链，其中所述螯合基团例如为乙二胺四乙酸(edta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲和聚肟和已知可用于上述目的基团。螯合物通常可以通过能够与分子成键而免疫反应性的损失最小且聚集最小的官能团和/或通过内部交联与fc位点特异性缀合肽连接。

特别地，有用的金属-螯合物组合包括在60kev至4,000kev的一般能量范围内使用的诊断同位素、2-苄基-dtpa以及它们的一甲基类似物和环己基类似物，并且放射性成像剂的实例包括¹²⁵i、¹³¹i、¹²³i、¹²⁴i、⁶²cu、⁶⁴cu、¹⁸f、¹¹¹in、⁶⁷ga、⁹⁹mtc、⁹⁴mtc、¹¹c、¹³n、¹⁵o和⁷⁶br。在与诸如锰、铁和钆之类的非放射性金属络合的情况下，当与本发明的纳米颗粒或抗体一起使用时，相同的螯合物可用于mri。诸如nota、dota和teta之类的大环螯合物优选分别与为镓、钇和铜的放射性核素的各种金属和放射性金属一起使用。通过使环的尺寸与相应的金属相匹配，可以非常稳定地制备金属螯合物复合物。根据本发明，可以制备环状螯合物，例如用于稳定地将诸如²²³ra之类的核素结合到rait上的大环聚醚。

免疫缀合物为抗体组分与治疗剂或诊断剂的缀合物。诊断剂包括放射性或非放射性标记和造影剂(适于磁共振成像、计算机断层扫描或超声的造影剂)，并且放射性标记可为γ发射同位素、β发射同位素、α发射同位素、俄歇电子发射同位素或正电子发射同位素。

在本发明中，“免疫调节剂”通常刺激免疫细胞增殖或在免疫应答级联中激活，例如巨噬细胞、b细胞和/或t细胞。免疫调节剂的实例为细胞因子。如本领域普通技术人员显而易见地，白细胞介素和干扰素为刺激t细胞或其他免疫细胞活性的细胞因子。

脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、肽核酸(pna)或锁核酸(lna)可以与本发明的fc位点特异性缀合肽直接连接，或通过接头与本发明的fc位点特异性缀合肽连接。由于dna、rna、pna和lna为具有与具备互补序列的材料特异性结合的性质的聚合物，因此与dna、rna、pna或lna连接的fc位点特异性缀合肽可以用于基因筛选、生物传感器等。

与dna、rna、pna或lna连接的fc位点特异性缀合肽可以固定在固体支持物上，以用作生物芯片、生物传感器、免疫检测试剂盒或互补性可自寻址芯片。

在本发明中，接头可以包括反应性官能团、氨基酸和自切割间隔物。

本发明的接头可为将被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽的特异性残基与物质连接的形式，并且可以具有与亲电子基团反应的反应性位点，该亲电子基团与存在于被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽中的亲核残基(例如，半胱氨酸)反应。接头可以包括(例如)与被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽结合的反应性官能团、氨基酸和自切割间隔物。

官能团可为i)马来酰亚胺基、乙酰胺基或它们的衍生物，ii)氮丙啶基、芳基卤化物、丙烯酰基或它们的衍生物，或iii)烷基化反应性基团、芳基化反应性基团、吡啶基二硫化物、硫代硝基苯甲酸或它们的衍生物。具体而言，接头可为以下形式：i)马来酰亚胺基或马来酰亚胺基衍生物-缬氨酸-瓜氨酸-对苯胺苯甲酸(paba)；或ii)乙酰胺基或乙酰胺基衍生物-缬氨酸-瓜氨酸-对苯胺苯甲酸(paba)，但本发明不限于此。

可以使用已知方法进行被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽与物质通过接头的结合，这些方法例如为烷基化、二硫化物交换或转硫酯化反应。这能够使缀合肽和物质通过被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽中半胱氨酸残基的巯基缀合。

在一个实施方案中，在马来酰亚胺基用于巯基-接头连接的情况下，半胱氨酸残基的巯基与马来酰亚胺基(meleimidegroup)的亲核反应性比蛋白质中存在的其他氨基酸官能团的亲核反应性高约1,000倍，因此这种马来酰亚胺基可用于特异性结合半胱氨酸，其中所述其他氨基酸官能团例如为赖氨酸残基的氨基或n端氨基。因此，可以看出，通过马来酰亚胺基或其衍生物或例如为溴代乙酰胺基或碘代乙酰胺基的乙酰胺基或其衍生物的用缀合肽修饰的物质与被光反应性官能团取代的fc位点特异性缀合肽通过半胱氨酸的硫醚键连接。

在另一方面，本发明涉及一种制造抗体缀合物的方法，包括：(a)将用缀合肽修饰的物质与含fc结构域的分子混合；(b)用光照射混合物以诱导光反应，然后制造抗体缀合物，在该抗体缀合物中，缀合肽修饰的物质的光反应性官能团和含fc结构域的分子共价连接；以及(c)获得制造的抗体缀合物。

在本发明中，光的范围可为320nm至380nm，优选为350nm至365nm，但本发明不限于此。

在本发明中，“含fc结构域的分子”包括(但不限于)通过fc位点特异性缀合肽特异性识别并且可以位于与fc位点特异性缀合肽相邻或者可以与fc位点特异性缀合肽结合的含fc结构域的分子。含fc结构域的分子包括含有fc结构域的蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、抗体或它们的片段、免疫球蛋白或它们的片段等。抗体和免疫球蛋白为约150kda的异四聚体糖蛋白，其包括两条相同的轻链和两条相同的重链。含fc结构域的片段可为用木瓜蛋白酶处理的抗体或免疫球蛋白的片段，其中已经去除轻链和重链。

在本发明中，含fc结构域的分子可为能够与靶标分子特异性结合的靶向天然抗体或非天然抗体。

在本发明中，抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体这两者，以及某些重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。抗体可为受体特异性抗体或配体特异性抗体。在本发明中，抗体还可为不阻止配体结合但阻止受体激活的受体特异性抗体。此外，抗体可为治疗性抗体、可以结合单独的治疗剂或诊断剂的抗体、不具有治疗效果的用于靶向的抗体或仅能够进行抗原-抗体反应的抗体。

在本发明中，抗体缀合物为集中于通过充分利用抗体的优点(例如，特异性、在循环中无毒性和药物动力学)而特别仅靶向特异性组织(例如，癌细胞)的药物的技术。因此，抗体缀合物也称为免疫缀合物，并且用于“靶向化疗剂”的抗癌药物落入该范围。免疫缀合物由三种成分组成，包括药物、单克隆抗体和连接抗体和药物的接头。特别地，为了抗癌的目的，免疫缀合物技术为通过使用与在癌细胞的表面上表达的特异性抗原特异性结合的抗体，从而将具有生理活性的物质递送至肿瘤细胞的方法。

在本发明的一个实施方案中，将内酰胺酶(β-内酰胺酶(tem-1))、β-内酰胺酶酶原(韩国专利登记no.1016956840000(2017.01.06))和假单胞菌外毒素a(pe24)用作物质化合物。

在本发明中，“β-内酰胺酶”(氨基酸序列为seqidno:3)自身不具有细胞毒性，但是进行切割具有β-内酰胺环的前体药物以将其作为药物激活的机制，因此，当与适当的前体药物共同处理时，β-内酰胺酶可以用作治疗肿瘤的有效药物。在本发明中，可以使用称为gc-mel的无活性前体药物，并且通过β-内酰胺酶切割gc-mel的β-内酰胺环，将β-内酰胺酶转化为左旋溶肉瘤素形式并烷基化以成为胞内dna，从而抑制细胞增殖并引起细胞凋亡。

在本发明中，“β-内酰胺酶酶原”(氨基酸序列为seqidno:5)以非活性状态表达，其中β-内酰胺酶抑制剂蛋白(blip)与β-内酰胺酶融合并一起表达。然而，例如，将在癌细胞中过量表达的基质金属蛋白酶-2(mmp-2)切割位点引入到连接两个蛋白质的接头中，因此在癌细胞附近将blip切割并去除，因此β-内酰胺酶展现出活性；mmp-2在癌细胞中过表达。

在本发明中，“pe24”(氨基酸序列为seqidno:7)通过参与胞内蛋白质合成的adp-核糖基化作用使延伸因子-2(ef-2)灭活，从而引起细胞凋亡(美国专利登记no.09388222(2016.07.12))。

在本发明中，含fc结构域的分子可以选自由免疫球蛋白衍生的结构域、它们的组合以及它们的fc区组成的组。优选地，含fc结构域的分子可选自由igg、iga、igd、ige、igm、它们的组合以及它们的fc区组成的组，更优选地，含fc结构域的分子可为igg1或它的fc区，但本发明不限于此。

根据本发明，在获得制造的抗体缀合物(上述方法(c))中，由于fc缀合肽与抗体的重链的fc结构域结合，因此当融合蛋白和抗体之间发生光反应时，可以获得总共三种产物(未结合的抗体、fc缀合肽修饰的物质与抗体连接的形式以及fc缀合肽修饰的两种物质与抗体连接的形式)。为了用作治疗性药物，必须获得具有明确结构的产物，因此，必须从这三种反应产物中分离出一种形式。其中用fc缀合肽修饰的物质与抗体连接的抗体缀合物具有一个新生fc受体(fcrn)的结合位点，并且与其中两种物质与抗体连接的形式掩蔽所有两个fcrn结合位点相比，可以在循环中具有更长的半衰期。

在物质和抗体浓度、两种反应物的比例、反应温度、uv照射时间等得到优化的反应条件下，可以防止未缀合抗体的存在。

通过利用蛋白质a和抗体的fc结构域之间的结合亲和力，可以将fc缀合肽修饰的物质与抗体连接的抗体缀合物以及fc缀合肽修饰的两种物质与抗体连接的抗体缀合物彼此分离。蛋白质a对抗体的fc结构域的ch2-ch3结构域界面具有特异性亲和力，因此用作用于抗体表达后的纯化的亲和色谱法的树脂。因此，fc缀合肽修饰的两种物质与抗体连接的抗体缀合物不与蛋白质a树脂结合(w.l.delano等人,science,287(5456):1279-83,2000)。通过蛋白质a亲和色谱法可以除去两种物质与抗体连接的形式，然后对所得产物进一步进行阴离子色谱法，从而分离未缀合的抗体以及fc缀合肽修饰的物质与抗体连接的形式，这是由于它们的等电点的差异。

另一方面，本发明涉及一种抗体缀合物，其中抗体与缀合肽修饰的物质共价连接。

在本发明的另一实施方案中，为了确认igg1-fciii-pe24缀合物的活性，进行wst-8分析和mts分析。在wst-8和mts分析中，溶液中的四唑盐在培养基中通过线粒体琥珀酸脱氢酶转化为甲臜，这使得能够在特定吸光度下进行测定，因此可以通过吸光度测定来确认细胞活力。通过在特定范围内增加抗体缀合物的浓度来测定吸光度的变化。结果观察到，随着抗体和fc缀合肽修饰的物质连接的抗体缀合物的浓度增加，细胞活力降低。因此，确认了本发明的抗体缀合物可以用作治疗性药物。

在本发明中，作为市售的人类igg的实例，使用西妥昔单抗或曲妥珠单抗制备抗体缀合物，并纯化以确认它们的活性。曲妥珠单抗通过特异性作用于her2，抑制了egfr(egf,tgfα)或her4(nrg1)的激活(这取决于配体)，这与egfr或her4形成了异二聚体并阻止了下游信号。此外，西妥昔单抗抑制了egfr(egf,tgfα)的激活(这取决于配体)，并阻止了下游信号。

以下，将参考以下实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅用于说明性目的，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：fc位点特异性缀合肽的制造

为了选择能够进行有效光反应结合的对苯甲酰基苯丙氨酸的置换位置，对fc缀合肽变体进行基因合成(bioneer)，随后进行基因操作，使得肽能够以融合蛋白的形式表达，其中在该fc缀合肽变体中，用琥珀密码子置换在seqidno:1的氨基酸序列中位置5、10或11处的dna核苷酸序列。表达所得肽，使得对苯甲酰基苯丙氨酸在fc结合肽变体的琥珀密码子位置处插入，然后进行纯化。为了观察光反应效率随置换位置的变化，将人igg1和如下各物质以1:3的比例混合，从而制备样品，然后在1xpbs缓冲液(ph7.4)中，使用uv手灯(lklab,u01-133-194)用365nm的紫外光照射样品2小时，其中所述各物质分别为fc结合肽变体修饰的物质，这些fc结合肽变体为：其中上述氨基酸序列的位置5处的dna核苷酸序列被琥珀密码子(氨基酸序列为seqidno:11，基因序列为seqidno:12)置换的fc结合肽变体；其中位置10处的dna核苷酸序列被琥珀密码子(氨基酸序列为seqidno:13，基因序列为seqidno:14)置换的fc结合肽变体；以及其中位置11处的dna核苷酸序列被琥珀密码子(氨基酸序列为seqidno:15，基因序列为seqidno:16)置换的fc结合肽变体。

结果确认，被这样的fc结合肽变体修饰的物质表现出了最高的与抗体结合的效率(参见图2)，其中在该fc结合肽变体中，作为第10个氨基酸的缬氨酸被对苯甲酰基苯丙氨酸置换。因此，其中缬氨酸(第10个氨基酸)的位置被对苯甲酰基苯丙氨酸置换的样品展现出最高的光反应效率，并且将该变体命名为“fc位点特异性缀合肽”。

为了构建表达fc位点特异性缀合肽的质粒，在2.1neb缓冲液中用nhei切割其中第10个氨基酸被琥珀密码子置换的肽基因，然后在3.1neb缓冲液中用bamhi切割。缓冲液由ddw、10xneb缓冲液3.1、dna和限制性内切酶组成，并且总体积为50μl，且处理条件如下：37℃，4小时。用与上述相同的限制性内切酶切割的pet21-a载体具有两个粘性末端，并且将该经过切割的pet21-a载体和质粒基因以1:3的摩尔比混合至总体积为10μl，随后使用t4dna连接酶(neb，英国)在室温进行2小时的连接。

将连接的dna混合溶液与50μl的作为感受态细胞的大肠杆菌dh10b(thermoscientific，c640003)混合，从而进行电穿孔(bio-rad，美国)。随后，将混合物铺在含氨苄青霉素的lb琼脂培养基上，并在37℃培养12小时至14小时，以获得转化的菌株，随后进行dna制备(geneall，迷你制备试剂盒)，从而获得fc位点特异性缀合肽表达质粒-1。

此外，按照上述相同的步骤，使用ndei和ncoi将其中第10个氨基酸被琥珀密码子置换的相同肽基因克隆到pet22-b中，并将所得质粒命名为质粒-2。

实施例2：缀合肽修饰的物质的制备

实施例2-1：fciii-β-内酰胺酶克隆

作为模板，使用表1所示的引物，通过聚合酶链反应(pcr)扩增包含由seqidno:4表示的β-内酰胺酶的完整序列的质粒(pspel104)，然后用限制性内切酶bamhi和noti切割并与fc位点特异性缀合肽表达质粒-1连接。

pcr经过变性、退火和扩增三个阶段，并且方法如下。pcr的反应液组合物包括ddw、10xpfu缓冲液、0.2mmdntp、20pmol引物f/r、模板、5单位pfu聚合酶，并且最终反应体积为50μl。使用表1的bamhi-tem1-f和tem1-noti-r在95℃反应2分钟之后，使反应产物进行25个pcr的循环，其中一个循环的条件如下：95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟。在反应完成后，72℃进行10分钟的处理。

表1示出了本发明中使用的pcr引物。

[表1]

通过在3.1neb缓冲液中用两种限制性内切酶处理从而进行切割。缓冲液由ddw、10xneb缓冲液3.1、dna和限制性内切酶组成，并且总体积为50μl，且处理条件如下：37℃4小时。将用与上述相同的限制酶切割以具有两个粘性末端的fc位点特异性缀合肽表达质粒-1和β-内酰胺酶以1:3的摩尔比混合至总体积为10μl，随后使用t4dna连接酶(neb)在25℃连接2小时。

将连接的dna混合溶液与50μl的作为感受态细胞的大肠杆菌dh10b(thermoscientific，c640003)混合，以进行电穿孔(bio-rad，美国)。随后，将混合物铺在含氨苄青霉素的lb琼脂培养基上，在37℃培养12小时至14小时，以获得转化的菌株，随后进行dna制备(geneall，迷你制备试剂盒)，从而获得fciii-β-内酰胺酶(氨基酸序列为seqidno:17，基因序列为seqidno:18)-表达质粒(参见图3)。

实施例2-2：fciii-β-内酰胺酶酶原克隆

作为模板，在与上述相同的条件下，使用表1的引物通过pcr扩增包含由seqidno:6表示的β-内酰胺酶酶原序列(1353bp)的质粒(pspel166)，然后用限制性内切酶ncoi和noti切割，随后以与上述相同的方式与fc位点特异性缀合肽表达质粒-2连接。

将连接的dna混合溶液加入到50μl的大肠杆菌dh10b(thermoscientific，c640003)中并混合，以进行电穿孔(bio-rad，美国)。随后，将混合物铺在含氨苄青霉素的lb琼脂培养基上，并且在37℃培养12小时至14小时，以获得转化的菌株，随后进行dna制备(geneall，迷你制备试剂盒)，从而获得fciii-β-内酰胺酶酶原(氨基酸序列为seqidno:19，基因序列为seqidno:20)-表达质粒(参见图4)。

实施例2-3：fciii-pe24克隆

通过基因合成(bioneer)获得由seqidno:8表示的去免疫的pe24，然后使用与上述相同的方法用限制性内切酶bamhi和noti切割，随后与fc位点特异性缀合肽表达质粒-1连接。

将连接的dna混合溶液加入到50μl的大肠杆菌dh10b(thermoscientific，c640003)中并混合，以进行电穿孔(bio-rad，美国)。随后，将混合物铺在含氨苄青霉素的lb琼脂培养基上，并且在37℃培养12小时至14小时，以获得转化的菌株，随后进行dna制备(geneall，迷你制备试剂盒)，从而获得fciii-pe24融合蛋白(氨基酸序列为seqidno:21，基因序列为seqidno:22)-表达质粒(参见图5)。

实施例2-4：正交tag密码子识别trna和trna合成酶克隆

用sali和bglii切割由seqidno:10表示的对苯甲酰基苯丙氨酸trna合成酶(氨基酸序列为seqidno:9)，然后使用pevol质粒作为载体进行连接，其中pevol质粒包含识别tag密码子的trna序列(jasonw.chin等人,pnasvol.99,11020-11024,2002)(参见图6a)。

将连接的dna混合溶液加入到50μl的大肠杆菌dh10b(thermoscientific，c640003)中并混合，以进行电穿孔(bio-rad，美国)。随后，将混合物铺在含氯霉素的lb琼脂培养基上，并且在37℃培养12小时至14小时，以获得转化的菌株，随后进行dna制备(geneall，迷你制备试剂盒)，从而获得表达trna合成酶的质粒(基因序列为seqidno:23)，该trna合成酶通过识别tag密码子来插入对苯甲酰基苯丙氨酸。

在本发明中，使用包含脯氨酸trna合成酶序列的pbbs2k质粒(byeongsunglee等人，biochimicabiophysicaacta,s0304-4165,2017)(参见图6b)。

实施例3：缀合肽修饰的物质的表达和纯化

实施例3-1：fciii-β-内酰胺酶的表达和纯化

为了表达fciii-β-内酰胺酶，使表达fciii-β-内酰胺酶的质粒、包含一对tag密码子识别trna和对苯甲酰基苯丙氨酸trna合成酶的质粒、以及包含脯氨酸trna合成酶的质粒经过电穿孔进入到大肠杆菌bl21(de3)(sigmaaldrich,cmc0016)中，然后将所得混合物铺在含有氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的lb平板上，从而获得转化的菌株。

将获得的单菌落作为种子在37℃和180rpm进行种子培养12小时，并以10:1的比例再次接种到培养基中，随后在37℃和180rpm温育6小时。将200ml的2xyt(包含氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素)以100:1的比例接种到培养液中，然后在37℃和180rpm温育，并且当600nm处的吸光度达到0.5时，添加阿拉伯糖至终浓度为0.2％，并向其中添加无水四环素(atc)至20nm。当吸光度达到1.0时，添加终浓度为1mm的对苯甲酰基苯丙氨酸和1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，然后在37℃和180rpm温育超过12小时。

为了纯化表达的fciii-β-内酰胺酶，在4℃和9300g离心15分钟。随后，除去上清液，然后在5ml的裂解缓冲液(0.75m蔗糖，0.1tris，ph8.0)中再次悬浮，添加0.05g/ml的溶菌酶和10ml的1mmedta，并在4℃旋转20分钟。然后，向其中添加1ml的0.5mmgcl2，接着在4℃旋转10分钟，并且在4℃和9300g离心15分钟，并分离上清液。

此后，为了纯化组氨酸标记的蛋白质，将1ml的50％ni-nta超流树脂(clonetech，美国)浆液添加到20ml的上清液中，并且在4℃旋转1小时的同时，使fciii-β-内酰胺酶与树脂结合。在将反应溶液加载到空柱上之后，通过加载30ml的洗涤缓冲液(50mmnapo3、300mmnacl、40mm咪唑)进行洗涤，并且加载5ml的洗脱缓冲液(50mmnapo3、300mmnacl、300mm咪唑)以洗脱6xhis-标签的fciii-β-内酰胺酶。

实施例3-2：fciii-β-内酰胺酶酶原的表达和纯化

为了表达fciii-β-内酰胺酶酶原，使表达fciii-β-内酰胺酶酶原的质粒、包含一对tag密码子识别trn和对苯甲酰基苯丙氨酸trna合成酶的质粒、以及包含脯氨酸trna合成酶的质粒经过电穿孔进入到大肠杆菌bl21(de3)(sigmaaldrich，cmc0016)中，然后以与表达fciii-β-内酰胺酶相同的方式进行培养，从而表达fciii-β-内酰胺酶酶原。

随后，在与fciii-β-内酰胺酶的纯化相同的条件下进行纯化，以洗脱6xhis-标签的fciii-β-内酰胺酶酶原。

实施例3-3：fciii-pe24的表达和纯化

为了表达fciii-pe24，使表达fciii-pe24的质粒、包含一对tag密码子识别trna和对苯甲酰基苯丙氨酸trna合成酶的质粒、以及包含脯氨酸trna合成酶的质粒经过电穿孔进入到大肠杆菌bl21(de3)(sigmaaldrich，cmc0016)中，然后以与表达fciii-β-内酰胺酶相同的方式进行培养，从而表达fciii-pe24。

随后，在与fciii-β-内酰胺酶的纯化相同的条件下进行纯化，以洗脱6xhis-标签的fciii-pe24。

实施例4：西妥昔单抗与缀合肽修饰的物质的结合以及缀合物的分离和活性

实施例4-1：西妥昔单抗与缀合肽修饰的物质结合的确认

为了确认抗体和根据实施例3获得的各缀合肽修饰的物质(fciii-β-内酰胺酶、fciii-β-内酰胺酶酶原和fciii-pe24)的结合，将西妥昔单抗和各缀合肽修饰的物质以1:5的比例混合，并在ph7.4的1xpbs缓冲液中，使用uv手灯(lklab,u01-133-194)用365nm的紫外光照射2小时。结果，确认了西妥昔单抗与各缀合肽修饰的物质(fciii-β-内酰胺酶、fciii-β-内酰胺酶酶原和fciii-pe24)结合(参见图7)。

为了确认各缀合肽修饰的物质是否与抗体的ch2-ch3结构域界面准确地位点特异性地结合，以固定浓度比混合10μm人类igg1和30μmfciii-β-内酰胺酶，并且用z-结构域处理混合物，同时将z-结构域的浓度以5μm的间隔从10μm增加至35μm，并在使用uv手灯用365nm的紫外光照射2小时的同时进行光反应。z-结构域与和fciii肽的ch2-ch3结构域界面相同的ch2-ch3结构域界面结合。

结果确认，当用浓度为35μm的z-结构域处理后进行光反应时，形成的人igg1-fciii-β-内酰胺酶显著减少，其中z-结构域的浓度高于fciii-β-内酰胺酶的浓度。这间接表明了fciii融合蛋白与抗体的fc结构域位点特异性地结合(参见图8)。

此外，为了确认抗体和缀合肽修饰的物质的缀合位置，使用lc-ms/ms进行分析。使西妥昔单抗-fciii-β-内酰胺酶缀合物进行胰蛋白酶/谷氨酰内肽酶混合物消化并分析。结果，由于在fciii的位置val10处插入的pbpa的官能团和抗体的met252的官能团之间形成共价键，因此确认了位点特异性地产生的缀合物片段的峰(参见图9)。

实施例4-2：西妥昔单抗和缀合肽修饰物质结合的抗体-生物分子缀合物的分离

为了分离抗体-生物分子缀合物(其中被一种缀合肽修饰的物质与抗体结合)，将抗体与实施例4的缀合肽修饰的物质结合的抗体-生物分子缀合物与5ml的1xpbs(ph7.4)混合，然后向其中添加1ml的蛋白质a50％树脂浆液(captiva蛋白质a树脂，repligen)，然后在4℃旋转1.5小时。将反应溶液加载到空柱上，使树脂完全沉淀，并且通过加载30ml的1xpbs(ph7.4)进行洗涤。然后，加载5ml的洗脱缓冲液(ph3.00.1m甘氨酸)以获得产物，并且添加125μl的中和缓冲液(ph9.0tris)从而进行ph滴定。

结果确认，所得产物为未缀合抗体和抗体-生物分子缀合物的混合物，其中被一种缀合肽修饰的物质与抗体结合(参见图10)。

实施例4-3：西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的ef2核糖基化活性的确认

为了测定西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的adp-核糖基化活性，使用zhang和snyder的方法测定adp-核糖从生物素化的nad⁺到ef-2的转化。

pe24和西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物各自分别在20mmtris-hcl(ph7.4)、1mmedta和1mmdtt中稀释至1nm，并在50nm生物素化nad⁺的存在下，在37℃与小麦胚芽提取物一起温育1小时。随后，用加载5x十二烷基硫酸钠(sds)凝胶的缓冲液终止反应。在sds-12％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(hrp)缀合物通过蛋白质印迹检测生物素化ef-2。使用chemidocxrs系统分析蛋白质印迹图像。

结果确认，与pe24类似，西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物也通过adp-核糖基化使ef-2失活(参见图11)。

实施例4-4：西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的细胞生长抑制活性的确认

为了确认通过光反应制造的西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的活性，使用在细胞表面的过表达egfr的细胞系进行细胞活力测定，其中egfr为西妥昔单抗结合的特异性抗原。

将egfr细胞系a431(sigmaaldrich，85090402)在dmem培养基(10％fbs，链霉素)中培养，然后在96孔板上以2×10³个细胞/孔的密度进行种子培养。24小时后，用浓度为0nm、0.016nm、0.16nm、1.6nm和16nm的西妥昔单抗-fciii-pe24处理细胞，并在37℃和5％co2的条件下温育72小时。然后，用20μl/孔的mts溶液(promega,g3580)处理细胞，并且2小时后，测定在490nm处的吸光度。

结果确认，西妥昔单抗-fciii-pe24缀合物的处理浓度越高，吸光度越低，并且与作为阴性对照的用野生型西妥昔单抗和pe24处理的孔相比，在用缀合物处理的孔中，细胞活力显著降低(参见图12)。

实施例5：曲妥珠单抗和缀合肽修饰的物质的结合以及缀合物的分离和活性

实施例5-1：曲妥珠单抗和fciii-pe24结合的确认

为了确认抗体和根据实施例3获得的缀合肽修饰的物质(fciii-pe24)的结合，曲妥珠单抗和缀合肽修饰的pe24以1:5的比例混合，并在ph7.4的1xpbs缓冲液中，使用uv手灯(lklab,u01-133-194)用365nm的紫外光照射2小时。结果确认，曲妥珠单抗与缀合肽修饰的物质(fciii-pe24)结合(参见图13)。

实施例5-2：曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的分离

为了分离抗体-生物分子缀合物(其中被一种缀合肽修饰的物质与抗体结合)，将其中抗体与实施例4的缀合肽修饰的物质结合的抗体-生物分子缀合物与5ml的1xpbs(ph7.4)混合，然后向其中添加1ml的蛋白质a50％树脂浆液(captiva蛋白质a树脂，repligen)，然后在4℃旋转1.5小时。将反应溶液加载到空柱上，使树脂完全沉淀，并且通过加载30ml的1xpbs(ph7.4)进行洗涤。此后，加载5ml的洗脱缓冲液(ph3.0，0.1m甘氨酸)以获得产物，并且添加125μl的中和缓冲液(ph9.0tris)从而进行ph滴定。

结果确认，所得产物为未缀合抗体和抗体-生物分子缀合物的混合物，其中在该抗体-生物分子缀合物中，被一种缀合肽修饰的物质与抗体结合(参见图13)。将所得产物与20mm磷酸盐缓冲液(ph7.9)混合，随后进行连续阴离子色谱法(mono-q柱，gehealthcarelifescience，美国)，从而将未结合的抗体与被一种缀合肽修饰的物质与抗体结合的形式分离(参见图13)。

实施例5-3：曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的细胞生长抑制活性的确认

为了确认通过光反应制造的曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的活性，使用过表达her2的细胞(her2为曲妥珠单抗结合的特异性抗原)系以及不表达her2的细胞系进行细胞活力测定。

将her2过表达细胞系bt-474(韩国细胞系库，60062)、hcc-1954(韩国细胞系库，9s1954)和mda-mb-453(韩国细胞系库，30131)以及her2非表达细胞系mda-mb-231(韩国细胞系库，30026)在rpmi培养基(10％fbs，链霉素)中培养，然后在96孔板上以3×10³个细胞/孔至5×10³个细胞/孔的密度进行种子培养。24小时后，用浓度为0nm、0.0064nm、0.032nm、0.16nm、0.8nm、4nm和20nm的曲妥珠单抗-fciii-pe24处理细胞系，并在37℃和5％co2的条件下温育72小时。此后，用10μl/孔的wst-8溶液(dojindo，ck04-11)处理细胞系，并且2小时后，测定450nm处的吸光度。

结果确认，用于处理过表达her2的细胞的曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的浓度越高，吸光度越低，并且与作为阴性对照的用野生型曲妥珠单抗和pe24处理的孔相比，用缀合物处理的孔中细胞活力显著降低。相比之下，确认了曲妥珠单抗-fciii-pe24缀合物的细胞毒性在相应的浓度范围内不作用于her2非表达细胞(参见图14)。

[工业适用性]

根据本发明，通过制备fc位点特异性缀合肽修饰的物质，然后通过光反应使抗体与该物质缀合，该物质可以通过简单的光反应高效地与抗体位点特异性地连接，其中在该fc位点特异性缀合肽中，特定位置被光反应性官能团置换。因此，该物质可用于制造其中各种类型的物质和抗体连接的抗体缀合物，并且可以加速它们的商业化。

尽管已经详细描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些详细描述仅为示例性实施方案，而不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应由所附权利要求以及所附权利要求的等价物来限定。

序列表文本

附加电子文件。

序列表

<110>亚洲大学校产学协力团

<120>抗体和生理活性物质的缀合方法

<130>pp-b2114

<150>kr10-2017-0161452

<151>2017-11-29

<150>kr10-2018-0146289

<151>2018-11-23

<160>29

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>fciii

<400>1

aspcysalatrphisleuglygluleuvaltrpcysthr

1510

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>fciii

<400>2

gattgtgcatggcatttaggtgaattagtgtggtgtaca39

<210>3

<211>241

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>β-内酰胺酶

<400>3

gluthrleuvallysvallysaspalagluaspglnleuglyalaarg

151015

valglytyrilegluleuaspleuasnserglylysileleugluser

202530

pheargproglugluargpheprometmetserthrphelysvalleu

354045

leucysglyalavalleuserargileaspalaglyglngluglnleu

505560

glyargargilehistyrserglnasnaspleuvalglutyrserpro

65707580

valthrglulyshisleuthraspglymetthrvalarggluleucys

859095

seralaalailethrmetseraspasnthralaalaasnleuleuleu

100105110

thrthrileglyglyprolysgluleuthralapheleuhisasnmet

115120125

glyasphisvalthrargleuaspargtrpgluprogluleuasnglu

130135140

alaileproasnaspgluargaspthrthrmetproalaalametala

145150155160

thrthrleuarglysleuleuthrglygluleuleuthrleualaser

165170175

argglnglnleuileasptrpmetglualaasplysvalalaglypro

180185190

leuleuargseralaleuproalaglytrppheilealaasplysser

195200205

glyalaglygluargglyserargglyileilealaalaleuglypro

210215220

aspglylysproserargilevalvaliletyrthrthrglysergln

225230235240

ala

<210>4

<211>723

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>β-内酰胺酶

<400>4

gaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatc60

gaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttcca120

atgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccggg180

caagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcacca240

gtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccata300

accatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggag360

ctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccg420

gagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggca480

acaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaatta540

atagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggct600

ggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgca660

gcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcag720

gca723

<210>5

<211>452

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>β-内酰胺酶酶原

<400>5

glyglyalaglyvalmetthrglyalalysphethrglnileglnphe

151015

glymetthrargglnglnvalleuaspilealaglyalagluasncys

202530

gluthrglyglyserpheglyaspserilehiscysargglyhisala

354045

alaglyasptyrtyralatyralathrpheglyphethrseralaala

505560

alaaspalalysvalaspserlysserglnglulysleuleualapro

65707580

seralaprothrleuthrleualalyspheasnglnvalthrvalgly

859095

metthrargalaglnvalleualathrvalglyglnglysercysthr

100105110

thrtrpserglutyrtyrproalatyrproserthralaglyvalthr

115120125

leuserleusercyspheaspvalaspglytyrserserthrglyala

130135140

tyrargglyseralahisleutrpphethraspglyvalleuglngly

145150155160

lysargglntrpaspleuvalglyserglyglyglyserglyproleu

165170175

glyvalargglyglyglyserlysleumetaspgluargasnarggln

180185190

ilealagluileglyalaserleuilelyshistrpglyglyglygly

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glyhisprogluthrleuvallysvallysaspalagluaspglnleu

210215220

glyalaargvalglytyrilegluleuaspleuasnserglylysile

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leugluserpheargproglugluargpheprometmetserthrphe

245250255

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gluglnleuglyargargilehistyrserglnasnaspleuvalglu

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leuleuleuthrthrileglyglyprolysgluleuthralapheleu

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leuasnglualaileproasnaspgluargaspthrthrthrproval

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alaglyproleuleuargseralaleuproalaglytrppheileala

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glyserglnala

450

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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151015

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859095

leualatyrglytyralaglnaspglngluproaspalaalaglyarg

100105110

ileargasnglyalaleuleuargvaltyrvalproalaserserleu

115120125

proglyphetyrargthrserleuthrleualaalaproglualaala

130135140

glygluvalgluargleuileglyhisproleuproleualaleuasp

145150155160

alailethrglyprogluglugluglyglyargleugluthrileleu

165170175

glytrpproleualagluargthrvalvalileproseralailepro

180185190

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195200205

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glylysproproarggluaspleulys

225230

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<212>dna

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<212>prt

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151015

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354045

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505560

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gluilearglysileglyasptyrasnlyslysvalpheglualamet

859095

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100105110

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115120125

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130135140

lysvalalagluvaliletyrproilemetglnvalasnthrserhis

145150155160

tyrleuglyvalaspvalalavalglyglymetgluglnarglysile

165170175

hismetleualaarggluleuleuprolyslysvalvalcysilehis

180185190

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195200205

lysglyasnpheilealavalaspaspserproglugluileargala

210215220

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225230235240

ilemetgluilealalystyrpheleuglutyrproleuthrilelys

245250255

argproglulyspheglyglyaspleuthrvalasnsertyrgluglu

260265270

leugluserleuphelysasnlysgluleuhisprometargleulys

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argleu

305

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<213>人工序列（artificialsequence）

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<211>13

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1510

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<220>

<223>v10琥珀fciii

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<211>13

<212>prt

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<220>

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1510

<210>16

<211>39

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>w11琥珀fciii

<400>16

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

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202530

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glytyrilegluleuaspleuasnserglylysileleugluserphe

505560

argproglugluargpheprometmetserthrphelysvalleuleu

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argargilehistyrserglnasnaspleuvalglutyrserproval

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

thrleuarglysleuleuthrglygluleuleuthrleualaserarg

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210215220

leuargseralaleuproalaglytrppheilealaasplyssergly

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<210>18

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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leuthraspglymetthrvalarggluleucysseralaalailethr

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metseraspasnthralaalaasnleuleuleuthrthrileglygly

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prolysgluleuthralapheleuhisasnmetglyasphisvalthr

165170175

argleuaspargtrpgluprogluleuasnglualaileproasnasp

180185190

gluargaspthrthrthrprovalalametalathrthrleuarglys

195200205

leuleuthrglygluleuleuthrleualaserargglnglnleuile

210215220

asptrpmetglualaasplysvalalaglyproleuleuargserala

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leuproalaglytrppheilealaasplysserglyalaglygluarg

245250255

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argilevalvaliletyrthrthrglyserglnalaglyserglygly

275280285

glyserglyproleuglyvalargglyglyglyserlysleualagly

290295300

valmetthrglyalalysphethrglnileglnpheglymetthrarg

305310315320

glnglnvalleuaspilealaglyalagluasncysgluthrglygly

325330335

serpheglyaspserilehiscysargglyhisalaalaglyasptyr

340345350

tyralatyralathrpheglyphethrseralaalaalaaspalalys

355360365

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glnvalleualathrvalglyglnglysercysthrthrtrpserglu

405410415

tyrtyrproalatyrproserthralaglyvalthrleuserleuser

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cyspheaspvalaspglytyrserserthrglyphetyrargglyser

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alahisleutrpphethraspglyvalleuglnglylysargglntrp

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gcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccgg660

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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<400>21

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151015

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202530

argglytrpgluglnleuglyglyserprothrglyalaglupheleu

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glyaspglyglyaspvalserpheserthrargglythrglnasntrp

505560

thrvalgluargleuleuglnalahisalaglnleuglugluarggly

65707580

tyrvalphevalglytyrhisglythrpheleuglualaalaglnser

859095

ilevalpheglyglyvalalaalaargserglnaspleualaalaile

100105110

trpalaglyphetyrilealaglyaspproalaleualatyrglytyr

115120125

alaglnaspglngluproaspalaalaglyargileargasnglyala

130135140

leuleuargvaltyrvalproalaserserleuproglyphetyrarg

145150155160

thrserleuthrleualaalaproglualaalaglygluvalgluarg

165170175

leuileglyhisproleuproleualaleuaspalailethrglypro

180185190

gluglugluglyglyargleugluthrileleuglytrpproleuala

195200205

gluargthrvalvalileproseralaileprothraspproargasn

210215220

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gluaspleulys

260

<210>22

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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ctgcccggtttttataggacgagtctgacacttgcagcaccagaagcagcaggcgaagtt660

gaacgcttaattggtcatccgctgcctctcgcactggacgcaatcactggtccggaagaa720

gaaggtggtcggctggaaacgatactaggatggccgttagctgagcgtaccgtggtaatt780

ccatccgccataccaaccgatccacgtaacgtaggtggtgatttagacccgagcagtatt840

cccgataaagaacaggcaatctcagcattgccggactacgcttcacaacctggtaaacct900

cctcgtgaagatctgaagtaagcggccgc929

<210>23

<211>77

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>trnacua

<400>23

cccgccuuaguucagcagggcagaacggcggacucuaaauccgcauggcacggguucaaa60

ucccguaggcgggacca77

<210>24

<211>49

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>bamhi--f引物

<400>24

aaccttggatccggcggtggcagcgaaacgctggtgaaagtaaaagatg49

<210>25

<211>39

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>tem1-noti-r引物

<400>25

aaggttgcggccgctttattaccaatgcttaatcagtga39

<210>26

<211>34

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nde1-fciiiv10*-f引物

<400>26

aaccttcatatgaagaaaacagcaattgctattg34

<210>27

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>fciiiv10*-ncoi-r引物

<400>27

aaggttccatggtgtacaccactataattcacc33

<210>28

<211>40

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>ncoi-β-内酰胺酶酶原-f引物

<400>28

aaccttccatggggcggtatggacgagcgtaaccgtcaaa40

<210>29

<211>40

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>β-内酰胺酶酶原-noti-r引物

<400>29

aaggttgcggccgctttatacaaggtcccactgccgcttg40