泰兰他汀类似物的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请是根据37c.f.r.§153(b)(1)提交的非临时申请，其根据35u.s.c.§119(e)要求于2017年9月20日提交的临时申请第62/561,060号和于2018年6月19日提交的临时申请第62/686,781号的优先权，所述临时申请的内容通过引用整体并入本文。

本发明涉及新颖的细胞毒性化合物以及包含这些细胞毒性化合物和细胞结合剂的细胞毒性缀合物。更具体地说，本发明涉及新颖的泰兰他汀a(thailanstatina)类似物，其可用作抗体-药物缀合物(adc)中的细胞毒性小分子毒素。本发明还涉及包含这些细胞毒性化合物和adc的组合物，以及使用这些毒素和adc来治疗包括癌症在内的病理疾患的方法。

发明背景

药物与抗体直接地或经由接头缀合涉及多种因素的考虑，包括用于缀合药物的化学基团的特性和位置，药物释放机理，提供药物释放的结构元素以及对所释放游离药物的结构修饰。另外，如果药物要在抗体内化后释放，则药物释放机理必须与缀合物的细胞内运输相一致。

抗体-药物缀合物(adc，也称为免疫缀合物)作为抗癌剂已证实具有相当大的效用。在adc中，治疗剂(也称为细胞毒性药物或毒素)共价连接至抗体，所述抗体的抗原由癌细胞或其它增殖细胞表达(肿瘤相关抗原)。通过结合至抗原，抗体将adc递送到癌症部位。在此处，共价连接的裂解或抗体的降解导致治疗剂的释放。另一方面，尽管adc在血液系统中循环，但治疗剂由于与抗体连接而无活性。因此，adc中所用的治疗剂可由于其高度局部化释放而可以比普通化学治疗剂更有效。

尽管已尝试经由抗体递送多种不同的药物类别，但仅有少数药物类别已证实作为抗体-药物缀合物有效，同时具有合适的毒性概况。一种成功的药物类别包括fr901464的类似物，例如司利斯他汀c(spliceostatinc)和泰兰他汀a(thailanstatina)，它们是真核rna剪接的极强效抑制剂。这些化合物紧密结合至u2snrna亚复合物的sf3b亚基，所述亚复合物是剪接体的必需组分(puthenveetil,s.等,bioconjugatechem.,2016,27:1880-1888)。

美国专利第9,169,264号和第9,504,669号(都是subramanyam等)公开了可用作adc中的有效负载(payload)的基于司利斯他汀的化合物以及可与adc结合使用的有效负载-接头化合物。所述专利还公开了这些化合物在治疗包括癌症在内的病理疾患中的用途。

技术实现要素：

本发明涉及化合物和含有所述化合物的药物组合物，其制备，以及所述化合物的用途，主要是但不限于抗癌剂。

根据一个方面，本发明涉及一种或多种式(i)化合物：

其中：

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

x是-h或-ch3；

每个n独立地是1、2或3；并且

每个m独立地是0、1、2或3；

或其药学上可接受的盐。

根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(ii)化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

l是接头；

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

每个n独立地是1、2或3；并且

每个m独立地是0、1、2或3。

根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(iii)化合物：

t–l'–ab(iii)

或其药学上可接受的盐，其中：

l是接头部分；

t是式(i')的基团：

其中：

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

每个n独立地是1、2或3；

每个m独立地是0、1、2或3；并且

ab是抗体。

根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(i)或式(iii)的化合物和/或其一种或多种盐的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的所述化合物或盐和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。所述药物组合物可额外包含治疗有效量的本领域技术人员已知的另一种化学治疗剂。

根据另一方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的式(i)或式(iii)的化合物和/或其一种或多种盐，所述量可有效杀死肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖。

根据另一方面，本发明涉及制备式(iii)化合物的方法，所述方法包括使抗体与式(ii)化合物反应。

根据另一方面，本发明涉及用于治疗癌症的药盒，所述药盒包括本发明的药物组合物和使用说明书。

通过阅读以下说明书和权利要求书，本发明的其它目的对于本领域技术人员来说可以是显而易见的。

附图说明

图1显示在用各种剂量的化合物10、化合物11、或仅媒介物治疗之后，雌性balb/c裸小鼠中nci-n87源肿瘤的平均值+/-sem(平均值的标准误差)肿瘤体积测量结果。黑色箭头指示小鼠被注射测试物品的天数。

具体实施方式

本申请不限于所描述的特定方法或具体组合物，因此这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制，因为本申请的范围将仅由所附权利要求及其等同物限制。

本发明涉及可用作抗体-药物缀合物(adc)中的细胞毒性小分子的新颖泰兰他汀类似物化合物，以及可与adc结合使用的毒素-接头化合物，或者称为药物-接头化合物。本发明还涉及包含这些细胞毒性化合物和adc的组合物，以及使用这些毒素和adc来治疗包括癌症在内的病理疾患的方法。

定义和缩写

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本申请的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

如本文所用的术语“抗体”(或“ab”或“ab”)包括免疫球蛋白(ig)分子。在某些实施方案中，抗体是包含四条多肽链的全长抗体，即通过二硫键相互连接的两条重链(hc)和两条轻链(lc)。每条重链包含重链可变区(hcvr或vh)和重链恒定区(ch)。重链恒定区包含三个结构域，即ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(lcvr或vl)和轻链恒定区，其包含一个结构域cl。vh和vl区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(cdr)。散布在这些区域中的是保守性更高的框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。

本文中的术语“抗体”是以最广泛意义使用并且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现期望的生物学活性即可(miller等,j.immunology,2003,170:4854-4861)。抗体可以是鼠类、人类、人源化、嵌合抗体，或源自其它物种。抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并结合至特定抗原(janeway,c.等,immunobiology，第5版，2001,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有众多由多种抗体上的cdr识别的结合位点，所述结合位点也称为表位。特异性结合至不同表位的每个抗体具有不同结构。因此，一种抗原可具有一种以上的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合所关注靶标的抗原或其一部分的抗原结合位点的分子，所述靶标包括(但不限于)癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd和iga)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类别的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可源自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白具有人类、鼠类或兔起源。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双功能抗体；线性抗体；微型抗体(olafsen等,proteineng.designsel.,2004,17(4):315-323)，fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗id)抗体，cdr(互补决定区)，和本文所述的任何免疫特异性地结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位结合片段，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

在某些实施方案中，抗体是igg、iga、ige、igd或igm。在某些实施方案中，抗体是igg1、igg2、igg3或igg4；或iga1或iga2。

在某些实施方案中，细胞结合剂是单克隆抗体的“抗原结合部分”，其共有对于抗原与抗体结合关键的序列(例如美国专利第7,342,110号和第7,557,189号中所述的humy9-6或其相关抗体，所述专利通过引用并入本文)。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或有时在本文中可互换地称为“抗体片段”)包括保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的某些片段来实施。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(但不限于)：(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段(例如，抗体由木瓜蛋白酶消化产生三个片段：两个抗原结合fab片段，和一个不结合抗原的fc片段)；(ii)f(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段(例如，抗体由胃蛋白酶消化产生两个片段：二价抗原结合f(ab')2片段，和不结合抗原的pfc'片段)及其相关f(ab')单价单元；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段(即包括于fab中的重链的所述部分)；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，和相关二硫键连接的fv；(v)dab(结构域抗体)或sdab(单一结构域抗体)片段，其由vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(cdr)。在某些实施方案中，抗原结合部分是sdab(单一结构域抗体)。

在某些实施方案中，抗原结合部分还包括某些工程改造或重组衍生物(或“衍生抗体”)，所述衍生物除天然存在抗体中可能未发现的元件或序列以外，还包括保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。

例如，尽管fv片段的两个结构域vl和vh是通过单独基因编码，但它们可使用标准重组方法通过合成接头接合，所述合成接头使其能够作为vl和vh区配对形成单价分子的蛋白质单链(称为单链fv(scfv))制备。在本文所述的所有实施方案中，scfv的n末端可以是vh结构域(即n-vh-vl-c)，或vl结构域(即n-vl-vh-c)。

可通过连接两个scfv来工程改造二价(或双价)单链可变片段(di-scfv、bi-scfv)。这产生具有两个vh和两个vl区的单一肽链，从而产生串联scfv(tascfv)。更多串联重复序列(例如tri-scfv)可类似地通过以头-尾方式连接三个或更多个scfv来产生。

在某些实施方案中，scfv可通过对于使两个可变区折叠在一起来说过短(约五个氨基酸)的接头肽连接，从而迫使scfv二聚化并形成双功能抗体。双功能抗体可以是双特异性或单特异性的。已显示双功能抗体的解离常数较相应scfv低高达40倍，即对靶标具有显著更高的亲和力。

更短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体，或所谓的三功能抗体(triabody/tribody)。也已类似地产生四功能抗体。所述四功能抗体相比于双功能抗体展现更高的对其靶标的亲和力。双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体有时统称为“avibody^tm”细胞结合剂(或简言之“avibody”)。也就是说，具有两个、三个或四个靶标结合区(tbr)的avibody通常称为双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。关于细节，参见例如美国公开第2008/0152586号和第2012/0171115号，所述公开的全部教导通过引用并入本文。

所有这些形式可由对两种或更多种不同抗原具有特异性的可变片段构成，在这种情况下它们是双特异性或多特异性抗体类型。例如，某些双特异性串联di-scfv称为双特异性t细胞衔接蛋白(bite)。在某些实施方案中，串联scfv或双功能抗体/三功能抗体/四功能抗体中的每个scfv可具有相同或不同的结合特异性，并且各自可独立地具有n末端vh或n末端vl。

fcab是由抗体的fc恒定区工程改造的抗体片段。fcab可以表达为可溶性蛋白，或者可将它们工程改造回全长抗体(例如igg)以产生mab2。mab2是fcab代替正常fc区的全长抗体。利用这些额外结合位点，mab2双特异性单克隆抗体可同时结合两个不同靶标。

天然抗体是单特异性的，但是是二价的，因为它们表达两个相同的抗原结合结构域。相比之下，在某些实施方案中，某些经工程改造的抗体衍生物是具有两个或更多个不同抗原结合结构域的双特异性或多特异性分子，每个抗原结合结构域具有不同的靶标特异性。双特异性抗体可通过将两个抗体产生细胞融合来产生，每个细胞具有不同的特异性。这些“四源杂交瘤”产生多种分子物质，因为两条不同轻链和两条不同重链以多种构型在四源杂交瘤中自由重组。自此，已使用多种技术来产生双特异性fab、scfv和全尺寸mab(参见上文)。

双重可变结构域免疫球蛋白(dvd-ig)蛋白是一类双重特异性igg，其同时靶向两种抗原/表位。所述分子含有fc区和恒定区，其构型与常规igg类似。然而，dvd-ig蛋白的独特之处在于所述分子的每个臂含有两个可变结构域(vd)。臂内的vd串联连接并且可具有不同的结合特异性。

也可以通过例如表达具有两个不同fab和fc的双特异性抗体来产生三特异性抗体衍生物分子。一个实例是小鼠igg2a抗ep-cam、大鼠igg2b抗cd3四源杂交瘤，称为biuii，认为其允许表达ep-cam的肿瘤细胞、表达cd3的t细胞和表达fcδri的巨噬细胞的共定位，由此加强免疫细胞的共刺激和抗肿瘤功能。

probodies是完全重组的经掩蔽单克隆抗体，其在健康组织中保持惰性，但在疾病微环境中被特异性活化(例如，通过疾病微环境中富集或特有的蛋白酶进行蛋白酶裂解)。类似掩蔽技术可用于本文所述的任何抗体或其抗原结合部分。

胞内抗体是已被修饰以供细胞内定位的抗体，其用于在细胞内起作用以结合至细胞内抗原。胞内抗体可保留在细胞质中，或者可具有核定位信号，或者可具有用于er靶向的kdel序列。胞内抗体可以是单链抗体(scfv)，具有超稳定性的被修饰的免疫球蛋白vl结构域，对更具还原性的细胞内环境具有抗性的所选抗体，或与麦芽糖结合蛋白或其它稳定细胞内蛋白质一起表达为融合蛋白。这些优化已经改善胞内抗体的稳定性和结构，并且可普遍适用于本文所述的任何抗体或其抗原结合部分。

本发明的抗原结合部分或衍生抗体与衍生/工程改造出其的抗体相比，可具有基本上相同或一致的(1)轻链和/或重链cdr3区；(2)轻链和/或重链cdr1、cdr2和cdr3区；或(3)轻链和/或重链区。这些区域内的序列可含有保守氨基酸取代，包括cdr区内的取代。在某些实施方案中，存在不超过1、2、3、4或5个保守取代。在替代方案中，抗原结合部分或衍生抗体具有轻链区和/或重链区，所述轻链区和/或重链区与衍生/工程改造出其的抗体具有至少约90％、95％、99％或100％的同一性。与抗体相比，所述抗原结合部分或衍生抗体可具有基本上相同的对靶抗原的结合特异性和/或亲和力。在某些实施方案中，抗原结合部分或衍生抗体的kd和/或koff值是在本文所述抗体的10倍(更高或更低)、5倍(更高或更低)、3倍(更高或更低)或2倍(更高或更低)内。

在某些实施方案中，抗原结合部分或衍生抗体可由全人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体衍生/工程改造，并且可根据任何本领域公认的方法来产生。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，即除可少量存在的可能天然突变外，构成所述群体的个别抗体均相同。单克隆抗体具有高度特异性，其针对单一抗原位点。修饰语“单克隆”指示抗体的特征在于从基本上同源的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。

术语“单克隆抗体”具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与从特定物种衍生或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列一致或同源，同时所述链的其余部分与从另一物种衍生或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列以及这些抗体的片段一致或同源，只要它们展现所需的生物学活性即可。

非人类(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有极少的源自非人类免疫球蛋白的序列。在很大程度上，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被来自例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物等非人类物种(供体抗体)的高变区并具有所需特异性、亲和力和能力的残基代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可包含接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些高变环，并且全部或基本上全部的fr是人类免疫球蛋白序列的那些fr。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)(通常是人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。

“经半胱氨酸工程改造的抗体”是其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代的抗体。根据本公开，经半胱氨酸工程改造的抗体的一个或多个硫醇基团可缀合至式i的泰兰他汀类似物毒素或药物-接头式ii化合物以形成抗体-药物缀合物(adc)化合物。在特定实施方案中，被取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，从而将反应性硫醇基团定位在抗体的可及位点处并且可用于将抗体缀合至药物部分以产生adc，如本文进一步所述。例如，经半胱氨酸工程改造的抗体可以是其中非半胱氨酸天然残基单一突变为轻链中(例如，根据kabat编号的g64c、k149c或r142c)或重链中(例如，根据kabat编号的d101c或v184c或t205c)的半胱氨酸的抗体。在具体实例中，经半胱氨酸工程改造的抗体在重链或轻链中具有单一半胱氨酸突变，从而使得每个全长抗体(即具有两条重链和两条轻链的抗体)具有两个工程改造的半胱氨酸残基。经半胱氨酸工程改造的抗体和制备方法公开于以下文献中：美国公开申请第2012/0121615号、美国专利第7,521,541号；shen,b.等,nat.biotechnol.,2012,30(2):184-189；sukumaran等,pharm.res.,2015,32:1884-1893(通过引用整体并入本文)。

术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可降低癌细胞数量；降低肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减慢并优选终止)癌细胞浸润至外周器官中；抑制(即在一定程度上减慢并优选终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。就药物可抑制现有癌细胞的生长和/或杀死现有癌细胞而言，其可具有细胞生长抑制性和/或细胞毒性。对于癌症疗法，可以例如通过评价疾病进展时间(ttp)和/或测定反应率(rr)来测量功效。治疗有效量将根据化合物、所治疗疾病或病症的严重程度和所治疗患者的年龄、体重等有所变化。

术语“大量”是指大多数，即大于50％的群体、混合物或样品。

术语“细胞毒性活性”或“细胞毒性”是指adc或所述adc的细胞内代谢物的细胞杀死、细胞生长抑制或抗增殖效应。细胞毒性活性可表示为ic50值，该值是每个单位体积中一半细胞存活的浓度(摩尔浓度或质量浓度)。

“病症”是将受益于用药物或抗体-药物缀合物治疗的任何疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理疾患。本文有待治疗的病症的非限制性实例包括良性和恶性癌症；白血病和淋巴样恶性病，神经元病症、神经胶质病症、星状细胞病症、下丘脑和其它腺体病症、巨噬细胞病症、上皮病症、基质和囊胚腔病症；以及发炎病症、血管生成病症和免疫学病症。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失调为特征的生理疾患或病症。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。

术语“患者”是指哺乳动物，优选是人类。

除非由上下文另外指示，否则术语“治疗”是指治疗性治疗和预防复发的预防性措施，其中目的是抑制或减缓(减弱)不期望的生理学变化或病症(例如癌症的发展或扩散)。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括(但不限于)减轻症状，降低疾病程度，稳定疾病状态(即不恶化)，延迟或减慢疾病进展，改善或缓和疾病状态，以及可检测或不可检测地缓解病情(部分或全部)。“治疗”也可意指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗者包括已具有疾患或病症者以及易患所述疾患或病症者。

在癌症的上下文中，术语“治疗”包括以下任何或所有情形：抑制肿瘤细胞、癌细胞或肿瘤的生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制；减弱整体肿瘤负荷或降低癌细胞数量；以及改善一种或多种与疾病相关的症状。

在自身免疫疾病的上下文中，术语“治疗”包括以下任何或所有情形：抑制与自身免疫疾病状态相关的细胞的复制，所述细胞包括(但不限于)产生自身免疫抗体的细胞；减弱自身免疫抗体负荷；以及改善自身免疫疾病的一种或多种症状。

在感染性疾病的上下文中，术语“治疗”包括以下任何或所有情形：抑制引起感染性疾病的病原体的生长、增殖或复制以及改善感染性疾病的一种或多种症状。

除非另有指示，否则术语“烷基”本身或作为另一术语的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和烃(例如，“c1-c8”烷基是指具有1至8个碳原子的烷基)。在未指定碳原子数时，烷基具有1至8个碳原子，优选1至6个碳原子。术语“烷基”明确地意在包括具有任何饱和程度或水平的基团，即仅具有碳碳单键的基团，具有一个或多个碳碳双键的基团，具有一个或多个碳碳三键的基团以及具有碳碳单键、双键和三键的混合物的基团。在意指特定饱和水平时，使用表述“烷基”、“烯基”和“炔基”。代表性直链c1-c8烷基包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基；而支链c1-c8烷基包括(但不限于)-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和c2-c8烷基包括(但不限于)乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。

除非另有指示，否则“亚烷基”本身或作为另一术语的一部分是指如下饱和的支链或直链或环状烃基：其具有所述数目的碳原子，通常1-18个碳原子，并且具有通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上去除两个氢原子所衍生的两个单价基团中心。典型的亚烷基包括(但不限于)：亚甲基(-ch2-)、1,2-亚乙基(-ch2ch2-)、1,3-亚丙基(-ch2ch2ch2-)、1,4-亚丁基(-ch2ch2ch2ch2-)等。“c1-c10”直链亚烷基是式-(ch2)1-10-的直链饱和烃基。c1-c10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。在本发明的某些实施方案中，亚烷基具有1至9个、1至8个、1至7个和1至6个碳。

如本文所用的术语“化合物”是指泰兰他汀类似物，并且包括由本文公开的通式所涵盖的任何特定化合物。所述化合物可通过其化学结构和/或化学名称鉴别。当化学结构与化学名称相冲突时，则由化学结构决定化合物的身份。化合物可含有一个或多个手性中心和/或双键，因此可作为立体异构体存在，所述立体异构体例如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映异构体。因此，当手性中心处的立体化学未指定时，本文所绘示的化学结构涵盖那些手性中心处的所有可能构型，包括立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构和立体异构混合物。使用本领域技术人员所熟知的分离技术或手性合成技术，可将对映异构和立体异构混合物拆分成其组分对映异构体或立体异构体。化合物也可以若干互变异构形式存在，所述形式包括烯醇形式、酮形式及其混合物。因此，本文所绘示的化学结构涵盖所说明化合物的所有可能的互变异构形式。所述化合物还包括经同位素标记的化合物，其中一个或多个原子的原子质量不同于通常见于自然界中的原子质量。可并入至化合物中的同位素的实例包括(但不限于)²h、³h、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁷o和¹⁸o。化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式和作为n-氧化物。一般来说，水合、溶剂化和n-氧化物形式在本公开的范围内。某些化合物可以多种结晶或无定形形式存在。一般来说，所有物理形式对于本文所涵盖的用途来说都是等效的并意欲在本公开的范围内。此外，应理解，当说明化合物的部分结构时，括号指示所述部分结构与分子其余部分的连接点。

除非另有指示，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合意指除非另有说明，否则完全饱和或含有1至3个不饱和度的稳定的直链或支链烃或其组合，其由所述数目的碳原子和1至3个选自由o、n、si、s和/或p组成的组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。可将杂原子o、n和s置于杂烷基的任何内部位置处。可将杂原子si置于杂烷基的任何位置处，包括烷基连接至分子其余部分的位置处。至多两个杂原子可以是连续的。

“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

“卤基(c1-6烷基)”是指被1至3个或1至2个卤基取代的c1-6烷基，其中c1-6烷基和卤基如本文所定义。所述术语包括例如cf3。

术语“环氧”或“环氧基”或“环氧残基”是指包含由单键连接的两个碳原子和一个氧原子的3元环。因此，术语“环氧化物”是指包含至少一个如所定义的环氧基的化合物。

除非另有指示，否则“芳基”本身或作为另一术语的一部分意指6至20个碳原子、优选6至14个碳原子的被取代或未被取代的单价芳族烃基，其通过从母体芳族环系的单一碳原子除去一个氢原子而衍生。典型的芳基包括(但不限于)从以下衍生的基团：乙烯合蒽(aceanthrylene)、乙烯合萘(acenaphthylene)、乙烯合菲(acephenanthrylene)、蒽、甘菊环、苯、蔻、荧蒽、芴、并六苯(hexacene)、己芬(hexaphene)、并环己二烯(hexalene)、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、并八苯(octacene)、辛芬(octaphene)、并环辛二烯(octalene)、卵苯(ovalene)、戊-2,4-二烯、并五苯(pentacene)、并环戊二烯(pentalene)、戊芬(pentaphene)、二萘嵌苯(perylene)、非那烯(phenalene)、菲、二萘品苯(picene)、七曜烯(pleiadene)、芘、吡蒽(pyranthrene)、玉红省(rubicene)、苯并菲、联三萘等。优选地，芳基包含6至20个碳原子，更优选6至12个碳原子。被取代的芳族基团(例如芳基)可被一个或多个、优选1至5个以下基团取代：c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or、-c(o)nh2、-c(o)nhr'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、卤素、-nh(r')、-n(r')2和-cn；其中每个r'独立地选自-h、c1-c8烷基、c1-c8杂烷基和芳基。在一些实施方案中，被取代的芳族基团可进一步包括以下中的一个或多个：-nhc(＝nh)nh2、-nhconh2、-s(＝o)2r'和-sr'。

如本文所用的术语“杂芳基”是指5至14个成员(例如5至6个成员)的芳族杂环，其具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子并含有至少1个碳原子。杂芳基可以是单环、双环或三环环系。代表性的杂芳基是三唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基(pyrimidinyl)、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、嘧啶基(pyrimidyl)、氮杂卓基、氧杂卓基和喹喔啉基。杂芳基任选地被取代。典型的取代基包括(但不限于)-x、-r、-o-、-or、-sr、-s-、-nr2、-nr3、＝nr、-cx3、-cn、-ocn、-nrc(＝o)r、-c(＝o)nr2、-so3h、-s(＝o)2r、-os(＝o)2or、-s(＝o)2nr、-s(＝o)r、-op(＝o)(or)2、-p(＝o)(or)2、po3h2、-c(＝o)r、-c(＝o)x、-c(＝s)r、-co2r、-co2-、-c(＝s)or、-c(＝o)sr、-c(＝s)sr、-c(＝o)nr2、-c(＝s)nr2、-c(＝nr)nr2、c1-c20杂烷基、c6-c20芳基、c3-c8杂环基、保护基团或前药部分，其中每个x独立地是卤素：-f、-cl、-br或-i；并且每个r独立地是-h或c1-c6烷基。

术语“羟基”是指基团-oh。

术语“被取代的烷基”意指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基代替的烷基。典型的取代基包括(但不限于)-x、-r、-o-、-or、-sr、-s-、-nr2、-nr3、＝nr、-cx3、-cn、-ocn、＝n2、-nrc(＝o)r、-c(＝o)nr2、-so3-、-so3h、-s(＝o)2r、-os(＝o)2or、-s(＝o)2nr、-s(＝o)r、-op(＝o)(or)2、-p(＝o)(or)2、-po3^2-、po3h2、-aso2h2、-c(＝o)r、-c(＝o)x、-c(＝s)r、-co2r、-co2、-c(＝s)or、-c(＝o)sr、-c(＝s)sr、-c(＝o)nr2、-c(＝s)nr2、-c(＝nr)nr2、c1-c20杂烷基、c6-c20芳基、c3-c8杂环基、保护基团或前药部分，其中每个x独立地是卤素：-f、-cl、-br或-i；并且每个r独立地是-h或c1-c6烷基。被卤素取代的被取代烷基在本文中有时称为卤烷基。含有或不含如本文所述的烷基或亚烷基部分的芳基、亚烷基、亚杂烷基和其它基团也可类似地被取代。

除非另有指示，否则“芳烷基”本身或作为另一术语的一部分意指如上文所定义的烷基被如上文所定义的芳基取代。

除非另有指示，否则“c3-c8杂环基”本身或作为另一术语的一部分是指单价或二价的被取代或未被取代的芳族或非芳族单环或双环环系，其具有3至8个碳原子(也称为环成员)和1至4个独立地选自n、o、p或s的杂原子环成员，并且通过从母体环系的环原子去除一个氢原子而衍生。类似地，除非另有指示，否则“c3-c10杂环基”本身或作为另一术语的一部分是指单价或二价的被取代或未被取代的芳族或非芳族单环或双环环系，其具有3至10个碳原子(也称为环成员)和1至4个独立地选自n、o、p或s的杂原子环成员，并且通过从母体环系的环原子去除一个氢原子而衍生。杂环基中的一个或多个n、c或s原子可被氧化。包括杂原子的环可以是芳族或非芳族。在不提及具体碳数目的情形下使用术语“杂环基”时，具有多于10个碳的杂环基(例如具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的环或环系)也是可能的并且连同c3-c10杂环基一起涵盖在内。类似地，在不提及具体碳数目的情形下使用术语“杂环基”时，具有少于3个碳的杂环基(例如具有1或2个碳的环)是可能的并且涵盖在内。术语“杂环烷基”是指非芳族杂环基环或环系，其中所有碳原子都是饱和的(即键结至氢或如下文所示的另一取代基，无双键或三键)。在某些实施方案中，杂环烷基通常具有3至5个成员和1至2个杂原子。在某些实施方案中，杂环烷基可以是环氧基。

除非另有说明，否则杂环基在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至其侧基。c3-c8杂环基的代表性实例包括(但不限于)四氢呋喃基、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。c3-c8杂环基或c3-c10杂环基可以被至多7个基团取代，所述基团包括(但不限于)c1-c8烷基、c1-c8杂烷基、-or、芳基、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or、-c(o)nh2、-c(o)nhr'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(＝o)2r'、-s(o)r'、卤素、-nh(r')、-n(r')2和-cn；其中每个r'独立地选自-h、c1-c8烷基、c1-c8杂烷基和芳基。在一些实施方案中，被取代的杂环基也可以包括以下中的一个或多个：-nhc(＝nh)nh2、-nhconh2、-s(＝o)2r'和-sr'。

除非另有指示，否则“杂芳烷基”本身或作为另一术语的一部分意指如上文所定义的烷基被如上文所定义的芳族杂环基取代。

除非另有指示，否则“c3-c8碳环基”本身或作为另一术语的一部分是3元、4元、5元、6元、7元或8元单价或二价、被取代或未被取代、饱和或不饱和的非芳族单环或双环碳环，其通过从母体环系的环原子去除一个氢原子或两个氢原子而衍生。类似地，除非另有指示，否则“c3-c10碳环基”本身或作为另一术语的一部分是3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元单价或二价、被取代或未被取代、饱和或不饱和的非芳族单环或双环碳环，其通过从母体环系的环原子去除一个氢原子而衍生。代表性的c3-c8碳环基包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基、环辛二烯基、双环(111)戊烷和双环(222)辛烷。c3-c8碳环基或c3-c10碳环基可未被取代或被至多7个基团取代，所述基团包括(但不限于)c1-c8烷基、c1-c8杂烷基、-or'、芳基、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or、-c(o)nh2、-c(o)nhr'、-c(o)n(r')2、-nhc(o)r'、-s(＝o)2r'、-s(＝o)r'、-oh、-卤素、-nh(r')、-n(r')2和-cn；其中每个r'独立地选自-h、c1-c8烷基、c1-c8杂烷基和芳基。在不提及具体碳数目的情形下使用术语“碳环基”时，具有多于10个碳的碳环基(例如具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的环系)也是可能的并且连同c3-c10碳环基一起涵盖在内。

术语“环烷基”是指碳环基环或环系，其中所有碳原子都是饱和的(即键结至氢或如下文所示的另一取代基，无双键或三键)。

术语“手性”是指具有与镜像配偶体的不可重叠性的分子，而术语“非手性”是指可重叠在其镜像配偶体上的分子。

术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但在原子或基团的空间排列方面不同的化合物。

“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可根据例如电泳和色谱法的高分辨率分析程序分离。

术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种无光学活性的对映异构物质的等摩尔混合物。

氨基酸“衍生物”包括通过共价连接母体氨基酸而具有取代或修饰(例如，通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酸化等)的氨基酸。“衍生物”的定义内进一步包括例如具有被取代键联以及本领域中已知的其它修饰的氨基酸的一种或多种类似物。

除非上下文另外指示，否则“天然氨基酸”是指精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸。

如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的有机或无机盐。化合物通常含有至少一个氨基，并且因此可用该氨基形成酸加成盐。示例性盐包括(但不限于)硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可涉及纳入另一分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是任何稳定母体化合物上的电荷的有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有一个以上的带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实例可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。

术语“载量”或“药物载量”代表或是指adc分子中每个抗体的细胞毒性化合物的平均数量。药物载量可在1至10个药物/抗体范围内。这有时称为dar或药物/抗体比。本文所述adc组合物的dar通常为1-20并且在某些实施方案中为1-8、2-8、2-6、2-5和2-4。典型的dar值为2、4、6和8。可通过常规方式如uv/可见光谱、质谱、elisa测定和hplc来表征每个抗体的药物平均数量或dar值。也可测定定量dar值。在一些情况下，具有特定dar值的均质adc的分离、纯化和表征可通过例如反相hplc或电泳的方式来实现。

dar可受限于抗体上连接位点的数量。两种典型的连接方式是经由与半胱氨酸硫醇残基的硫键联和与赖氨酸残基的酰胺键联。参见puthenveetil,s.等,bioconjugatechem.,2016,27:1880-1888。例如，在连接是半胱氨酸硫醇的情形下，抗体可具有仅一个或若干个可连接接头单元的半胱氨酸硫醇基团，或者可具有仅一个或若干个可连接接头单元的足够反应性的硫醇基团。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基团。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇是不形成链间二硫键的半胱氨酸残基的硫醇基团。抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基是以二硫桥形式存在，并且必须用还原剂如二硫苏糖醇(dtt)还原。通常，在缀合反应期间，比理论最大值少的药物部分缀合至抗体。抗体可含有例如许多不与接头或接头中间体反应的赖氨酸残基。仅最具反应性的赖氨酸基团可与反应性接头试剂反应以与抗体形成酰胺键。抗体可经受变性条件以展现反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。

adc的载量(药物/抗体比)可以若干不同方式加以控制，包括：(i)限制药物-接头相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。如果一个以上的亲核基团与药物-接头反应，则所得产物是adc的混合物并具有每个抗体一个或多个药物部分的分布。每个抗体的药物平均数量可通过例如对抗体具有特异性且对药物具有特异性的双重elisa抗体测定从混合物计算。可通过质谱法在混合物中鉴别个别adc，并且通过hplc(例如疏水性相互作用色谱法)将其分离。

术语“保护基团”是指当连接至分子中的反应性官能团时，掩蔽、降低或阻止所述官能团的反应性的一组原子。保护基团的实例可见于green等,“protectivegroupsinorganicchemistry”,(wiley,第2版,1991)和harrison等,“compendiumofsyntheticorganicmethods”,第1-8卷(johnwileyandsons,1971-1996)。代表性的氨基保护基团包括(但不限于)甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧基羰基(“cbz”)、叔丁氧基羰基(“boc”)、三甲基甲硅烷基(“tms”)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(“ses”)、三苯甲基和被取代的三苯甲基、烯丙基氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基(“fmoc”)、硝基-藜芦基氧基羰基(“nvoc”)等。代表性的羟基保护基团包括(但不限于)其中羟基被酰化或烷基化的那些基团，例如苄基和三苯甲基醚以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。

现在将详细参考某些优选治疗方法、化合物和施用这些化合物的方法。本发明不限于那些优选化合物和方法，而是由本文所发布的权利要求界定。

药物毒素化合物

本发明的药物化合物是天然存在的细胞毒性化合物泰兰他汀a或其药学上可接受的盐的类似物。泰兰他汀a是从泰国伯克霍尔德菌(b.thailandensis)msmb43的培养原液鉴别出的三种结构上类似的天然产物(a、b和c)中的一者。这些天然产物在体外具有强效的前mrna抑制活性并且在人类癌细胞系中具有抗增殖活性(liu等,j.nat.prod.,2013,76(4):685-693)。

根据一个方面，本发明涉及一种或多种式(i)化合物：

其中：

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

x是-h或-ch3；

每个n独立地是1、2或3；并且

每个m独立地是0、1、2或3；

或其药学上可接受的盐。

在某些示例性实施方案中，r选自由以下组成的组：

在另一个实施方案中，本发明的化合物选自由以下组成的组：

合成本发明化合物的方法在下文实施例部分中给出。

接头单元(l)和接头部分(l')

根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(ii)化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

l是接头；

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

每个n独立地是1、2或3；并且

每个m独立地是0、1、2或3；

或其药学上可接受的盐。

在某些示例性实施方案中，l选自由式(a¹)、式(a²)、式(a³)、式(a⁴)和式(a⁵)组成的组：

其中q是3、4、5、6、7、8、9或10；并且

y是br、i或

在其它示例性实施方案中，r选自由以下组成的组：

接头是双官能或多官能化合物，其可用于连接药物与抗体以形成抗体-药物缀合物(adc)。这些缀合物可用于例如形成针对肿瘤相关抗原的免疫缀合物。这些缀合物允许细胞毒性药物选择性递送至肿瘤细胞。在adc中，接头用于将毒素连接至抗体。

在本发明的背景中，“接头”(l)是可用于将一个或多个毒素药物部分连接至抗体(ab)以形成式iii的抗体-药物缀合物(adc)的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物(adc)可使用具有反应性官能团以共价连接至药物和抗体的接头来制备。例如，在一些实施方案中，抗体(ab)的半胱氨酸硫醇可与接头的反应性官能团或式ii的药物-接头中间体形成键以制备adc。

接头l经由双官能化合物的一个反应性位点共价结合，留下另一官能位点以用于随后连接至抗体。接头l是具有1-200个选自c、n、o、s或卤素的非氢原子的部分，并且任选地并入醚，氧代基，羧基，羧酰胺，羧酰胺基，氨基甲酸酯基，支链、环状、不饱和氨基酸，杂环、芳族或杂芳族部分。接头l可为无支链或有支链，柔性或刚性，短或长的并且可并入认为有用的部分的任何组合。在一些实施方案中，接头l的至少一部分可具有聚环氧烷聚合物区域，其可增强式(iii)化合物的溶解性。在一些实施方案中，接头l可具有乙二醇的重复单元，并且可具有约1至约25个或其间任何数量的多个重复乙二醇单元。在一些实施方案中，l可包括约1至约4个、约3至约20个、约4至约15个、约5至约12个或约6至约10个乙二醇单元。

在一些实施方案中，接头l的至少一部分可包括一个或多个氨基酸部分，所述氨基酸部分可提供式(iii)化合物的增强的溶解性或可提供氨基酸序列以增强靶标结合，增强与靶标结合剂的相容性，或增强靶标结合识别。在其它实施方案中，接头l可包括一个或多个提供蛋白酶的适宜底物基序的氨基酸部分。这些实施方案包括选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。当将一组对所选蛋白酶提供特异性底物基序的氨基酸部分并入接头l中时，式(iii)的细胞毒性药物化合物可从靶标结合缀合物释放以提供局部细胞毒性效应。这些底物基序是本领域中已知的并且可根据需要并入接头l中以提供从靶标结合缀合物的选择性释放。这种选择性可基于药物-抗体缀合物的局部递送区内所需蛋白酶的已知存在。可将其它聚合物类型的部分并入接头l中，例如多元酸、多糖或多胺。例如被取代芳族或杂芳族部分的其它部分可用于增强刚性，或在其中的取代基上提供合成上可及的位点以用于连接至反应性部分或式(iii)化合物。

接头l的另一个第二官能位点可用于后续连接至抗体，由此经由接头将本发明的毒素共价键结至抗体。这种第二反应性位点是例如对抗体单元(例如抗体)上存在的亲核基团具反应性的亲电子基团。抗体上可用的亲核基团包括(但不限于)巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子对接头单元上的亲电子基团具反应性并且与接头单元形成共价键。可用的亲电子基团包括(但不限于)马来酰亚胺和卤乙酰胺基团。亲电子基团为抗体连接提供适宜位点。

在另一个实施方案中，接头单元具有反应性位点，所述反应性位点具有对抗体上存在的亲电子基团具反应性的亲核基团。抗体上可用的亲电子基团包括(但不限于)醛和酮羰基。接头单元的亲核基团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并与抗体形成共价键。接头单元上可用的亲核基团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团为连接至接头单元提供适宜位点。在一些实施方案中，亲电子基团包括：

其中波浪线指示与l的连接，并且

r⁴是no2、cl、f、cn或br，并且q是0、1或2。

氨基官能团也是接头单元的可用反应性位点，因为它们可与羧酸或化合物的活化酯反应以形成酰胺键联。通常，本发明的基于肽的化合物可通过在两种或更多种氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。

在一个方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能团。这些反应性官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤乙酰胺、α-卤乙酰基、吡啶基二硫化物、活化酯如琥珀酰亚胺酯、n-羟基琥珀酰亚胺、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见例如klussman等,bioconjugatechemistry,2004,15(4):765-773的第766页的缀合方法和其中的实施例。

在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。这些亲电子基团的实例包括(但不限于)醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。反应性官能团的非限制性实例包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。

接头可包含一个或多个接头组分，包括(但不限于)延伸体单元、拟肽单元、肽单元和间隔体单元。参见j.lu.等,(int.j.mol.sci.,2016,17:561)。示例性接头组分和接头试剂包括(但不限于)对氨基苯甲酸-缬氨酸-瓜氨酸(“paba-val-cit”)、6-马来酰亚胺基己酰基(“mc”)、马来酰亚胺基丙酰基(“mp”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、缬氨酸-丙氨酸(“val-ala”或“va”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)、甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(“gflg”)、对氨基苄氧基羰基(“pab”)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸n-琥珀酰亚胺基酯(“spp”)、环己烷-1甲酸4-(n-马来酰亚胺基甲基)酯(“mcc”)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(“smcc”)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸n-琥珀酰亚胺基酯(“spdb”)和4-(2-吡啶基二硫基)丁酸磺基-n-琥珀酰亚胺基酯(“磺基-spdb”)。各种接头组分是本领域中已知的，其描述于本文中。示例性接头组分包括(但不限于)“vc-2×peg”、“va-2×peg”和“vc-8×peg”和“va-8×peg”，其中缬氨酸-瓜氨酸单元连接至两个或更多个亚乙基氧基单元(peg)(例如2至10个peg单元)。

接头可以是有助于药物或毒素释放的“可裂解接头”。可裂解接头的非限制性实例包括酸不稳定接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)接头、光不稳定接头或含二硫键的接头(chari等,cancerresearch,1992,52:127-131；美国专利第5,208,020号)。

接头实施方案的其它实例描述于美国专利第7,498,298号中，所述专利通过引用明确并入本文。

在本发明的上下文中，l'部分是双官能接头的中心部分，其在药物经由此中心部分共价结合至抗体之后保留在抗体-药物缀合物中。l'部分如上文针对接头l所述，不同之处在于第二官能位点(亲电子或亲核基团)已如上文所述与抗体反应形成共价键。源自n-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯(nhs酯)接头并且能够如上文所述结合至抗体上的赖氨酸残基的l'部分的非限制性实例示于式(b¹)中：

其中q是3、4、5、6、7、8、9或10。l'部分的另一个非限制性实例，包括能够结合至抗体上的半胱氨酸残基的马来酰亚胺单元，示于式(b²)中：

其中q是3、4、5、6、7、8、9或10。l'部分的另一个非限制性实例，包括能够结合至抗体上的半胱氨酸残基的酰胺单元，示于式(b³)中：

l'部分的另一个非限制性实例，包括能够结合至抗体上的半胱氨酸残基的酰胺单元，示于式(b⁴)中：

其中q是3、4、5、6、7、8、9或10。

在其中l包含式(a⁴)的情形下，

抗体上的可用-nh2基团(例如来自赖氨酸残基)置换式(a⁴)，从而产生抗体与式(i)化合物之间的直接连接。

抗体单元(ab或ab)

如上所述，术语“抗体”(或“ab”或“ab”)在本文中是以最广泛意义使用，并且具体来说涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和展现所需生物学活性的抗体片段。另外，虽然本文所述的本发明的某些方面涉及抗体-药物缀合物，但进一步设想缀合物的抗体部分可替换为与给定靶细胞群体相关的受体、抗原或其它接受性部分特异性结合或反应性地缔合或复合的任何物质。例如，本发明的缀合物可含有靶向分子代替含有抗体，所述靶向分子与寻求被治疗性或以其它方式生物学改性的细胞群体的受体、抗原或其它接受性部分结合、复合或反应。这些分子的实例包括较小分子量蛋白质、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、维生素、营养运输分子(例如但不限于转铁蛋白)或任何其它细胞结合分子或物质。在某些方面，抗体或其它这样的靶向分子用于将药物递送至所述抗体或其它靶向分子与其相互作用的特定靶细胞群体。

在另一方面，本发明涉及式iii的抗体-药物缀合物化合物，其中抗体ab选自：吉妥珠单抗(gemtuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)帕妥珠单抗(pertuzumab)伊妥木单抗(iratumumab)、依托珠单抗(inotuzumab)、皮那珠单抗(pinatuzumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、颇拉珠单抗(polatuzumab)、克妥昔单抗(coltuximab)、洛妥珠单抗(lovotuzumab)、萨妥珠单抗(sacituzumab)、安妥单抗(anetumab)、普妥单抗(aprutumab)、雷妥姆单抗(aratumumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿秦珠单抗(azintuxizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)比伐珠单抗(bivatuzumab)、贝伦妥单抗(brentuximab)、卡密鲁单抗(camidanlumab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)卡非珠单抗(cofetuzumab)、丹尼珠单抗(denintuzumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、恩福单抗(enfortumab)、格莱木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊达珠单抗(iladatuzumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、英度珠单抗(industuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、拉迪珠单抗(ladiratuzumab)、拉妥昔单抗(laprituximab)、利伐珠单抗(lifastuzumab)、隆卡昔单抗(loncastuximab)、洛伏珠单抗(lorvotuzumab)、鲁帕单抗(lupartumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、米维昔单抗(mirvetuximab)、那拉昔单抗(naratuximab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、欧瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗、利妥昔单抗(rituximab)罗伐珠单抗(rovalpituzumab)、瑟曲单抗(sirtratumab)、索非珠单抗(sofituzumab)、特索珠单抗(telisotuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗和伐达昔单抗(vadastuximab)。在某些优选实施方案中，抗体ab选自由以下组成的组：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、吉妥珠单抗和伐达昔单抗。

抗体单元上可存在的杂原子包括硫(在一个实施方案中，来自抗体的巯基)、氧(在一个实施方案中，来自抗体的羰基、羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中，来自抗体的伯氨基或仲氨基)。这些杂原子可以抗体的天然状态(例如天然存在抗体)存在于抗体上，或者可经由化学修饰引入抗体中。

在一个实施方案中，抗体单元具有巯基并且所述抗体单元经由巯基的硫原子键结。

在另一个实施方案中，抗体具有赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可与活化酯(这些酯包括(但不限于)n-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯基酯和对硝基苯基酯)反应，并由此形成由抗体单元的氮原子和羰基组成的酰胺键。

在另一方面，抗体单元具有一个或多个赖氨酸残基，所述残基可被化学修饰以引入一个或多个巯基。可用于修饰赖氨酸的试剂包括(但不限于)n-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯(nhs酯)、s-乙酰基硫基乙酸n-琥珀酰亚胺基酯(sata)和2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(特劳特试剂(traut'sreagent))。

在另一个实施方案中，抗体单元可具有一个或多个碳水化合物基团，所述基团可被化学修饰以具有一个或多个巯基。

在另一个实施方案中，抗体单元可具有一个或多个碳水化合物基团，所述基团可被氧化以提供醛基。相应醛可与反应性位点(例如肼和羟胺)形成键。修饰用于连接或缔合药物的蛋白质的其它方案描述于coligan等,currentprotocolsinproteinscience，第2卷，johnwiley&sons(2002)中。

可用的多克隆抗体是源自免疫动物血清的抗体分子的异质群体。可用的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(例如，癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的抗体的同质群体。可通过使用本领域已知的任何技术来制备所关注抗原的单克隆抗体(mab)，所述技术可通过培养中的连续细胞系来产生抗体分子。

可用的单克隆抗体包括(但不限于)人类单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合单克隆抗体。可通过本领域已知的众多技术中的任一者来制备人类单克隆抗体。

抗体也可以是双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。

抗体可以是抗体中免疫特异性结合至靶细胞(例如，肿瘤相关抗原、癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的功能活性片段、衍生物或类似物或者结合至肿瘤细胞或基质的其它抗体。就此而言，“功能活性”意味着片段、衍生物或类似物能够引发抗-抗独特型抗体，所述抗体识别所述片段、衍生物或类似物所源自抗体识别的相同抗原。具体来说，在一个示例性实施方案中，免疫球蛋白分子独特型的抗原性可通过缺失特异性识别抗原的cdr序列c末端的框架和cdr序列来增强。为测定哪些cdr序列结合抗原，可通过本领域中已知的任何结合测定方法(例如bia核心测定)将含有cdr序列的合成肽与抗原一起用于结合测定中。

其它可用抗体包括抗体片段，例如(但不限于)f(ab')2片段、fab片段、fv、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、scfv、scfv-fv或与抗体具有相同特异性的任何其它分子。

另外，重组抗体(例如嵌合和人源化单克隆抗体，其包含人类和非人类部分，其可以使用标准重组dna技术来制备)是可用抗体。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠类单克隆和人类免疫球蛋白恒定区的可变区的那些分子。人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(cdr)和一个来自人类免疫球蛋白分子的框架区。这些嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组dna技术来产生。

完全人类抗体是特别理想的，并且可使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人类重链和轻链基因的转基因小鼠产生。以正常方式利用所选抗原(例如，本发明多肽的全部或一部分)对转基因小鼠进行免疫。针对抗原的单克隆抗体可使用常规杂交瘤技术来获得。转基因小鼠含有的人类免疫球蛋白转基因在b细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可使用本领域技术人员已知的方法产生治疗可用的igg、iga、igm和ige抗体。其它人类抗体可从众多公司商购获得。

可使用称为“指导选择”的技术产生识别所选表位的完全人类抗体。在这种方法中，使用所选非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)来指导识别相同表位的完全人类抗体的选择。人类抗体也可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。

在其它实施方案中，抗体是抗体或其功能活性片段的融合蛋白，例如其中抗体经由共价键(例如，肽键)在n末端或c末端与不来自抗体的另一蛋白质(或其部分，优选蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。优选地，抗体或其片段在恒定结构域的n末端共价连接至另一蛋白质。

抗体包括被修饰(即通过共价连接任何类型的分子，只要这种共价连接允许抗体保留其抗原结合免疫特异性即可)的类似物和衍生物。例如但不加以限制，抗体的衍生物和类似物包括被进一步修饰(例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解裂解、键联至细胞抗体单元或其它蛋白质等)的那些衍生物和类似物。可通过已知技术(包括(但不限于)特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素(tunicamycin)存在下的代谢合成等)来实施众多化学修饰中的任一种。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。

抗体可在与fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、缺失或添加)。具体来说，抗体可在鉴别为涉及抗fc结构域与fcrn受体之间的相互作用的氨基酸残基中具有修饰。

对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，化学合成或重组表达技术)来产生。可例如从genbank数据库或其类似数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序来获得编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列。

在一个具体实施方案中，可使用用于治疗癌症的已知抗体。对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(例如，重组表达技术)来产生。可例如从genbank数据库或其类似数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序来获得编码对癌细胞抗原(肿瘤相关抗原)具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列。

肿瘤相关抗原(taa)的实例包括(但不限于)本文所列示的taa(1)-(100)。为方便起见，在大多数情况下，与这些抗原(所有所述抗原都是本领域中已知的)有关的信息列示于本文中并且在大多数情况下遵循国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的核酸和蛋白质序列鉴别惯例包括名称、替代名称、genbank登录号和主要参考文献。对应于taa(1)-(100)的核酸和蛋白质序列可在公共数据库(例如genbank)中获得。抗体所靶向的肿瘤相关抗原包括相对于所引用参考文献中所鉴别的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性或展现与具有所引用参考文献中所发现序列的taa基本上相同的生物学性质或特性的所有氨基酸序列变体和同工型。例如，具有变体序列的taa通常能够特异性结合至与具有所列示相应序列的taa特异性结合的抗体。本文中所明确引用的参考文献中的序列和公开内容通过引用明确并入。

taa的具体非限制性实例包括：

(1)bmpr1b(ib型骨成形性蛋白质受体，genbank登录号nm_001203)；tendijke,p.等,science,1994,264(5155):101-104；oncogene,1997,14(11):1377-1382)；wo2004/063362(权利要求2)；wo2003/042661(权利要求12)；us2003/134790(第38-39页)；wo2002/102235(权利要求13；第296页)；wo2003/055443(第91-92页)；wo2002/99122(实施例2；第528-530页)；wo2003/029421(权利要求6)；wo2003/024392(权利要求2；图112)；wo2002/98358(权利要求1；第183页)；wo2002/54940(第100-101页)；wo2002/59377(第349-350页)；wo2002/30268(权利要求27；第376页)；wo2001/48204(实施例；图4)np_001194骨成形性蛋白质受体，ib型/pid＝np_001194.1-交叉引用：mim:603248；np_001194.1；ay065994。

(2)e16(lat1，slc7a5，genbank登录号nm_003486)；biochem.biophys.res.commun.,1999,255(2),283-288；nature,1998,395(6699):288-291；gaugitsch,h.w.等,j.biol.chem.,1992,267(16):11267-11273)；wo2004/048938(实施例2)；wo2004/032842(实施例iv)；wo2003/042661(权利要求12)；wo2003/016475(权利要求1)；wo2002/78524(实施例2)；wo2002/99074(权利要求19；第127-129页)；wo2002/86443(权利要求27；第222页、第393页)；wo2003/003906(权利要求10；第293页)；wo2002/64798(权利要求33；第93-95页)；wo2000/14228(权利要求5；第133-136页)；us2003/224454(图3)；wo2003/025138(权利要求12；第150页)；np_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+系统)，成员5/pid＝np_003477.3-智人(homosapien)交叉引用：mim:600182；np_003477.3；nm_015923；nm_003486_1。

(3)steap1(前列腺的六跨膜上皮抗原，genbank登录号nm_012449)；cancerres.,2001,61(15),5857-5860；hubert,r.s.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,96(25):14523-14528)；wo2004/065577(权利要求6)；wo2004/027049(图1l)；ep1394274(实施例11)；wo2004/016225(权利要求2)；wo2003/042661(权利要求12)；us2003/157089(实施例5)；us2003/185830(实施例5)；us2003/064397(图2)；wo2002/89747(实施例5；第618-619页)；wo2003/022995(实施例9；图13a，实施例53；第173页，实施例2；图2a)；np_036581前列腺的六跨膜上皮抗原交叉引用：mim:604415；np_036581.1；nm_012449_1。

(4)0772p(ca125，muc16，genbank登录号af361486)；j.biol.chem.,2001,276(29):27371-27375；wo2004/045553(权利要求14)；wo2002/92836(权利要求6；图12)；wo2002/83866(权利要求15；第116-121页)；us2003/124140(实施例16)。交叉引用：gi:34501467；aak74120.3；af361486_1。

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(6)napi3b(napi-3b，nptiib，slc34a2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，ii型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b，genbank登录号nm_006424)；j.biol.chem.,2002,277(22):19665-19672；genomics,1999,62(2):281-284；feild,j.a.等,biochem.biophys.res.commun.,1999,258(3):578-582)；wo2004/022778(权利要求2)；ep1394274(实施例11)；wo2002/102235(权利要求13；第326页)；ep875569(权利要求1；第17-19页)；wo2001/57188(权利要求20；第329页)；wo2004/032842(实施例iv)；wo200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉引用：mim:604217；np_006415.1；nm_006424_1。

(7)sema5b(flj10372，kiaa1445，mm.42015，sema5b，semag，臂板蛋白5bhlog(semaphorin5bhlog)，sema结构域，七个血小板反应蛋白重复序列(1型和1型样)，跨膜结构域(tm)和短细胞质结构域，(臂板蛋白)5b，genbank登录号ab040878)；nagaset.等,dnares.,2000,7(2):143-150)；wo2004/000997(权利要求1)；wo2003/003984(权利要求1)；wo2002/06339(权利要求1；第50页)；wo2001/88133(权利要求1；第41-43页、第48-58页)；wo2003/054152(权利要求20)；wo20031/01400(权利要求11)；登录：q9p283；embl；ab040878；baa95969.1.genew；hgnc:10737。

(8)pscahlg(2700050c12rik，c530008o16rik，rikencdna2700050c12，rikencdna2700050c12基因，genbank登录号ay358628)；ross等,cancerres.,2002,62:2546-2553；us2003/129192(权利要求2)；us2004/044180(权利要求12)；us2004/044179(权利要求11)；us2003/096961(权利要求11)；us2003/232056(实施例5)；wo2003/105758(权利要求12)；us2003/206918(实施例5)；ep1347046(权利要求1)；wo2003/025148(权利要求20)；交叉引用：gi:37182378；aaq88991.1；ay358628_1。

(9)etbr(内皮素b型受体，genbank登录号ay275463)；nakamutam.等,biochem.biophys.res.commun.,1991,177:34-39；ogaway.等,biochem.biophys.res.commun.,1991,178,248-255；arai,h.等,jpn.circ.j.,1992,56:1303-1307；arai,h.等,j.biol.chem.,1993,268:3463-3470；sakamotoa.,yanagisawam.等,biochem.biophys.res.commun.,1991,178:656-663；elshourbagyn.a.等,j.biol.chem.,1993,268:3873-3879；haendlerb.等,j.cardiovasc.pharmacol.,1992,20:s1-s4；tsutsumim.等,gene,1999,228:43-49；strausberg,r.l.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2002,99:16899-16903；bourgeoisc.等,j.clin.endocrinol.metab.,1997,82,3116-3123；okamotoy.等,biol.chem.,1997,272:21589-21596；verheij,j.b.，am.j.med.genet.,2002,108:223-225；hofstra,r.m.w.等,eur.j.hum.genet.,1997,5:180-185；puffenberger,e.g.等,cell,1994,79:1257-1266；attiet.等,hum.mol.genet.,1995,4:2407-2409；auricchioa.等,hum.mol.genet.,1996,5:351-354；amielj.等,hum.mol.genet.5,355-357,1996；hofstrar.m.w.等,nat.genet.,1996,12:445-447；svensson,p.j.等,hum.genet.,1998,103:145-148；fuchs,s.等,mol.med.,2001,7:115-124；pingaultv.等,hum.genet.,2002,111:198-206；wo2004/045516(权利要求1)；wo2004/048938(实施例2)；wo2004/040000(权利要求151)；wo2003/087768(权利要求1)；wo2003/016475(权利要求1)；wo2003/016475(权利要求1)；wo2002/61087(图1)；wo2003/016494(图6)；wo2003/025138(权利要求12；第144页)；wo2001/98351(权利要求1；第124-125页)；ep522868(权利要求8；图2)；wo2001/77172(权利要求1；第297-299页)；us2003/109676；us6,518,404(图3)；us5,773,223(权利要求1a；第31-34列)；wo2004/001004。

(10)msg783(rnf124，假设蛋白flj20315，genbank登录号nm_017763)；wo2003/104275(权利要求1)；wo2004/046342(实施例2)；wo2003/042661(权利要求12)；wo2003/083074(权利要求14；第61页)；wo2003/018621(权利要求1)；wo2003/024392(权利要求2；图93)；wo2001/66689(实施例6)；交叉引用：基因座id：54894；np_060233.2；nm_017763_1。

(11)steap2(hgnc_8639，ipca-1，pcanap1，stamp1，steap2，stmp，前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白，genbank登录号af455138)lab.invest.82(11):1573-1582(2002))；wo2003/087306；us2003/064397(权利要求1；图1)；wo2002/72596(权利要求13；第54-55页)；wo2001/72962(权利要求1；图4b)；wo2003/104270(权利要求11)；wo2003/104270(权利要求16)；us2004/005598(权利要求22)；wo2003/042661(权利要求12)；us2003/060612(权利要求12；图10)；wo2002/26822(权利要求23；图2)；wo2002/16429(权利要求12；图10)；交叉引用：gi:22655488；aan04080.1；af455138_1。

(12)trpm4(br22450，flj20041，trpm4，trpm4b，瞬时受体电位阳离子通道，亚家族m，成员4，genbank登录号nm_017636)xu,x.z.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2001,98(19):10692-10697；cell,2002,109(3):397-407；j.biol.chem.,2003,278(33):30813-30820；us2003/143557(权利要求4)；wo2000/40614(权利要求14；第100-103页)；wo2002/10382(权利要求1；图9a)；wo2003/042661(权利要求12)；wo2002/30268(权利要求27；第391页)；us2003/219806(权利要求4)；wo2001/62794(权利要求14；图1a-d)；交叉引用：mim:606936；np_060106.2；nm_017636_1。

(13)cripto(cr，cr1，crgf，cripto，tdgf1，畸胎癌源生长因子，genbank登录号np_003203或nm_003212)；ciccodicola,a.等,emboj.,1989,8(7):1987-1991；am.j.hum.genet.,1991,49(3):555-565；us2003/224411(权利要求1)；wo2003/083041(实施例1)；wo2003/034984(权利要求12)；wo2002/88170(权利要求2；第52-53页)；wo2003/024392(权利要求2；图58)；wo2002/16413(权利要求1；第94-95页、第105页)；wo2002/22808(权利要求2；图1)；us5,854,399(实施例2；第17-18列)；us5,792,616(图2)；交叉引用：mim:187395；np_003203.1；nm_003212_1。

(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/爱泼斯坦-巴尔病毒(epsteinbarrvirus)受体)或hs.73792genbank登录号m26004)；fujisaku等,j.biol.chem.,1989,264(4):2118-2125)；weisj.j.等,j.exp.med.,1988,167:1047-1066；moorem.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1987,84:9194-9198；barelm.等,mol.immunol.,1998,35:1025-1031；weisj.j.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1986,83:5639-5643；sinhas.k.等,j.immunol.,1993,150:5311-5320；wo2004/045520(实施例4)；us2004/005538(实施例1)；wo2003/062401(权利要求9)；wo2004/045520(实施例4)；wo9102536(图9.1至图9.9)；wo2004/020595(权利要求1)；登录：p20023；q13866；q14212；embl；m26004；aaa35786.1。

(15)cd79b(cd79b，cd79β，igb(免疫球蛋白相关β)，b29，genbank登录号nm_000626或11038674)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2003,100(7):4126-4131；blood,2002,100(9):3068-3076；muller等,eur.j.immunol.,1992,22(6):1621-1625；wo2004/016225(权利要求2，图140)；wo2003/087768；us2004/101874(权利要求1，第102页)；wo2003/062401(权利要求9)；wo2002/78524(实施例2)；us2002/150573(权利要求5，第15页)；us5,644,033；wo2003/048202(权利要求1，第306页和第309页)；wo99/558658；us6,534,482(权利要求13，图17a/图17b)；wo2000/55351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉引用：mim:147245；np_000617.1；nm_000626_1。

(16)fcrh2(ifgp4，irta4，spap1a(含sh2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，spap1b，spap1c，genbank登录号nm_030764、ay358130)；genomeres.,2003,13(10):2265-2270；immunogenetics,2002,54(2):87-95；blood,2002,99(8):2662-2669；proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2001,98(17):9772-9777；xu,m.j.等,biochem.biophys.res.commun.,2001,280(3):768-775；wo2004/016225(权利要求2)；wo2003/077836；wo2001/38490(权利要求5；图18d-1至图18d-2)；wo2003/097803(权利要求12)；wo2003/089624(权利要求25)；交叉引用：mim:606509；np_110391.2；nm_030764_1。

(17)her2(erbb2，genbank登录号m11730)；coussens,l.等,science,1985,230(4730):1132-1139)；yamamoto,t.等,nature,1986,319:230-234；semba,k.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1985,82:6497-6501；swiercz,j.m.等,j.cellbiol.,2004,165:869-880；kuhns,j.j.等,j.biol.chem.,1999,274:36422-36427；choh.-s.等,nature,1993,421:756-760；ehsani,a.等,genomics,1993,15:426-429；wo2004/048938(实施例2)；wo2004/027049(图1i)；wo2004/009622；wo2003/081210；wo2003/089904(权利要求9)；wo2003/016475(权利要求1)；us2003/118592；wo2003/008537(权利要求1)；wo2003/055439(权利要求29；图1a-b)；wo2003/025228(权利要求37；图5c)；wo2002/22636(实施例13；第95-107页)；wo2002/12341(权利要求68；图7)；wo2002/13847(第71-74页)；wo2002/14503(第114-117页)；wo2001/53463(权利要求2；第41-46页)；wo2001/41787(第15页)；wo2000/44899(权利要求52；图7)；wo2000/20579(权利要求3；图2)；us5,869,445(权利要求3；第31-38列)；wo9630514(权利要求2；第56-61页)；ep1439393(权利要求7)；wo2004/043361(权利要求7)；wo2004/022709；wo2001/00244(实施例3；图4)；登录：p04626；embl；m11767；aaa35808.1.embl；m11761；aaa35808.1。

(18)nca(ceacam6，genbank登录号m18728)；barnettt.等,genomics,1988,3:59-66；tawaragi,y.等,biochem.biophys.res.commun.,1988,150:89-96；strausberg,r.l.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2002,99:16899-16903；wo2004/063709；ep1439393(权利要求7)；wo2004/044178(实施例4)；wo2004/031238；wo2003/042661(权利要求12)；wo2002/78524(实施例2)；wo2002/86443(权利要求27；第427页)；wo2002/60317(权利要求2)；登录：p40199；q14920；embl；m29541；aaa59915.1.embl；m18728。

(19)mdp(dpep1，genbank登录号bc017023)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2002,99(26):16899-16903；wo2003/016475(权利要求1)；wo2002/64798(权利要求33；第85-87页)；jp05003790(图6-8)；wo9946284(图9)；交叉引用：mim:179780；aah17023.1；bc017023_1。

(20)il20rα(il20ra，zcytor7，genbank登录号af184971)；clarkh.f.等,genomeres.,2003,13:2265-2270；mungalla.j.等,nature,2003,425:805-811；blumbergh.等,cell,2001,104:9-19；dumoutierl.等,j.immunol.,2001,167:3545-3549；parrish-novakj.等,j.biol.chem.,2002,277:47517-47523；pletnev,s.等,biochemistry,2003,42:12617-12624；sheikhf.等,j.immunol.,2004,172:2006-2010；ep1394274(实施例11)；us2004/005320(实施例5)；wo2003/029262(第74-75页)；wo2003/002717(权利要求2；第63页)；wo2002/22153(第45-47页)；us2002/042366(第20-21页)；wo2001/46261(第57-59页)；wo2001/46232(第63-65页)；wo9837193(权利要求1；第55-59页)；登录：q9uhf4；q6uwa9；q96sh8；embl；af184971；aaf01320.1。

(21)短蛋白聚糖(brevican)(bcan，behab，genbank登录号af229053)；garys.c.等,gene,2000,256:39-147；clarkh.f.等,genomeres.,2003,13:2265-2270；strausberg,r.l.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2002,99:16899-16903；us2003/186372(权利要求11)；us2003/186373(权利要求11)；us2003/119131(权利要求1；图52)；us2003/119122(权利要求1；图52)；us2003/119126(权利要求1)；us2003/119121(权利要求1；图52)；us2003/119129(权利要求1)；us2003/119130(权利要求1)；us2003/119128(权利要求1；图52)；us2003/119125(权利要求1)；wo2003/016475(权利要求1)；wo2002/02634(权利要求1)。

(22)ephb2r(drt，erk，hek5，epht3，tyro5，genbank登录号nm_004442)chan,j.和watt,v.m.，oncogene,1991,6(6):1057-1061；oncogene,1995,10(5):897-905；annu.rev.neurosci.,1998,21:309-345；int.rev.cytol.,2000,196:177-244；wo2003/042661(权利要求12)；wo2000/53216(权利要求1；第41页)；wo2004/065576(权利要求1)；wo2004/020583(权利要求9)；wo2003/004529(第128-132页)；wo2000/53216(权利要求1；第42页)；交叉引用：mim:600997；np_004433.2；nm_004442_1。

(23)aslg659(b7h，genbank登录号ax092328)us20040101899(权利要求2)；wo2003/104399(权利要求11)；wo2004/000221(图3)；us2003/165504(权利要求1)；us2003/124140(实施例2)；us2003/065143(图60)；wo2002/102235(权利要求13；第299页)；us2003/091580(实施例2)；wo2002/10187(权利要求6；图10)；wo2001/94641(权利要求12；图7b)；wo2002/02624(权利要求13；图1a-1b)；us2002/034749(权利要求54；第45-46页)；wo2002/06317(实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；wo2002/71928(第468-469页)；wo2002/02587(实施例1；图1)；wo2001/40269(实施例3；第190-192页)；wo2000/36107(实施例2；第205-207页)；wo2004/053079(权利要求12)；wo2003/004989(权利要求1)；wo2002/71928(第233-234页、第452-453页)；wo0116318。

(24)psca(前列腺干细胞抗原前体，genbank登录号aj297436)reiterr.e.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1998,95:1735-1740；guz.等,oncogene,2000,19:1288-1296；biochem.biophys.res.commun.,2000,275(3):783-788；wo20040/22709；ep1394274(实施例11)；us2004/018553(权利要求17)；wo2003/008537(权利要求1)；wo2002/81646(权利要求1；第164页)；wo2003/003906(权利要求10；第288页)；wo2001/40309(实施例1；图17)；us2001/055751(实施例1；图1b)；wo2000/32752(权利要求18；图1)；wo1998/51805(权利要求17；第97页)；wo1998/51824(权利要求10；第94页)；wo1998/40403(权利要求2；图1b)；登录：o43653；embl；af043498；aac39607.1。

(25)geda(genbank登录号ay260763)；aap14954脂肪瘤hmgic融合搭配物样蛋白/pid＝aap14954.1-智人物种：智人(人类)wo2003/054152(权利要求20)；wo2003/000842(权利要求1)；wo2003/023013(实施例3，权利要求20)；us2003/194704(权利要求45)；交叉引用：gi:30102449；aap14954.1；ay260763_1。

(26)baff-r(b细胞活化因子受体，blys受体3，br3，genbank登录号af116456)；baff受体/pid＝np_443177.1-智人，thompson,j.s.等,science,2001,293(5537):2108-2111；wo2004/058309；wo2004/011611；wo2003/045422(实施例；第32-33页)；wo2003/014294(权利要求35；图6b)；wo2003/035846(权利要求70；第615-616页)；wo2002/94852(第136-137列)；wo2002/38766(权利要求3；第133页)；wo2002/24909(实施例3；图3)；交叉引用：mim:606269；np_443177.1；nm_052945_1；af132600。

(27)cd22(b细胞受体cd22-b同工型，bl-cam，lyb-8，lyb8，siglec-2，flj22814，genbank登录号ak026467)；wilson等,j.exp.med.,1991,173:137-146；wo2003/072036(权利要求1；图1)；交叉引用：mim:107266；np_001762.1；nm_001771_1。

(28)cd79a(cd79a，cd79α，免疫球蛋白相关α，一种与igβ(cd79b)共价相互作用并在表面上与igm分子形成复合物，转导参与b细胞分化的信号的b细胞特异性蛋白)，pi：4.84，mw：25028tm：2[p]基因染色体：19q13.2，genbank登录号np_001774.10)wo2003/088808；us2003/0228319；wo2003/062401(权利要求9)；us2002/150573(权利要求4，第13-14页)；wo9958658(权利要求13，图16)；wo9207574(图1)；us5,644,033；ha等,j.immunol.,1992,148(5):1526-1531；mueller等,eur.j.biochem.,1992,22:1621-1625；hashimoto等,immunogenetics,1994,40(4):287-295；preud'homme等,clin.exp.immunol.,1992,90(1):141-146；yu等,j.immunol.,1992,148(2)633-637；sakaguchi等,emboj.,1988,7(11):3457-3464。

(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma)受体1，它是一种由cxcl13趋化因子活化的g蛋白偶联受体，功能在于淋巴细胞迁移和体液防御，在hiv-2感染以及可能aids、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中起作用)；372aa，pi：8.54mw：41959tm：7[p]基因染色体：11q23.3，genbank登录号np_001707.1)wo2004/040000；wo2004/015426；us2003/105292(实施例2)；us6,555,339(实施例2)；wo2002/61087(图1)；wo2001/57188(权利要求20，第269页)；wo2001/72830(第12-13页)；wo2000/22129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；wo1999/28468(权利要求1，第38页)；us5,440,021(实施例2，第49-52列)；wo9428931(第56-58页)；wo1992/17497(权利要求7，图5)；dobner等,eur.j.immunol.,1992,22:2795-2799；barella等,biochem.j.,1995,309:773-779。

(30)hla-dob(结合肽且将它们呈递至cd4+t淋巴细胞的mhcii类分子的β亚基(ia抗原))；273aa，pi：6.56mw：30820tm：1[p]基因染色体：6p21.3，genbank登录号np_002111.1)；tonnelle等,emboj.,1985,4(11):2839-2847；jonsson等,immunogenetics,1989,29(6):411-413；beck等,j.mol.biol.,1992,228:433-441；strausberg等,proc.natl.acad.sciusa,2002,99:16899-16903；servenius等,j.biol.chem.,1987,262:8759-8766；beck等,j.mol.biol.,1996,255:1-13；naruse等,tissueantigens,2002,59:512-519；wo9958658(权利要求13，图15)；us6,153,408(第35-38列)；us5,976,551(第168-170列)；us6,011,146(第145-146列)；kasahara等,immunogenetics,1989,30(1):66-68；larhammar等,j.biol.chem.,1985,260(26):14111-14119。

(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控离子通道5，它是由细胞外atp门控的离子通道，可参与突触传递和神经生成，缺陷可导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa)，pi：7.63，mw：47206tm：1[p]基因染色体：17p13.3，genbank登录号np_002552.2)；le等,febslett.,1997,418(1-2):195-199；wo2004/047749；wo2003/072035(权利要求10)；touchman等,genomeres.,2000,10:165-173；wo2002/22660(权利要求20)；wo2003/093444(权利要求1)；wo2003/087768(权利要求1)；wo2003/029277(第82页)。

(32)cd72(b细胞分化抗原cd72,lyb-2)，pi：8.66，mw：40225tm：1[p]基因染色体：9p13.3，genbank登录号np_001773.1)wo2004042346(权利要求65)；wo2003/026493(第51-52页、第57-58页)；wo2000/75655(第105-106页)；vonhoegen等,j.immunol.,1990,144(12):4870-4877；strausberg等,proc.natl.acad.sciusa,2002,99:16899-16903。

(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105)，即富含亮氨酸重复序列(lrr)家族的i型膜蛋白，其调控b细胞活化和细胞凋亡，其功能丧失与患有全身性红斑狼疮的患者的疾病活动增加相关)；661aa，pi：6.20，mw：74147tm：1[p]基因染色体：5q12，genbank登录号np_005573.1)us2002/193567；wo9707198(权利要求11，第39-42页)；miura等,genomics,1996,38(3):299-304；miura等,blood,1998,92:2815-2822；wo2003/083047；wo9744452(权利要求8，第57-61页)；wo2000/12130(第24-26页)。

(34)fcrh1(fc受体样蛋白1，它是含有c2型ig样和itam结构域的免疫球蛋白fc结构域的推定受体，可在b淋巴细胞分化中具有作用)；429aa，pi：5.28，mw：46925tm：1[p]基因染色体：1q21-1q22，genbank登录号np_443170.1)wo2003/077836；wo2001/38490(权利要求6，图18e-1至图18-e-2)；davis等,proc.natl.acad.sciusa,2001,98(17):9772-9777；wo2003/089624(权利要求8)；ep1347046(权利要求1)；wo2003/089624(权利要求7)。

(35)irta2(易位相关免疫球蛋白超家族受体2，它是可能在b细胞发育和淋巴瘤生成中具有作用的推定免疫受体；在一些b细胞恶性病中发生因易位所致的基因失调)；977aa，pi：6.88mw：106468tm：1[p]基因染色体：1q21，genbank登录号人类：af343662、af343663、af343664、af343665、af369794、af397453、ak090423、ak090475、al834187、ay358085；小鼠：ak089756、ay158090、ay506558；np_112571.1。wo2003/024392(权利要求2，图97)；nakayama等,biochem.biophys.res.commun.,2000,277(1):124-127；wo2003/077836；wo2001/38490(权利要求3，图18b-1至图18b-2)。

(36)tenb2(tmeff2，肿瘤调节蛋白(tomoregulin)，tpef，hpp1，tr，推定跨膜蛋白多糖，与生长因子和卵泡抑素的egf/调蛋白(heregulin)家族有关)；374aa，ncbi登录：aad55776、aaf91397、aag49451，ncbirefseq：np_057276；ncbi基因：23671；omim：605734；swissprotq9uik5；genbank登录号af179274；ay358907；caf85723；cq782436；wo2004/074320；jp2004113151；wo2003/042661；wo2003/009814；ep1295944(第69-70页)；wo2002/30268(第329页)；wo2001/90304；us2004/249130；us2004/022727；wo2004/063355；us2004/197325；us2003/232350；us2004/005563；us2003/124579；horie等,genomics,2000,67:146-152；uchida等,biochem.biophys.res.commun.,1999,266:593-602；liang等,cancerres.,2000,60:4907-12；glynne-jones等,int.j.cancer,2001,94(2):178-84。

(37)pmel17(银同源物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；me20；gp100)bc001414；bt007202；m32295；m77348；nm_006928；mcglinchey,r.p.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2009,106(33):13731-13736；kummer,m.p.等,j.biol.chem.,2009,284(4):2296-2306。

(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；肿瘤调节蛋白-1)；h7365；c9orf2；c9orf2；u19878；x83961；nm_080655；nm_003692；harms,p.w.，genesdev.,2003,17(21):2624-2629；gery,s.等,oncogene,2003,22(18):2723-2727。

(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；u95847；bc014962；nm_145793nm_005264；kim,m.h.等,mol.cell.biol.,2009,29(8):2264-2277；treanor,j.j.等,nature,1996,382(6586):80-83。

(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物，基因座e；ly67、rig-e、sca-2、tsa-1)；np_002337.1；nm_002346.2；denooij-vandalen,a.g.等,int.j.cancer,2003,103(6):768-774；zammit,d.j.等,mol.cell.biol.,2002,22(3):946-952。

(41)tmem46(shisa同源物2(光滑爪蟾(xenopuslaevis))；shisa2)；np_001007539.1；nm_001007538.1；furushima,k.等,dev.biol.,2007,306(2):480-492；clark,h.f.等,genomeres.,2003,13(10):2265-2270。

(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物，基因座g6d；ly6-d，megt1)；np_067079.2；nm_021246.2；mallya,m.等,genomics,2002,80(1):113-123；ribas,g.等,j.immunol.,1999,163(1):278-287。

(43)lgr5(含有富含亮氨酸的重复序列的g蛋白偶联受体5；gpr49，gpr67)；np_003658.1；nm_003667.2；salanti,g.等,am.j.epidemiol.,2009,170(5):537-545；yamamoto,y.等,hepatology,2003,37(3):528-533。

(44)ret(ret原致癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；np_066124.1；nm_020975.4；tsukamoto,h.等,cancersci.,2009100(10):1895-1901；narita,n.等,oncogene,2009,28(34):3058-3068。

(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物，基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；np_059997.3；nm_017527.3；ishikawa,n.等,cancerres.,2007,67(24):11601-11611；denooij-vandalen,a.g.等,int.j.cancer,2003,103(6):768-774。

(46)gpr19(g蛋白偶联受体19；mm.4787)；np_006134.1；nm_006143.2；montpetit,a.和sinnett,d.，hum.genet.,1999,105(1-2):162-164；o'dowd,b.f.等,febslett.,1996,394(3):325-329。

(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；np_115940.2；nm_032551.4；navenot,j.m.等,mol.pharmacol.,2009,75(6):1300-1306；hata,k.等,anticancerres.2009,29(2):617-623。

(48)asphd1(含有天冬氨酸盐β-羟基酶结构域的蛋白1；loc253982)；np_859069.2；nm_181718.3；gerhard,d.s.等,genomeres.,2004,14(10b):2121-2127。

(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；np_000363.1；nm_000372.4；bishop,d.t.等,nat.genet.,2009,41(8):920-925；nan,h.等,int.j.cancer,2009,125(4):909-917。

(50)tmem118(环指蛋白，跨膜2；rnft2；flj14627)；np_001103373.1；nm_001109903.1；clark,h.f.等,genomeres.,2003,13(10):2265-2270；scherer,s.e.等,nature,2006,440(7082):346-351。

(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；np_078807.1；nm_024531.3；ericsson,t.a.等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2003,100(11):6759-6764；takeda,s.等,febslett.,2002,520(1-3):97-101。

(52)cd33，一种结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素家族的成员，它是67-kda的糖基化跨膜蛋白。除定向骨髓单核细胞性和红系祖细胞以外，cd33也在大多数骨髓性和单核细胞性白血病细胞上表达。其未见于最早的多能干细胞、成熟粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上(sabbath等,j.clin.invest.,1985,75:756-56；andrews等,blood,1986,68:1030-5)。cd33在其胞质尾区上含有两个酪氨酸残基，所述残基中的每个之后是与许多抑制性受体中所见的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)类似的疏水性残基。

(53)cll-1(clec12a、micl和dcal2)，其编码c型凝集素/c型凝集素样结构域(ctl/ctld)超家族的成员。这个家族的成员共有共同蛋白质折叠并具有多种功能，例如细胞粘附、细胞-细胞信号传导、糖蛋白更新以及在发炎和免疫反应中的作用。这种基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调控剂。已描述这种基因的若干选择性剪接转录变体，但尚未测定这些变体中的一些的全长性质。这种基因与染色体12p13上的天然杀手基因复合体区中的其它ctl/ctld超家族成员密切相关(drickamer,k.，curr.opin.struct.biol.,1999,9(5):585-90；vanrhenen,a.等,blood,2007,110(7):2659-66；chen,c.h.等,blood,2006,107(4):1459-67；marshall,a.s.等,eur.j.immunol.,2006,36(8):2159-69；bakker,a.b.等,cancerres.,2005,64(22):8443-50；marshall,a.s.等,j.biol.chem.,2004,279(15):14792-802)。已显示cll-1是ii型跨膜受体，其包含单一c型凝集素样结构域(其预测不结合钙或糖)、茎部区(stalkregion)、跨膜结构域和含有itim基序的短胞质尾区。

(54)cd70(cd27配体；cd27-l)；结合至cd27的细胞因子在t细胞活化中起作用并诱导共刺激t细胞的增殖和增强细胞溶解性t细胞的产生。cd70蛋白表达于高度活化的淋巴细胞(例如t细胞淋巴瘤和b细胞淋巴瘤)上(israel,b.f.等,mol.cancerther.,2005,4(12):2037-44；o'neill,r.e.等,j.immunol.,2017,199(10):3700-3710；leigh,n.d.等,j.immunol.,2017,199(1):336-347；itani,h.a.等,circ.res.,2016,118(8):1233-43；burchill,m.a.等,eur.j.immunol.,2015,45(11):3140-9；allam,a.等,j.immunol.,2014,193(2):871-8)。

(55)cldn18.2(密连蛋白-18(claudin-18)剪接变体2)；编码人类基因密连蛋白18的cldn18。其也可称为：密连蛋白-18；sfta5；和sftpj。所编码蛋白质的氨基酸长度为261并且质量为27.9kda。cldn18是密连蛋白家族的成员(wo2013/167295；wo2016/166122)。紧密连接分子密连蛋白18同种型2(cldn18.2)是密连蛋白18的癌症相关剪接变体。cldn18.2是27.8kda的跨膜蛋白，其包含四个跨膜结构域与两个小细胞外环(环1由疏水区1和疏水区2包围；环2由疏水区3和疏水区4包围)。cldn18.2是一种高度选择性胃谱系抗原，其仅在寿命较短的分化胃上皮细胞上表达，并且在任何其它正常人类组织中不可检测。所述抗原在多种人类癌症(包括胃食道癌和胰腺癌)中以显著水平异位表达(sahin,u.等,clin.cancerres.,2008,14(23):7624-34)。cldn18.2蛋白也常常在胃癌的淋巴结转移和远端转移中检测到。cldn18.2似乎参与cldn18.2阳性肿瘤细胞的增殖，这是因为通过sirna技术下调靶标导致胃癌细胞增殖的抑制。1mab362是针对cldn18.2的igg1亚型的嵌合单克隆抗体。1mab362以高亲和力和特异性识别cldn18.2的第一细胞外结构域并且不结合至任何其它密连蛋白家族成员(包括密连蛋白18的密切相关的剪接变体1)。

(56)cd151(分化簇151，tspan24，peta-3，sfa-1)；来自raph血型的人类基因。由cd151基因编码的蛋白质是跨膜4超家族(也称为四跨膜蛋白(tetraspanin)家族)的成员。这些成员中的大多数是细胞表面蛋白质，其特征在于存在四个疏水性结构域。所述蛋白质介导在细胞发育、活化、生长和运动的调控中起作用的信号转导事件。这种编码蛋白质是细胞表面糖蛋白，其已知与整联蛋白和其它跨膜4超家族蛋白质复合。其参与包括细胞粘附在内的细胞过程并且可调控整联蛋白输送和/或功能。这种蛋白质增强癌细胞的细胞运动性、侵袭和转移。已针对这种基因描述了编码相同蛋白质的多种选择性剪接转录变体(berditchevskif.，j.cellsci.,2002,114(pt23):4143-51；ashman,l.k.，j.biol.regul.homeost.agents,2003,16(3):223-6；sincock,p.m.等,j.histochem.cytochem.,1997,45(4):515-25；fitters等,biochim.biophys.acta.,1998,1398(1):75-85；sincock,p.m.等,j.cellsci.,1999,112(pt6):833-44；sterk,l.m.等,j.cellbiol.,2000,149(4):969-82；zhang,x.a.,mol.biol.cell.,2002,13(1):1-11)。

(57)itgav(整联蛋白α-v，cd51；msk8；vnra；vtnr)；由itgav基因编码的人类蛋白质(sosnoski,d.m.等,j.clin.invest.,1988,81(6):1993-8)。itgav编码整联蛋白α链v。整联蛋白是由α链和β链构成的异二聚体整合膜蛋白。αv经历翻译后裂解以产生二硫键连接的重链和轻链，它们与多个整联蛋白β链组合以形成不同整联蛋白。在已知的缔合β链(β链1、3、5、6和8；‘itgb1’、‘itgb3’、‘itgb5’、‘itgb6’和‘itgb8’)中，每一个可与细胞外基质配体相互作用；αvβ3整联蛋白(或许是这些中研究最多者)被称为玻连蛋白(vitronectin)受体(vnr)。除粘附以外，已知许多整联蛋白促进信号转导。itgav基因的过表达与结肠直肠癌(waisberg,j.等,anticancerres.,2014,34(10):5599-607)和前列腺癌(cooper,c.r.等,neoplasia,2002,4(3):191-4)的进展和扩散相关。单克隆抗体英妥木单抗(intetumumab)和阿比珠单抗(abituzumab)靶向一些肿瘤细胞上发现的这种蛋白质(e.等,ann.oncology,2015,26(1):132-40)。

其它示例性抗原包括(但不限于)：(58)结合素-4；(59)fgfr2；(60)fgfr3；(61)gpnmb；(62)gucy2c；(63)cldn6；(64)cmet；(65)ceacam4；(66)ceacam5；(67)cd29；(68)cd37；(69)cd352；(70)cd248；(71)muc1；(72)cd123；(73)bcma；(74)adam9；(75)5t4；(76)p-钙粘蛋白；(77)ca9；(78)cd138；(79)cd166；(80)cd71；(81)cd22；(82)cd20；(83)cd74；(84)dll3；(85)叶酸受体α；(86)itga2；(87)itga3；(88)lamp1；(89)liv-1；(90)mmp14；(91)lrcc15；(92)msln；(93)pmsa；(94)prlr；(95)ptk7；(96)slamf7；(97)scl44a4；(98)sltrk5；(99)tm4sf1；和(100)trop2。

在本发明的某些实施方案中，taa选自由以下组成的组：her2、cd33、cd70、muc1/canag、muc16、cd151和itgav。

抗体-药物缀合物(毒素-接头-抗体)化合物

根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(iii)化合物：

t–l'–ab(iii)

或其药学上可接受的盐，其中：

l'是接头部分；

t是式(i')的基团：

其中：

r选自由以下组成的组：-(ch2)n-r¹；-c5-6杂芳基，其任选地被卤素、-cf3、-c1-6烷基和-o-c1-6烷基中的一个或多个取代；--c(r²)＝n-r³；--ch(cf3)nh(ch2)mch3；--c(r^ar^b)nh(ch2)mch3；--c(卤素)＝ch(ch2)mch3；--so2-nh(ch2)mch3；-o(co)-芳基；-o(co)-杂芳基；--nr^ar^b；和--nh-杂芳基；

其中r¹是-o-cr^ar^b(ch2)mch3或-n-cr^ar^b(ch2)mch3；

其中r^a和r^b与其所接合的原子一起形成c3-10杂环基环；

r²是-cn或-nh(ch2)mch3；

r³是-(ch2)mch3或-o-(ch2)mch3；

每个n独立地是1、2或3；

每个m独立地是0、1、2或3；并且

ab是抗体。

在某些示例性实施方案中，l'选自由式(b¹)、式(b²)、式(b³)和式(b⁴)组成的组：

其中q是3、4、5、6、7、8、9或10。

在某些示例性实施方案中，r选自由以下组成的组：

式(iii)的非限制性实例包括式(c¹)：

其中r和q如上文所述并且ab是如上文所述的抗体。式(iii)的另一个非限制性实例包括式(c²)：

其中r如上文所述并且ab是如上文所述的抗体。式(iii)的另一个非限制性实例包括式(c³)：

其中r如上文所述并且ab是如上文所述的抗体。式(iii)的另一非限制性实例包括式(c⁴)：

其中r是如上文所述，ab是如上文所述的抗体，并且n是1、2或3，如上文所述。式(iii)的另一个非限制性实例包括式(c⁵)：

其中r如上文所述，ab是如上文所述的抗体，并且q是3、4、5、6、7、8、9或10，如上文所述。

在一个示例性实施方案中，抗体结合至一种或多种选自(1)-(100)的肿瘤相关或细胞表面受体：

(1)bmpr1b(ib型骨成形性蛋白质受体)；(2)e16(lat1，slc7a5)；(3)steap1(前列腺的六跨膜上皮抗原)；(4)muc16(0772p，ca125)；(5)mpf(mpf，msln，smr，巨核细胞促进因子，间皮素)；(6)napi2b(napi-3b，nptiib，slc34a2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，ii型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；(7)sema5b(flj10372，kiaa1445，mm.42015，sema5b，semag，臂板蛋白5bhlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白重复序列(1型和1型样)，跨膜结构域(tm)和短细胞质结构域，(臂板蛋白)5b)；(8)pscahlg(2700050c12rik、c530008o16rik、rikencdna2700050c12、rikencdna2700050c12基因)；(9)etbr(内皮素b型受体)；(10)msg783(rnf124，假设蛋白flj20315)；(11)steap2(hgnc_8639，ipca-1，pcanap1，stamp1，steap2，stmp，前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白)；(12)trpm4(br22450，flj20041，trpm4，trpm4b，瞬时受体电位阳离子通道，亚家族m，成员4)；(13)cripto(cr，cr1，crgf，cripto，tdgf1，畸胎癌源生长因子)；(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/爱泼斯坦-巴尔病毒受体)或hs73792)；(15)cd79b(cd79b，cd79β，igb(免疫球蛋白相关β)，b29)；(16)fcrh2(ifgp4，irta4，spap1a(含sh2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)，spap1b，spap1c)；(17)her2；(18)nca；(19)mdp；(20)il20rα；(21)短蛋白聚糖；(22)ephb2r；(23)aslg659；(24)psca；(25)geda；(26)baff-r(b细胞活化因子受体，blys受体3，br3)；(27)cd22(b细胞受体cd22-b同工型)；(28)cd79a(cd79a，cd79α，免疫球蛋白相关α)；(29)cxcr5(伯基特氏淋巴瘤受体1)；(30)hla-dob(mhcii类分子的β亚基(ia抗原))；(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控离子通道5)；(32)cd72(b细胞分化抗原cd72，lyb-2)；(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105)，富含亮氨酸重复序列(lrr)家族的i型膜蛋白)；(34)fcrh1(fc受体样蛋白1)；(35)fcrh5(irta2，易位相关免疫球蛋白超家族受体2)；(36)tenb2(推定跨膜蛋白多糖)；(37)pmel17(银同源物；silv；d12s53e；pmel17；si；sil)；(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样结构域1的跨膜蛋白；肿瘤调节蛋白-1)；(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1)；(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物，基因座e；ly67，rig-e，sca-2，tsa-1)；(41)tmem46(shisa同源物2(光滑爪蟾)；shisa2)；(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物，基因座g6d；ly6-d，megt1)；(43)lgr5(含有富含亮氨酸的重复序列的g蛋白偶联受体5；gpr49,gpr67)；(44)ret(ret原致癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；ptc；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)；(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物，基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)；(46)gpr19(g蛋白偶联受体19；mm.4787)；(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)；(48)asphd1(含有天冬氨酸盐β-羟基酶结构域的1；loc253982)；(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)；(50)tmem118(环指蛋白，跨膜2；rnft2；flj14627)；(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)；(52)cd33；(53)cll-1；(54)cd70(cd27配体；cd27-l)；(55)cldn18.2(密连蛋白-18剪接变体2)；(56)cd151(分化簇151，tspan24，peta-3，sfa-1)；(57)itgav(整联蛋白α-v，cd51；msk8；vnra；vtnr)；(58)结合素-4；(59)fgfr2；(60)fgfr3；(61)gpnmb；(62)gucy2c；(63)cldn6；(64)cmet；(65)ceacam4；(66)ceacam5；(67)cd29；(68)cd37；(69)cd352；(70)cd248；(71)muc1；(72)cd123；(73)bcma；(74)adam9；(75)5t4；(76)p-钙粘蛋白；(77)ca9；(78)cd138；(79)cd166；(80)cd71；(81)cd22；(82)cd20；(83)cd74；(84)dll3；(85)叶酸受体α；(86)itga2；(87)itga3；(88)lamp1；(89)liv-1；(90)mmp14；(91)lrcc15；(92)msln；(93)pmsa；(94)prlr；(95)ptk7；(96)slamf7；(97)scl44a4；(98)sltrk5；(99)tm4sf1；和(100)trop2。

在本发明的某些示例性实施方案中，抗体是在转谷氨酰胺酶存在下，经由被以下工程改造的含fc或含fab的多肽结合：含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如，含gln的肽标签或q标签)或通过多肽工程改造(例如，经由多肽上的氨基酸缺失、插入、取代、突变或其任何组合)从而具有反应性(即在胺和转谷氨酰胺酶存在下作为酰基供体形成共价键的能力)的内源性谷氨酰胺。

在某些实施方案中，本发明涉及上述抗体-药物缀合物和伴随定义中的任一者，其中所述抗体-药物缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种本发明的化合物。在某些示例性实施方案中，所述抗体-药物缀合物包含1、2、3或4种本发明的化合物。

共价连接至抗体的毒素的数量可根据具体毒性化合物和抗体而变化。在一个实施方案中，连接1至4种毒素。在另一个实施方案中，连接约1至约4种毒素。在另一个实施方案中，连接约1至约6种毒素。在其中连接一种以上毒素的实施方案中，式(iii)的抗体(ab)具有多个与其共价键结的t-l'-单元。

抗体-药物缀合物的载量(药物/抗体比)可以不同方式加以控制，并且例如，通过以下方式：(i)限制药物-接头中间体式(ii)化合物相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。

应理解，如果一个以上亲核基团与药物反应，则所得产物是式(iii)抗体-药物缀合物化合物的混合物，并且具有一个或多个药物部分连接至抗体的分布。每个抗体的药物平均数量可从混合物通过双重elisa抗体测定来计算，所述测定对抗体具有特异性并且对药物具有特异性。个别抗体-药物缀合物分子可在混合物中通过质谱法鉴别并通过hplc分离，所述hplc例如疏水性相互作用色谱法(参见例如mcdonagh等,prot.engr.designsel.,2006,19(7):299-307；hamblett等,clin.cancerres.,2004,10:7063-7070；hamblett,k.j.等,“effectofdrugloadingonthepharmacology,pharmacokinetics,andtoxicityofananti-cd30antibody-drugconjugate”，文摘号624，americanassociationforcancerresearch，2004年年会，2004年3月27日至31日，proceedingsoftheaacr，第45卷，2004年3月；alley,s.c.等,“controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates”，文摘号627，americanassociationforcancerresearch，2004年年会，2004年3月27日至31日，proceedingsoftheaacr，第45卷，2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一载量值的均质抗体-药物缀合物可通过电泳或色谱法从缀合混合物中分离。

体外细胞增殖测定

可评估本发明的细胞毒性药物化合物和抗体-药物缀合物在体外阻抑各种癌细胞系增殖的能力。

通常，细胞毒性药物或adc的细胞毒性或细胞生长抑制活性是通过以下来测量：在细胞培养基中使具有受体蛋白(例如her2)的哺乳动物细胞暴露于adc的抗体，将细胞培养约6小时至约5天的时期，并测量细胞存活率。使用基于细胞的体外测定来测量本发明adc的存活率(增殖)、细胞毒性和细胞凋亡诱导(半胱天冬酶活化)。

例如，通过细胞增殖测定来测量细胞毒性药物或adc的体外效能。发光细胞存活率测定是基于鞘翅目(coleoptera)荧光素酶的重组表达的市售(promegacorp.,madison,wi)均相测定方法(美国专利第5,583,024号；第5,674,713号；和第5,700,670号)。这种细胞增殖测定基于所存在atp的定量来确定培养基中活细胞的数量，所存在atp的定量是代谢活性细胞的指标(crouch等,j.immunol.meth.,1993,160:81-88；美国专利第6,602,677号)。测定以96孔格式进行，使其适合于自动化高通量筛选(hts)(cree等,anticancerdrugs,1995,6:398-404)。均相测定程序涉及将单一试剂(试剂)直接添加到在补充有血清的培养基中培养的细胞。不需要洗涤细胞、去除培养基和多次移液步骤。在添加试剂并混合之后，系统在10分钟内以384孔格式检测仅仅15个细胞/孔。可利用细胞毒性药物化合物或adc连续处理细胞，或者可将其处理并与细胞毒性药物化合物或adc分离。通常，短暂(即3小时)处理的细胞显示与连续处理细胞相同的效能效应。

体内功效

本发明的细胞毒性药物或adc的体内功效可通过小鼠中的肿瘤异种移植物研究以测量肿瘤生长抑制中的靶标依赖性和剂量依赖性效能来测试。细胞毒性药物或adc的功效可与肿瘤细胞的靶抗原表达相关。

通过在啮齿动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物并利用细胞毒性药物或adc治疗肿瘤在体内测量细胞毒性药物或adc的功效。取决于细胞系、细胞毒性药物的剂量、adc与癌细胞上所存在受体的抗体结合特异性、给药方案和其它因素，可预期可变结果。细胞毒性药物或adc的体内功效可使用表达中等至高水平的肿瘤相关抗原的转基因外植体小鼠模型(包括表达her2的kpl4和表达cd22的bjab)来测量。受试者可用细胞毒性药物或adc治疗一次并监测数周(例如3-6周)以测量肿瘤倍增时间、对数细胞杀死时间和肿瘤萎缩时间。可进行跟踪剂量反应和多剂量实验。

例如，本发明的抗her2adc的体内功效可通过高表达her2转基因外植体小鼠模型来测量(phillips等,cancerres.,2008,68:9280-90)。同种异体移植物从fo5mmtv转基因小鼠繁殖，所述转基因小鼠对(genentech,inc.)疗法无反应或反应较差。受试者用特定剂量水平(mg/kg)的adc和安慰剂缓冲对照(媒介物)治疗一次或多次，并监测两周或更长时间以测量肿瘤倍增时间、对数细胞杀死时间和肿瘤萎缩时间。

药物组合物和施用方法

在其它实施方案中，本发明的另一个方面涉及药物组合物或剂型，其包括有效量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体或媒介物。

本发明的药物组合物可呈容许将组合物施用于患者的任何形式。例如，组合物可呈固体或液体形式。典型的施用途径包括(但不限于)：肠胃外、经眼和肿瘤内。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌内或胸骨内注射或输注技术。在一个方面，组合物是以肠胃外方式施用的。在一个特定实施方案中，组合物是以静脉内方式施用的。

可配制药物组合物以允许在将组合物施用于患者后本发明的化合物和/或其缀合物具生物可用性。组合物可采用一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单一剂量单位，并且呈液体形式的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的容器可容纳多个剂量单位。

药学上可接受的载体或媒介物可以是固体或微粒，从而使得组合物例如呈片剂或粉末形式。载体可以是液体。另外，载体可以是微粒。

组合物可呈液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液。在用于注射施用的组合物中，也可包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

不论呈溶液、悬浮液还是其它类似形式，液体组合物也可包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液(ringer'ssolution)、等渗氯化钠；不挥发性油，例如可用作溶剂或悬浮介质的合成单酸甘油酯或二酸甘油酯，聚乙二醇，甘油，环糊精，丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或氨基酸；和用于调整张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。肠胃外组合物可封闭在安瓿中，即由玻璃、塑料或其它材料制得的一次性注射器或多剂量小瓶。生理盐水是示例性佐剂。可注射组合物优选是无菌的。

可有效治疗特定病症或疾患的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的量将取决于所述病症或疾患的性质，并且可通过标准临床技术来确定。另外，可采用体外或体内测定来帮助鉴别最佳剂量范围。组合物中所用的确切剂量也将取决于施用途径，并且应根据从业医师的判断和每个患者的情况来决定。用于任何特定个体的具体剂量水平将取决于多种因素，包括化合物或药物-抗体缀合物的活性、年龄、体重、一般身体和精神健康、遗传因素、环境影响、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率和所治疗特定问题的严重程度。

组合物包含有效量的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物，从而使得将获得合适剂量。通常，该量是以组合物的重量计至少约0.01％的本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物。在一个示例性实施方案中，制备药物组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01重量％至约2重量％的量的本发明化合物和/或其抗体-药物缀合物。

对于静脉内施用，组合物可包含约0.01mg/kg患者体重至约100mg/kg患者体重的本发明化合物和/或其抗体-药物缀合物。在一个方面，组合物可包括约1mg/kg患者体重至约100mg/kg患者体重的本发明化合物和/或其抗体-药物缀合物。在另一方面，施用量将在约0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重的本发明化合物和/或其抗体-药物缀合物范围内。

通常，本发明化合物和/或其抗体-药物缀合物施用于患者的剂量通常是约0.01mg/kg患者体重至约20mg/kg患者体重。在一个方面，施用于患者的剂量是约0.01mg/kg患者体重至约10mg/kg患者体重之间。在另一方面，施用于患者的剂量是约0.1mg/kg患者体重至约10mg/kg患者体重之间。在另一方面，施用于患者的剂量是约0.1mg/kg患者体重至约5mg/kg患者体重之间。在另一方面，施用剂量是约0.1mg/kg患者体重至约3mg/kg患者体重之间。在另一方面，施用剂量是约1mg/kg患者体重至约3mg/kg患者体重之间。

在具体实施方案中，可期望将一种或多种本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物局部施用至需要治疗的区域。这可以通过例如且不限于以下来实现：在外科手术期间局部输注；局部施加，例如在外科手术后结合伤口敷料；通过注射：借助于导管；或借助于植入物，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜如硅橡胶膜(sialasticmembrane)，或纤维。在一个实施方案中，施用可以通过在癌症、肿瘤或赘瘤或赘瘤前组织的部位(或前部位)直接注射而实现。在另一个实施方案中，施用可以通过在自身免疫疾病的表现部位(或前部位)直接注射而实现。

在另一个实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物可以受控释放系统(例如但不限于泵)来递送，或者可使用各种聚合物材料。在另一个实施方案中，受控释放系统可靠近本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物的靶标(例如肝脏)放置，因此仅需要全身剂量的一部分。

术语“载体”是指与化合物或其抗体-药物缀合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这些药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体。载体可以是盐水等。另外，可使用助剂、稳定剂和其它试剂。在一个实施方案中，当施用于患者时，化合物或缀合物和药学上可接受的载体是无菌的。当化合物或缀合物经静脉内施用时，水是示例性载体。也可采用盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液作为液体载体，尤其是对于注射溶液来说。如果需要，本发明组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物是根据本领域技术人员已知的用于制造适合于静脉内施用的药物组合物的程序来配制。通常，用于静脉内施用的载体或媒介物是无菌等渗缓冲水溶液。在需要时，组合物也可包括增溶剂。用于静脉内施用的组合物可任选地包含局部麻醉剂(例如利诺卡因(lignocaine))以减轻注射部位处的疼痛。通常，各成分是分开供应或以单位剂型混合在一起供应，例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物于标明活性剂的量的气密密封容器(例如安瓿)中。如果本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物要通过输注来施用，则其可例如利用含有无菌医药级水或盐水的输注瓶来分配。如果本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物是通过注射来施用，则可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，从而使得可在施用之前将各成分混合。

不论呈固体或液体形式，本发明组合物可包括一种或多种用于治疗癌症的额外治疗剂。例如，化合物或其抗体-药物缀合物可以与包括以下的组合施用：抗体、烷基化剂、血管生成抑制剂、抗代谢物、dna裂解剂、dna交联剂、dna嵌入剂、dna小沟结合剂、烯二炔、热休克蛋白90抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、免疫调节剂、微管稳定剂、核苷(嘌呤或嘧啶)类似物、出核抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶(i或ii)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。具体治疗剂包括阿达木单抗(adalimumab)、安丝菌素p3(ansamitocinp3)、奥莉丝汀(auristatin)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝伐珠单抗、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、卡利斯他汀a(callistatina)、喜树碱(camptothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、西妥昔单抗、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribin)、阿糖胞苷(cytarabin)、念珠藻素(cryptophycin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、达沙替尼(dasatinib)、道诺霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、多卡米星(duocarmycin)、达内霉素a(dynemycina)、埃博霉素(epothilone)、依托泊苷(etoposide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、伊匹单抗(ipilimumab)、羟基脲、伊马替尼(imatinib)、英利昔单抗(infliximab)、干扰素、白介素、β-拉帕醌(β-lapachone)、来那度胺(lenalidomide)、伊立替康(irinotecan)、美坦辛(maytansine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、6-巯嘌呤、胺甲喋呤(methotrexate)、丝裂霉素c(mitomycinc)、尼罗替尼(nilotinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、丙卡巴肼(procarbazine)、辛二酰基苯胺异羟肟酸(saha)、6-硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、曲妥珠单抗、曲古抑菌素a(trichostatina)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春地辛(vindesine)。

化合物和抗体-药物缀合物的治疗用途

本发明的另一方面涉及使用本发明的化合物、其抗体-药物缀合物及其药物组合物用于治疗癌症的方法。在某些实施方案中，所述缀合物提供缀合特异性肿瘤或癌症药物靶向，由此降低本发明化合物的一般毒性。在另一个实施方案中，抗体单元结合至肿瘤细胞或癌细胞。在另一个实施方案中，抗体单元结合至肿瘤细胞或癌细胞表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原。在另一个实施方案中，抗体单元结合至作为与肿瘤细胞或癌细胞缔合的细胞外基质蛋白的肿瘤细胞或癌细胞抗原。抗体单元对特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性对于测定最有效治疗的那些肿瘤或癌症可能是重要的。

可利用本发明的化合物和/或其抗体-药物缀合物治疗的特定类型的癌症包括(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌和睾丸癌；以及包括(但不限于)白血病和淋巴瘤的血源性癌症。

在一个方面，本文提供的抗体-药物缀合物用于抑制癌细胞增殖的方法中，所述方法包括在允许抗体或抗体-药物缀合物与细胞表面上的肿瘤相关抗原结合的条件下将细胞暴露于所述抗体-药物缀合物，从而抑制细胞增殖。在某些实施方案中，所述方法是体外或体内方法。在其它实施方案中，细胞是淋巴细胞、淋巴母细胞、单核细胞或骨髓单核细胞。

在另一方面，提供用作药物的细胞毒性药物化合物或adc。在其它方面，提供用于治疗方法中的细胞毒性药物化合物或adc。在某些实施方案中，提供用于治疗癌症的细胞毒性药物化合物或adc。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗个体的方法中的细胞毒性药物化合物或adc，其包括向所述个体施用有效量的细胞毒性药物化合物或adc。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种(例如)如本文所述的额外治疗剂。

在另一方面，本发明提供细胞毒性药物化合物或adc的用途，其用于制造或制备药物。在一个实施方案中，所述药物是用于治疗癌症，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种(例如)如本文所述的额外治疗剂。

在另一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有所述癌症(特征在于检测到肿瘤相关表达抗原)的个体施用有效量的本发明的抗体-药物缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种额外治疗剂。

本发明的细胞毒性药物化合物或adc可以单独使用或与其它药剂组合用于疗法中。例如，本发明的细胞毒性药物化合物或adc可与至少一种额外治疗剂(例如化学治疗剂)共同施用。

本文所述的这些组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一或分开的制剂中)和分开施用(在这种情况下，本发明的细胞毒性药物化合物或adc的施用可在施用额外治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行)。本发明的细胞毒性药物化合物或adc也可以与放射疗法组合使用。

本发明的细胞毒性药物化合物或adc(和任何额外治疗剂)可通过任何合适的方式来施用，包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果希望用于局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适的途径来实施，例如通过注射(例如静脉内或皮下注射)，这部分地取决于施用是短暂的还是长期的。本文涵盖各种给药时间表，包括(但不限于)在多个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

以下实施例是以说明方式而非限制方式提供。

实施例

合成实验程序

实验通常是在惰性气氛(氮气或氩气)下进行，尤其在其中采用氧气敏感性或湿气敏感性试剂或中间体的情况下。适当时，市售溶剂和试剂通常不经进一步纯化即使用，包括无水溶剂。质谱数据是从液相色谱法-质谱法(lcms)或大气压化学电离(apci)报告。核磁共振(nmr)数据的化学位移是参照来自所采用氘化溶剂的残余峰以百万分率(ppm,δ)表示。

一般来说，反应之后进行薄层色谱法、lcms或hplc，并且在适当时进行后处理。在实验之间纯化可有所不同：一般来说，选择用于洗脱液/梯度的溶剂和溶剂比率以提供适当保留时间。除非另有说明，否则经由冻干/冷冻干燥浓缩反相hplc洗脱份。中间体和最终化合物在(0℃)或室温下在封闭小瓶或烧瓶中在氮气下储存。

一般程序a1.泰兰他汀类似物毒素化合物的制备。制备具有上述r基团的本发明化合物的第一步骤涉及将含有r基团的羧酸(式(iv))与氨基吡喃(化合物8)偶联以产生中间体酰胺(式(v))。

在25℃下将n-甲基吗啉(nmm)(0.12ml,1.0mmol,6.0当量)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edci)(196mg,1.0mmol,6.0当量)和酸(式(iv))(108mg,0.68mmol,2.0当量)于二氯甲烷(0.6ml)中的溶液依序添加到胺8溶于二氯甲烷(5ml)中的搅拌溶液中。2小时后，用饱和氯化铵水溶液(5.0ml)淬灭反应混合物，并分离各相。用etoac(3×2ml)萃取水层，并且使合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶，于己烷中的10-30％乙酸乙酯)纯化所获得的残余物，得到呈无色油状物的酰胺(式(v))(74mg,0.24mmol,73％)。

将中间体酰胺(式(v))转化成式(i)，其中x是甲基，其基本上是根据a.k.ghosh等,(j.org.chem.,2018,83(9):5187-5198)所述的程序。

一般程序a2.泰兰他汀类似物毒素化合物的制备。或者，制备具有上述r基团的本发明化合物的第一步骤涉及将含有r基团的羧酸(式(iv))与氨基吡喃(2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-胺(化合物8)偶联以产生式(v)的中间体酰胺。使用grubbs第2代催化剂(grubbs-ii催化剂)使式(v)的中间体酰胺与2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-乙烯基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物9)反应，得到式(i)化合物，其中x是甲基。

将化合物8(2当量)和式(iv)的羧酸(1当量)溶解在四氢呋喃(thf)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)(8.3当量)中，并且在室温下添加(丙基膦酸酐；于乙酸乙酯中50％)(5当量)。将反应混合物搅拌大约3小时，直到如通过薄层色谱法(tlc)所测定起始材料耗尽为止。将混合物真空浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法纯化粗产物，得到所需的式(v)的中间体酰胺。

将经纯化的式(v)的中间体酰胺(1当量)溶解在二氯甲烷(dcm)和化合物9(2当量)中，并且在氩气气氛和室温下在搅拌下添加grubbs-ii催化剂(3.3当量)。将混合物在40℃下搅拌大约5小时，直到如通过tlc所测定起始材料耗尽为止。反应混合物经硅藻土垫过滤并用dcm洗涤。在真空中去除溶剂，获得粗产物，其通过制备型hplc进行纯化，得到式(i)化合物。

一般程序b1.毒素-接头化合物的制备。

具有上述r基团的本发明的毒素-接头化合物的合成涉及在式(i)上的羧酸部分与所选接头上的胺之间形成酰胺键以提供式(ii)。

将式(i)的毒素(0.47mmol,1.0当量)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡锭3-氧化物六氟磷酸盐(hatu)(0.58mmol,1.2当量)和diea(许尼希碱(hunigsbase)，0.1ml)于dmf(2.0ml)中的混合物在环境温度下搅拌60分钟。向所述混合物中添加接头(0.50mmol,1.06当量)以及diea(许尼希碱)(0.1ml)。将所得混合物搅拌30分钟。对反应物进行水处理。通过快速色谱法进一步纯化获得含有毒素偶联至接头的所需式(ii)产物。

一般程序b2.毒素-接头化合物的制备。或者，具有上述r和l基团的本发明的毒素-接头化合物的合成可如方案(i)、方案(ii)或方案(iii)中所示来制备。

一般程序c1。抗体-药物缀合物的制备。将市售治疗性抗体(ab)透析到杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco'sphosphatebufferedsaline/dpbs，lonza)中。然后在50mm硼酸盐缓冲液(ph8.7)中使透析抗体(5-10mg/ml)与含有反应性n-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺的二甲亚砜(dmso)中的10mm式(ii)的毒素-接头化合物(3-12当量)在室温下反应2小时。在一些情况下，50mm硼酸盐缓冲液(ph8.7)由杜贝克氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs，lonza)取代。在一些情况下，为改善接头-毒素的溶解性/反应性，添加二甲基乙酰胺(dma)或dmso以达到最终反应混合物中10-15％(v/v)的总有机溶剂组分。然后使用gehealthcaresephadexg-25m缓冲液交换柱，按照制造商说明书将反应混合物缓冲液交换至dpbs(ph7.4)中。使用geaktaexplorer系统与gesuperdex200柱和dpbs(ph7.4)洗脱液，通过尺寸排阻色谱法(sec)纯化粗物质。然后使用gehealthcaresephadexg-25m缓冲液交换柱，按照制造商说明书，将来自akta的合并单体洗脱份浓缩且缓冲液交换至10mm琥珀酸钠缓冲液、5.4％海藻糖(ph5.1)中。adc(式(iii))经由针对纯度的尺寸排阻色谱法(sec)和用于计算药物-抗体比率(载量)的液相色谱法电喷雾电离串联质谱法(lc-esims)来进一步表征。经由uv分光光度计测定蛋白质浓度。

一般程序c2。抗体-药物缀合物的替代制备。或者，在还原和再氧化以准备缀合后，将经半胱氨酸工程改造的抗体溶解在pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中并在冰上冷却。将过量的约1.5摩尔至20当量的用硫醇反应性基团(例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺或溴乙酰胺)活化的式(ii)的药物-接头中间体溶解在dmso中，在乙腈和水中稀释，并添加到于pbs中的经冷却、还原并再氧化的抗体中。通常，将药物-接头从浓度为约20mm于50mmtris(ph8)中的dmso储备液添加到抗体中并监测约1至约24小时，直到如通过反应混合物的lc-ms分析测定反应完成为止。当反应完成时，添加过量的封端试剂(例如乙基马来酰亚胺)以淬灭反应，并使任何未反应的抗体硫醇基团封端。可装载缀合混合物并通过hitrapspff柱洗脱以去除过量药物-接头和其它杂质。通过离心超滤浓缩反应混合物，并通过经pbs中的g25树脂洗脱使经半胱氨酸工程改造的抗体-药物缀合物纯化并脱盐，在无菌条件下经0.2μm过滤器过滤，并冷冻储存。

例如，将粗制抗体-药物缀合物在用20mm琥珀酸钠(ph5)稀释后施加到阳离子交换柱。用至少10个柱体积的20mm琥珀酸钠(ph5)洗涤所述柱，并用pbs洗脱抗体。使用凝胶过滤柱，用240mm蔗糖将抗体-药物缀合物配制到20mmhis/乙酸盐(ph5)中。通过测定蛋白质浓度的uv光谱、用于聚集分析的分析型sec(尺寸排阻色谱法)和用赖氨酸c肽链内切酶处理之前和之后的lc-ms来表征抗体-药物缀合物。

实施例1

(z)-苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-4-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯(化合物1)的合成

部分a：

步骤1.4-羟基戊-2-炔酸叔丁酯，化合物2a。在-78℃下向丙炔酸叔丁酯化合物1a(10g,79.28mmol)于thf(600ml)中的溶液中添加lda(2.0m于thf中)(43.6ml,87.20mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌50分钟，然后在相同温度下滴加乙醛(4.45ml,79.28mmol)。将反应混合物在相同温度下搅拌2小时。通过tlc(于石油醚中的25％etoac，rf＝0.2，kmno4活性)监测反应进展直到起始材料耗尽为止。用饱和nh4cl水溶液(400ml)淬灭反应混合物并搅拌20分钟。然后于二乙醚(2×400ml)中萃取产物，并经无水硫酸钠干燥。将溶剂在减压下去除并分离粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的20％etoac洗脱液)纯化产物，得到呈黄色液体的化合物2a(7g,52％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝5.66(d,j＝5.7hz,1h),4.50(五重峰,j＝6.4hz,1h),1.43(s,9h),1.32(d,j＝6.6hz,3h)。

步骤2.苯甲酸5-(叔丁氧基)-5-氧代戊-3-炔-2-基酯(化合物3a)的合成。将化合物2a(2g,11.76mmol)于无水dcm(60ml)中的溶液冷却到-10℃，然后添加三乙胺(8.02ml,58.82mmol)和dmap(143mg,1.176mmol)。5分钟后，将苯甲酰氯(1.36ml,11.764mmol)滴加到反应混合物中。使反应混合物经2小时升温至室温。通过tlc(于石油醚中的10％etoac，rf＝0.5，uv和kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，用dcm(200ml)稀释反应混合物，然后用水和盐水溶液(1×60ml)洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将溶剂在减压下去除并通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的6％etoac洗脱液)进行纯化，得到呈黄色胶状液体的化合物3a(1.35g,42％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝7.99(d,j＝7.5hz,2h),7.74-7.67(m,1h),7.60-7.53(m,2h),5.76(q,j＝6.7hz,1h),1.62(d,j＝6.8hz,3h),1.44(s,9h)。

步骤3.苯甲酸5-(叔丁氧基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物4a。在氩气吹扫下向化合物3a(1g,3.64mmol)于etoac:己烷(30ml+10ml)中的溶液中添加喹啉(0.4ml)和林德拉催化剂(496mg,4.67mmol)。吹扫5分钟后，将反应混合物在氢气囊压力下搅拌3小时。通过tlc(于石油醚中的5％etoac，rf＝0.3，uv和kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，经由硅藻土过滤反应混合物，将滤液在真空下浓缩，并分离粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶，于石油醚中的12％etoac洗脱液)纯化粗产物并浓缩并真空干燥，得到呈黄色液体的化合物4a(600mg,60％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝7.97(d,j＝7.5hz,2h),7.70-7.63(m,1h),7.57-7.49(m,2h),6.39-6.27(m,2h),5.79(d,j＝10.3hz,1h),1.50-1.38(m,12h)。

步骤4.(z)-4-(苯甲酰基氧基)戊-2-烯酸，化合物5a。将化合物4a(600mg,2.173mmol)于无水dcm(20ml)中的搅拌溶液冷却到-10℃，并向反应混合物中滴加三氟乙酸(2.4ml)。使反应混合物升温至25℃并搅拌3小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.15，uv和kmno4活性)监测反应进展直到起始材料耗尽为止。反应完成后，用于正戊烷中的50％二乙醚(2×10ml)洗涤粗产物并真空干燥，得到呈灰白色固体的化合物5a(220mg,46％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝12.64(brs,1h),7.97(d,j＝7.5hz,2h),7.70-7.64(m,1h),7.57-7.50(m,2h),6.44-6.32(m,2h),5.84(d,j＝10.7hz,1h),1.43(d,j＝6.1hz,3h)；d2o(400mhz,dmso-d6)δ＝8.01-7.94(m,2h),7.70-7.63(m,1h),7.58-7.51(m,2h),6.44-6.34(m,2h),5.89-5.83(m,1h),1.44(d,j＝6.1hz,3h)；lcms：95.41％(221.23,m+h),rt＝2.08分钟。

部分b：

步骤1.(4s,5r)-2,2,5-三甲基噁唑烷-3,4-二甲酸3-叔丁酯4-甲酯，化合物2b。在23℃下将2,2-二甲氧基丙烷(159.1ml,1285mmol)添加到化合物1b(150g,642mmol)于dcm(1500ml)中的搅拌溶液中，并添加三氟化硼合二乙醚(3.96ml,32.13mmol)。接着将反应混合物在23℃下搅拌30分钟。通过tlc(于己烷中的50％etoac；rf：0.6，pma可见)监测反应进展。反应完成后，用盐水(1000ml)使混合物淬灭。将有机层分离，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得粗产物。通过快速色谱法(于己烷中的1％至5％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物2b(145g,82.85％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ:1.36-1.42(m,9h)1.48(s,3h)1.54-1.67(m,6h)3.76(s,3h)3.86-4.02(m,1h)4.07-4.19(m,1h)。

步骤2.(4s,5r)-4-甲酰基-2,2,5-三甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯，化合物3b。在-78℃下向化合物2b(130g,475.6mmol)于无水甲苯(750ml)中的搅拌溶液中添加dibal-h(1分钟甲苯)(713ml,713mmol)。添加后，将混合物在-78℃下再搅拌10分钟且通过在-78℃下缓慢添加冷的meoh(220ml)来淬灭。将所得白色乳液倒入冰冷的1nhcl(2000ml)中并搅拌超过15分钟，然后用etoac(1000ml×2)萃取水性混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得粗产物。通过快速色谱法(于己烷中的1％至5％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物3b(100g,86.95％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ:1.36(d,j＝6.10hz,3h)1.40-1.52(m,9h)1.57-1.72(m,6h)3.67-3.84(m,1h)4.02-4.10(m,1h)9.36-9.47(m,1h)。

步骤3.(4r,5r)-2,2,5-三甲基-4-乙烯基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯，化合物4b。在0℃下向甲基三苯基溴化鏻(293g,822mmol)于thf(750ml)中的溶液中以整份添加kotbu(92g,822mmol)。将所得混合物在相同温度下搅拌1小时，然后添加于thf(250ml)中的化合物3b(100g,411mmol)，并将混合物在50℃下搅拌12小时。通过tlc(于己烷中的10％etoac，rf：0.5，pma可见)监测反应进展。在冷却到23℃后，将反应混合物用饱和nh4cl溶液(1000ml)淬灭，用etoac(1000ml×2)萃取。将合并的有机层用盐水(1000ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得粗制化合物。通过快速色谱法(于己烷中的1％至5％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物4b(80g,80.80％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.28(d,j＝5.99hz,3h)1.38-1.49(m,9h)1.51(s,3h)1.56-1.63(m,3h)3.72(brd,j＝1.31hz,1h)3.78-3.86(m,1h)5.16(brd,j＝7.85hz,2h)5.66(brd,j＝6.43hz,1h)。

步骤4.(3r,4r)-4-羟基戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯，化合物5b。在23℃下向化合物4b(80g,331.4mmol)于meoh(2.0l)中的搅拌溶液中添加樟脑磺酸(7.7g,33.14mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌48小时。通过tlc(于己烷中的40％etoac，rf：0.25，pma可见)监测反应进展。完成后，用饱和nahco3溶液(1000ml)淬灭反应混合物并在真空中去除大部分溶剂。用etoac(1000ml×2)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(1000ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得粗制化合物。通过快速色谱法(于己烷中的10％→40％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物5b(58g,86.95％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.23(d,j＝6.32hz,3h)1.46(s,9h)1.94(brs,1h)3.87(brdd,j＝5.99,3.05hz,1h)4.02-4.12(m,1h)4.87(brs,1h)5.21-5.26(m,1h)5.28-5.31(m,1h)5.84(ddd,j＝17.19,10.49,5.12hz,1h)；lcms：94.36％(202.14,m+h)，rt：1.50分钟。

步骤5.(3r,4r)-4-(2-甲基烯丙基氧基)戊-1-烯-3-基氨基甲酸叔丁酯，化合物6b。在23℃下向化合物5b(40g,198.73mmol)于dmf(250ml)中的搅拌溶液中添加甲基烯丙基溴(107.3g,795.9mmol)。将烧瓶用铝箔包裹并添加氧化银(69g,298mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌24小时。通过tlc(于己烷中的10％etoac，rf：0.4，pma可见)监测反应进展。在23℃下24小时后，用乙醚(500ml)稀释反应混合物，经由硅藻土过滤并用额外乙醚(500ml)洗涤。然后用水(5×500ml)、盐水(50ml)萃取滤液，经无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(于己烷中的2.5％→10％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物6b(40.5g,79.88％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.16(d,j＝6.32hz,3h)1.45(s,9h)1.68-1.77(m,3h)3.51-3.63(m,1h)3.75-3.86(m,1h)3.89-4.01(m,1h)4.12(brd,j＝7.08hz,1h)4.79-4.91(m,2h)4.94(d,j＝0.87hz,1h)5.09-5.25(m,2h)5.89(ddd,j＝17.22,10.46,5.45hz,1h)；lcms：78.48％(256.33,m+h)，rt：2.69分钟。

步骤6.((2r,3r)-2,5-二甲基-3,6-二氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物7b。在氮气气氛下在23℃下向化合物6b(35g,137mmol)于苯(500ml)中的搅拌溶液中添加grubbs-ii催化剂(2.3g,2.74mmol)。然后将反应物回流3小时。在冷却到23℃后，添加四乙酸铅(1.8g,4.11mmol)并在23℃下再搅拌12小时。通过tlc(于己烷中的10％etoac，rf＝0.3，pma可见)监测反应。然后在真空中去除溶剂并通过快速色谱法(于己烷中的2.5％→10％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈白色固体的化合物7b(26g,83.60％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.16-1.22(m,3h)1.44(s,9h)1.61(s,3h)3.57-3.66(m,1h)3.86-3.94(m,1h)3.97(s,1h)3.98-4.06(m,1h)4.60(brd,j＝9.66hz,1h)5.56-5.62(m,1h)；lcms：94.00％(228.29,m+h)，rt：2.35分钟。

步骤7.((2r,3r)-2,5-二甲基-6-氧代-3,6-二氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物8b。在23℃下向化合物7b(30g,132.1mmol)于苯(1200ml)中的搅拌溶液中添加硅藻土(120g)、重铬酸吡锭(99.3g,364.3mmol)和叔丁基过氧化氢(于水中70wt％，47.5ml，528.6mmol)。在23℃下5小时后，经由硅藻土过滤反应混合物，用乙酸乙酯(500ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(于己烷中的7.5％→30％etoac)于硅胶(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈白色固体的化合物8b(18g,56.60％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.38(d,j＝6.44hz,3h)1.42-1.49(m,9h)1.92-1.97(m,3h)4.21-4.31(m,1h)4.51-4.65(m,2h)6.63(dd,j＝6.32,1.43hz,1h)；lcms：96.91％(242.17,m+h)，rt：1.68分钟。

步骤8.((2r,3r,5s)-2,5-二甲基-6-氧代四氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物9b。在23℃下向化合物8b(25g,103.61mmol)于乙醇(500ml)中的搅拌溶液中添加pto2(470mg,2.07mmol)，并将反应烧瓶中的气氛变为氢气。将反应混合物在23℃下搅拌24小时并通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf＝0.35，pma可见)监测。在23℃下24小时后，经由滤纸过滤反应混合物并在真空中去除溶剂，得到呈白色固体的化合物9b(25g,99％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.16-1.25(m,4h)1.29-1.38(m,5h)1.39-1.54(m,12h)2.49-2.71(m,2h)4.03-4.19(m,1h)4.41-4.55(m,1h)4.64-4.82(m,1h)。

步骤9.((2r,3r,5s)-6-烯丙基-6-羟基-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物10b。在氮气气氛下在-78℃下沿烧瓶侧面向化合物9b(25g,102.7mmol)于thf(300ml)中的搅拌溶液中添加烯丙基氯化镁(于thf中的1.4m溶液，146ml，205.4mmol)。在相同温度下1.5小时后，用饱和nh4cl水溶液(500ml)淬灭反应物。用etoac(2×500ml)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(500ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(于己烷中的10％→50％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色油状物的化合物10b(20g,68.25％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.13(d,j＝7.2hz,3h)1.16(d,j＝6.3hz,3h)1.45(s,9h)1.93-2.03(m,1h)2.10-2.29(m,1h)2.68-2.80(m,1h)3.24-3.39(m,2h)3.65-3.76(m,1h)4.71(brd,j＝9.06hz,1h)5.05-5.22(m,2h)5.78-6.02(m,1h)。

步骤10.((2r,3r,5s,6s)-6-烯丙基-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物11b。在氮气气氛下在23℃下向化合物10b(5g,17.54mmol)于dcm(50ml)中的搅拌溶液中添加2,2,2-三氟乙醇(10ml,140.3mmol)和三乙基硅烷(28ml,175.4mmol)。将反应物冷却到-78℃并沿烧瓶侧面缓慢添加bf3·oet2复合物(8.6ml,70.16mmol)。在相同温度下另外3小时后，在-78℃下添加饱和nahco3水溶液(100ml)，并分离各层。用etoac(3×50ml)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤，并减压浓缩。通过快速色谱法(于己烷中的2％→12.5％etoac)于硅胶(100-200目)上纯化所得残余物，得到呈无色油状物的化合物11b(1.8g,38.29％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm0.98-1.07(m,3h)1.10-1.21(m,3h)1.45(d,j＝1.43hz,9h)1.68-1.81(m,1h)1.95(brd,j＝2.74hz,2h)2.03-2.20(m,1h)2.24-2.41(m,1h)3.37-3.68(m,3h)4.78(brd,j＝9.06hz,1h)4.98-5.15(m,2h)5.71-5.88(m,1h)；lcms：60.33％(270.33,m+h)，rt：2.74分钟。

步骤11.((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基-4-氧代丁-2-烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物12b。在氮气气氛下在23℃下向化合物11b(3.6g,13.36mmol)于dcm(50ml)中的搅拌溶液中添加甲基丙烯醛(22ml,267.2mmol)，接着添加硝基-grela催化剂(897mg,1.336mmol)。在23℃下12小时后，在真空中去除溶剂。通过快速色谱法(于己烷中的10％→25％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色油状物的化合物12b(2.2g,52.88％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.07(d,j＝7.34hz,3h)1.16(d,j＝6.36hz,3h)1.45(s,9h)1.76(s,3h)1.85-1.99(m,2h)2.34-2.45(m,1h)2.56(dt,j＝15.41,7.46hz,1h)3.53-3.68(m,3h)4.73(brd,j＝9.29hz,1h)6.50-6.57(m,1h)9.42(s,1h)；lcms：86.69％(312.31,m+h)，rt：2.52分钟。

步骤12.((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物13b。在氮气气氛下在0℃下向甲基三苯基溴化鏻(3.7g,10.59mmol)于thf(25ml)中的搅拌悬浮液中添加kotbu(1.1g,9.88mmol)。30分钟后，在相同温度下通过套管滴加于thf(15ml)中的化合物12b(2.2g,7.064mmol)，并用额外thf(5ml)冲洗。在23℃下2小时后，用饱和nh4cl水溶液(50ml)淬灭反应物，并在真空中去除大部分溶剂。用etoac(2×30ml)萃取水性残余物。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(于己烷中的1％→10％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈无色油状物的化合物13b(1.5g,68.80％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.03(d,j＝7.41hz,3h)1.15(d,j＝6.32hz,3h)1.44(s,9h)1.72-1.80(m,3h)1.84-1.97(m,2h)2.19-2.30(m,1h)2.33-2.44(m,1h)3.51(td,j＝7.28,2.67hz,1h)3.54-3.66(m,2h)4.69-4.81(m,1h)4.95(d,j＝10.68hz,1h)5.11(d,j＝17.44hz,1h)5.46(t,j＝6.98hz,1h)6.37(dd,j＝17.38,10.74hz,1h)；lcms：94.58％(310.37,m+h)，rt：2.96分钟。

步骤13.(2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-胺，化合物8。在氮气气氛下在23℃下向化合物13b(1.5g,4.84mmol)于dcm(40ml)中的搅拌悬浮液中添加溴化锌(5.45g,24.23mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌48小时。通过tlc(于dcm中的10％meoh，rf＝0.1，uv可见)监测反应进展。完成后，用dcm(50ml)稀释反应混合物，过滤，用dcm(100ml)洗涤，将滤液真空浓缩，得到呈淡黄色胶状物的化合物8(1.6g粗制)。其不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.03-1.20(m,3h)1.23-1.32(m,3h)1.34-1.43(m,3h)1.73-1.81(m,3h)1.88-2.00(m,1h)2.09-2.54(m,3h)3.42-3.53(m,1h)3.58(brd,j＝5.87hz,1h)3.66-3.89(m,2h)4.87-5.04(m,1h)5.08-5.21(m,1h)5.36-5.53(m,1h)6.19-6.46(m,1h)6.70-7.12(m,3h)；lcms：81.62％(210.18,m+h)，rt：1.80分钟。

部分c：

步骤1.(2r,3r)-3-羟基-2-(羟基甲基)-2h-吡喃-4(3h)-酮(化合物2c)的合成。在室温下向化合物1c(137.5g，0.941摩尔)、pd(oac)2(5.9g,0.026摩尔)于acn(550ml)中的混合物中添加乙酸乙烯酯(250g，2.907摩尔)。将反应混合物在60℃下搅拌24小时。经由硅藻土过滤反应混合物并用etoac(100ml)洗涤。将溶剂减压浓缩，获得粗产物。使残余物从丙酮(68ml)和etoac(68ml)的混合物中重结晶，得到呈灰白色固体的化合物2c(75g,55％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝7.60(d,j＝5.9hz,1h),5.61(d,j＝4.9hz,1h),5.30(d,j＝5.4hz,1h),5.00(t,j＝5.6hz,1h),4.16-4.06(m,2h),3.82-3.76(m,1h),3.73-3.66(m,1h)。

步骤2.(2r,3r)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-2h-吡喃-4(3h)-酮，化合物3c。在室温下向化合物2c(100g,0.69mol)于dmf(1900ml)中的溶液中添加tbs-cl(277g,2.65mol)和咪唑(140.9g,2.07mol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。通过tlc(于石油醚中的5％etoac，rf：0.5，uv活性)监测反应进展。反应完成后，用二乙醚(2500ml)稀释反应混合物，并用水(1000ml)和盐水(1000ml)洗涤。使二乙醚层经无水硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的2％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈灰白色固体的化合物3c(200g,77.5％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝7.30-7.25(m,1h),5.30(d,j＝5.8hz,1h),4.45-4.40(m,1h),4.18(td,j＝2.6,12.2hz,1h),3.99(d,j＝2.8hz,2h),0.91(d,j＝2.5hz,18h),0.23(s,3h),0.11-0.05(m,6h)；lcms：99.48％(373.37,m+h)，rt：3.47分钟。

步骤3.2-((2s,5r,6r)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-4-氧代四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物4c。在室温下向化合物3c(55g,0.147mol)于dcm(2000ml)中的搅拌溶液中添加叔丁基(1-甲氧基乙烯基氧基)二甲基硅烷(55g,0.292mol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，接着在-78℃下添加bf3.et2o(63.25g,3.03mol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时。通过tlc(于石油醚中的15％etoac，rf：0.5，pma活性)监测反应进展。用饱和nh4cl(500ml)淬灭反应混合物并用dcm(2×250ml)萃取。将合并的有机层用饱和nahco3(500ml)和盐水(500ml)洗涤。使有机层经无水硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的3％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈透明胶状物的化合物4c(25g,37.9％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝4.92-4.72(m,1h),4.33(d,j＝8.8hz,1h),3.91-3.78(m,2h),3.74-3.58(m,4h),2.83-2.60(m,2h),2.52-2.38(m,2h),0.99-0.79(m,18h),0.15(s,3h),0.11-0.01(m,9h)。

步骤4.2-((2s,5s,6r)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-4-亚甲基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物5c。在0℃下向甲基三苯基溴化鏻(12g,0.033mol)于thf(180ml)中的悬浮液中添加kotbu(3.33g,0.029mol)的thf(80ml)溶液。1小时后，滴加化合物4c(10g，0.022摩尔)的thf(60ml)溶液。然后使反应混合物达到25℃并搅拌1小时。通过tlc(于石油醚中的5％etoac，rf＝0.3，pma活性)监测反应进展。用饱和nh4cl(100ml)淬灭反应混合物并用etoac(2×150ml)萃取。使etoac层经无水硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的5％etoac洗脱液)纯化粗制残余物，得到呈黄色液体的化合物5c(4g,40.4％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝5.07(s,1h),4.89-4.86(m,1h),4.30-4.23(m,1h),4.02(d,j＝6.5hz,1h),3.75-3.66(m,5h),3.47(td,j＝4.7,6.4hz,1h),2.65(dd,j＝7.3,15.0hz,1h),2.48(dd,j＝6.8,15.0hz,1h),2.42-2.28(m,2h),0.95-0.84(m,18h),0.12-0.01(m,12h)。

步骤5.2-((2s,5s,6r)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-(羟基甲基)-4-亚甲基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物6c。在室温下向化合物5c(75.1g，0.168摩尔)于meoh(751ml)中的搅拌溶液中添加ppts(59.4g，0.236摩尔)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过tlc(于石油醚中的25％etoac，rf＝0.3，pma活性)监测反应进展。用饱和nahco3(1270ml)淬灭反应混合物并用etoac(2×1500ml)萃取。使etoac层经无水硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的25％etoac洗脱液)纯化粗制残余物，得到呈黄色胶状物的化合物6c(39g,69.8％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝5.11(s,1h),4.88(s,1h),4.42-4.35(m,1h),3.93(d,j＝7.3hz,1h),3.71-3.64(m,5h),3.56-3.50(m,1h),2.73(dd,j＝8.8,15.4hz,1h),2.51-2.42(m,2h),2.31(dd,j＝3.8,13.4hz,1h),2.15(t,j＝6.4hz,1h),0.94-0.91(m,9h),0.10-0.08(m,3h),0.05-0.03(m,3h)；lcms：80.17％(331.39,m+h)，rt：2.78分钟。

步骤6.2-((2s,5s,6s)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-6-甲酰基-4-亚甲基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物7c。在-78℃下向草酰氯(17.2g,0.136mol)于dcm(214ml)中的搅拌溶液中缓慢添加dmso(21g,0.27mol)。将反应混合物在-78℃至-60℃下搅拌20分钟。在-78℃下滴加化合物6c(30g,0.09mol)于dcm(414ml)中的溶液，持续30分钟。使反应混合物经30分钟缓慢升温至-45℃。在-45℃下添加tea(52.8g,0.522mol)，并使反应混合物经10分钟升温至0℃。通过tlc(于石油醚中的20％etoac，rf＝0.35，pma活性)监测反应进展。用饱和nh4cl(500ml)淬灭反应混合物并用dcm(2×500ml)萃取。将有机层用盐水(1000ml)洗涤。使有机层经无水硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的20％etoac洗脱液)纯化粗制残余物，得到呈黄色胶状物的化合物7c(22g,73.8％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝9.76-9.73(m,1h),5.05-5.00(m,1h),4.93-4.87(m,1h),4.36(d,j＝4.3hz,1h),4.29-4.20(m,1h),4.12-4.08(m,1h),3.73-3.67(m,4h),2.78-2.69(m,1h),2.55-2.40(m,1h),2.27-2.20(m,2h),0.96-0.87(m,9h),0.12--0.02(m,6h)；lcms：97.53％(329.34,m+h)，rt：2.60分钟。

步骤7：2-((2s,5s,6r)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-4-亚甲基-6-乙烯基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物8c。在0℃下向甲基三苯基溴化鏻(28g,0.078mol)于thf(381ml)中的悬浮液中添加kotbu(7.9g,0.070mol)。1小时后，滴加化合物7c(14g，0.042摩尔)的thf(1361ml)溶液。将混合物在0℃下搅拌1小时。通过tlc(于石油醚中的10％etoac，rf＝0.5，pma活性)监测反应进展。用饱和nh4cl(1200ml)淬灭反应混合物并用etoac(2×500ml)萃取。将etoac层用盐水(1000ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的2％etoac洗脱液)纯化粗制残余物，得到呈透明胶状物的化合物8c(5.8g,41.7％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm0.04(d,j＝7.08hz,6h)0.88-0.95(m,9h)2.30-2.39(m,1h)2.40-2.57(m,2h)2.70(dd,j＝14.99,7.47hz,1h)3.62-3.71(m,3h)3.83(d,j＝6.65hz,1h)3.90-3.99(m,1h)4.37(tt,j＝6.96,4.81hz,1h)4.88(d,j＝0.65hz,1h)5.09(s,1h)5.18-5.37(m,2h)5.83(ddd,j＝17.17,10.74,6.10hz,1h)。

步骤8.2-((2s,5s,6r)-5-羟基-4-亚甲基-6-乙烯基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸甲酯，化合物9c。在0℃下向化合物8c(5.6g，0.017摩尔)于thf(52ml)中的搅拌溶液中添加tbaf(5.15g，0.019摩尔，1m于thf中)。将反应混合物在室温下搅拌8小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.2，pma活性)监测反应进展。用饱和nh4cl(100ml)淬灭反应混合物并用etoac(2×300ml)萃取。将有机层用盐水(600ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的20％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈黄色胶状物的化合物9c(2.5g,68.8％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.97-2.08(m,1h)2.33-2.55(m,3h)2.68(dd,j＝15.13,7.67hz,1h)3.69(s,3h)3.93(t,j＝5.48hz,1h)4.06-4.14(m,1h)4.34(dt,j＝12.44,6.17hz,1h)4.95(s,1h)5.12(s,1h)5.26-5.42(m,2h)5.86(ddd,j＝17.26,10.80,6.14hz,1h)。

步骤9.2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-乙烯基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物9。将化合物9c(1.1g,0.0051mol)溶解在dcm(86ml)中并冷却到-20℃。向其中添加乙酰乙酸氧钒(125mg,0.00047mol)，接着添加叔丁基过氧化氢溶液(1.71ml,0.017mol)。使混合物经2小时缓慢升温至0℃。将反应混合物在室温下搅拌24小时。通过tlc(于石油醚中的40％etoac，rf＝0.2，pma活性)监测反应进展。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的35％etoac洗脱液)纯化反应混合物，得到呈无色胶状物的化合物9(600mg)。¹hnmr(300mhz，氯仿-d)δppm1.76-1.93(m,2h)1.99-2.14(m,2h)2.60-2.74(m,2h)2.84-3.02(m,2h)3.43-3.55(m,1h)3.70(s,3h)4.17-4.29(m,1h)4.42-4.55(m,1h)5.26-5.45(m,2h)5.93(ddd,j＝17.45,10.69,5.48hz,1h)。

部分d：

步骤1.(z)-苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物1d。在室温下向化合物8(200mg,0.955mmol)和化合物5a(126mg,0.573mmol)于thf(10ml)中的搅拌溶液中添加dipea(616mg，4.755毫摩尔)和(50％于etoac中)(911mg,2.865mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过tlc(于石油醚中的20％etoac，rf＝0.5，uv活性)监测反应进展直到起始材料耗尽为止。将反应溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的12％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈无色胶状物的化合物1d(120mg,30％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm8.01-8.11(m,2h)7.50-7.62(m,1h)7.39-7.47(m,2h)6.47-6.57(m,1h)6.26-6.44(m,2h)5.92-6.08(m,2h)5.70-5.80(m,1h)5.39-5.51(m,1h)5.11(d,j＝17.33hz,1h)4.96(d,j＝10.79hz,1h)3.92-4.04(m,1h)3.63-3.73(m,1h)3.50-3.58(m,1h)2.41(dq,j＝15.10,7.61hz,1h)2.21-2.33(m,1h)1.89-2.02(m,3h)1.72-1.84(m,5h)1.48-1.59(m,8h)1.23-1.30(m,3h)1.13-1.20(m,4h)1.01-1.09(m,4h)0.81-0.96(m,2h)；lcms：85.71％(412.37,m+h)，rt：2.92和2.94分钟。

步骤2.(z)-苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-4-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯(化合物1)。在氩气气氛下在室温下向化合物1d(115mg,0.279mmol)于dcm(5ml)中的搅拌溶液中添加化合物9(181mg,2.83mmol)和grubbs-ii催化剂(47mg,0.055mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌4小时。通过tlc监测反应进展，其显示两种起始材料均仍存在。经由硅藻土过滤反应混合物并用dcm(5ml)洗涤。将溶剂减压浓缩成残余物。将残余物再次溶解在dcm(5ml)中并添加grubbs-ii催化剂(47mg,0.055mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌23小时。通过tlc(于石油醚中的50％etoac，rf＝0.1，uv活性)监测反应进展直到化合物9耗尽为止。

经由硅藻土过滤反应混合物并用dcm(2ml)洗涤。将溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc，流动相b：乙腈；柱：x-bridge(150×19)mm,5u；方法：(t/％b)：0/30、2/30、20/30、20/60、20.5、90、22/90；流速：18ml/min；溶解性：acn+thf+水；环境温度]纯化粗产物。将洗脱份冻干，获得呈灰白色固体的纯化合物1(11mg,6％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm7.98-8.10(m,2h)7.49-7.59(m,1h)7.37-7.48(m,2h)6.47-6.57(m,1h)6.33-6.45(m,2h)6.28(brd,j＝8.99hz,1h)5.93-6.09(m,1h)5.72-5.81(m,1h)5.62(dd,j＝15.79,6.14hz,1h)5.47-5.56(m,1h)4.44-4.54(m,1h)4.21(brt,j＝6.58hz,1h)3.99(brdd,j＝4.82,2.63hz,1h)3.62-3.75(m,4h)3.47-3.57(m,2h)2.86-3.02(m,2h)2.53-2.74(m,2h)2.33-2.48(m,1h)2.20-2.31(m,3h)2.10-2.18(m,1h)1.89-2.04(m,4h)1.69-1.86(m,7h)1.38-1.50(m,3h)1.22-1.33(m,3h)1.14-1.20(m,3h)1.01-1.11(m,3h)0.79-0.93(m,1h)；lcms：93.71％(612.49,m+h)，rt：5.09,5.13分钟。

实施例2

(z)-4-氟苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-4-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯(化合物2)的合成

部分a：

步骤1.4-氟苯甲酸5-(叔丁氧基)-5-氧代戊-3-炔-2-基酯，化合物2e。将化合物1e(1g,9.41mmol)于无水dcm(50ml)中的溶液冷却到-10℃，然后添加三乙胺(6.41ml,47.05mmol)和dmap(115mg,0.941mmol)。5分钟后，将4-氟苯甲酰氯(1.43ml,12.233mmol)滴加到反应混合物。使反应混合物经2小时冷却到室温。通过tlc(于石油醚中的10％etoac，rf＝0.3，uv和kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，用dcm(100ml)稀释反应混合物，然后用水和盐水溶液(1×50ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。将溶剂在减压下去除并分离粗制化合物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的5％etoac洗脱液)纯化粗制化合物，得到呈灰白色固体的化合物2e(900mg,53％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ＝8.12-8.04(m,2h),7.17-7.07(m,2h),5.76(q,j＝6.8hz,1h),1.67(d,j＝6.8hz,3h),1.49(s,9h)。

步骤2.4-氟苯甲酸5-(叔丁氧基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物3e。在氩气吹扫下向化合物2e(900mg,3.08mmol)于etoac:己烷(30ml+10ml)中的溶液中添加喹啉(0.5ml)和林德拉催化剂(520mg,4.88mmol)。吹扫5分钟后，将反应混合物在氢气囊压力下搅拌3小时。通过tlc(于石油醚中的10％etoac，rf＝0.36，uv和kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，经由硅藻土过滤反应混合物，将滤液在真空下浓缩并分离粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶；于石油醚中的6％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈黄色胶状液体的化合物3e(605mg,66％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝8.04(dd,j＝5.6,8.7hz,2h),7.36(t,j＝8.8hz,2h),6.38-6.28(m,2h),5.83-5.76(m,1h),1.50-1.40(m,12h)；lcms：85.63％(295.16,m+h)，rt：4.30分钟。

步骤3.(z)-4-((4-氟苯甲酰基)氧基)戊-2-烯酸，化合物4e。将化合物3e(600mg,2.04mmol)于无水dcm(20ml)中的搅拌溶液冷却到-10℃，并将三氟乙酸(2.4ml)滴加到反应混合物中。使反应混合物升温至25℃并搅拌3小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.15，uv和kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩并且将粗制化合物用于正戊烷中的50％二乙醚(2×10ml)洗涤并真空干燥，得到呈灰白色固体的化合物4e(383mg,78％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ＝12.64(brs,1h),8.03(dd,j＝5.6,8.7hz,2h),7.36(t,j＝8.9hz,2h),6.43-6.32(m,2h),5.84(d,j＝10.5hz,1h),1.43(d,j＝6.1hz,3h)；d2o(400mhz,dmso-d6)δ＝8.07-8.02(m,2h),7.39-7.33(m,2h),6.42-6.33(m,2h),5.88-5.83(m,1h),1.46-1.41(m,3h)。

部分b：

步骤1.(z)-4-氟苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯(化合物1f)。在室温下向化合物8(400mg,1.91mmol)、化合物4e(273mg,1.14mmol)于thf(12ml)中的搅拌溶液中添加dipea(1.23g,9.55mmol)和t3p(1.82g)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.2，pma活性)监测反应进展。将反应混合物减压浓缩。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的10％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈无色胶状物的化合物1f(220mg)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm0.99-1.08(m,3h)1.11-1.20(m,3h)1.36-1.44(m,3h)1.47-1.55(m,5h)1.69-1.85(m,4h)1.89-2.03(m,2h)2.19-2.32(m,1h)2.34-2.49(m,1h)3.49-3.59(m,1h)3.62-3.75(m,1h)3.91-4.04(m,1h)4.87-5.01(m,1h)5.11(d,j＝17.44hz,1h)5.47(brd,j＝3.81hz,1h)5.76(ddd,j＝11.61,5.94,1.20hz,1h)5.88-6.09(m,2h)6.18-6.58(m,3h)7.05-7.16(m,2h)7.99-8.10(m,2h)；lcms：87.8％(430.07,m+h)，rt：2.50分钟。

步骤2.(z)-4-氟苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-4-羟基-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物2。在氩气气氛下在室温下向化合物1f(100mg,0.232mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加化合物9(150mg，0.657毫摩尔)和grubbs-ii催化剂(41mg,0.2mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(于石油醚中的50％etoac，rf＝0.1，uv活性)监测反应进展。经由硅藻土过滤反应混合物并用dcm(2ml)洗涤。将溶剂减压浓缩。通过制备型hplc[xbridge柱(150×19)mm,5u；流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；方法：-(t/％b)：0/30、2/30、20/30；流速：-18ml/min；溶解性：-acn+thf+水；环境温度]纯化粗产物。将所得洗脱份冻干，获得呈白色固体的纯化合物2(5.8mg)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm0.99-1.09(m,3h)1.13-1.20(m,3h)1.22-1.36(m,1h)1.52(brs,1h)1.69-1.84(m,7h)1.88-2.05(m,3h)2.10-2.31(m,2h)2.33-2.47(m,1h)2.60-2.78(m,2h)2.88-3.04(m,2h)3.48-3.58(m,2h)3.62-3.76(m,4h)3.98(brdd,j＝5.26,2.85hz,2h)4.10-4.24(m,1h)4.40-4.56(m,1h)5.52(brs,1h)5.58-5.68(m,1h)5.72-5.81(m,2h)5.89-6.10(m,2h)6.32-6.58(m,2h)7.10(t,j＝8.55hz,1h)7.95-8.11(m,2h)；lcms：94.37％(630.16,m+h)，rt：4.73分钟和4.77分钟。

实施例3

2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物3)的合成

部分a：

步骤1.2-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)丙酸乙酯，化合物2g。在25℃下向化合物1g于acn(100ml)中的搅拌溶液中添加cs2co3(125.6g,386.15mmol)和2-溴丙酸乙酯(39.43ml,283.15mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时。通过tlc(于dcm中的5％meoh，rf＝0.5，pma活性)监测反应进展。反应完成后，将反应混合物过滤并用etoac(300ml)洗涤。将滤液用水(2×200ml)、盐水(2×200ml)洗涤。使有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，获得35g粗产物。通过正相柱色谱法，使用二氧化硅(100-200目)用于dcm中的2％meoh洗脱来纯化粗产物。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物2g(30g,59.17％)。通过noe分析证实所需异构体。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm：5.22-5.34(m,1h),4.03-4.18(m,2h),2.32(s,3h),2.16(s,3h),1.60(d,j＝7.23hz,3h),1.06-1.19(m,3h)；lcms：75.07％(198.17,m+h),rt＝1.18分钟。

步骤2.2-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)-n-甲氧基-n-甲基丙酰胺，化合物3g。向化合物2g(5g,25.38mmol)于无水thf(10ml/mmol)中的搅拌溶液中添加n,o-二甲基羟胺盐酸盐(4.9g50.76mmol)，然后在0℃下缓慢添加异丙基氯化镁氯化锂复合物(58.57ml，76.14mmol，1.3m于thf中)。将混合物在室温下搅拌3小时。通过tlc(纯etoac，rf＝0.3，pma活性)监测反应进展。反应完成后，将其用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取并用硫酸钠干燥。将溶剂减压蒸发，获得呈淡黄色胶状物的化合物3g(3.9g,73.58％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm：5.27(m,1h),3.38(s,3h),3.21(s,3h),2.43(s,3h),2.34(s,3h),1.66(s,3h),1.61(d,3h)；lcms：79.07％(213.01,m+h),rt＝1.40分钟。

步骤3.2-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)丙醛，化合物4g。向化合物3g(3.9g,18.39mmol)于thf(8ml)中的搅拌溶液中添加lah(10.11ml，20.23mmol，2.0m于thf中)。添加后，将反应混合物在0℃下搅拌2小时。通过tlc(纯etoac，rf＝0.25，2,4-dnp活性)监测反应进展。反应完成后，将其用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取并经无水硫酸钠干燥。将溶剂减压蒸发，获得化合物4g(2.6g,92％)。粗产物不经纯化即用于下一步骤。通过¹hnmr证实醛化合物。

步骤4.(z)-4-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)戊-2-烯酸甲酯，化合物5g。在-75℃下向2-(双(2,2,2-三氟乙氧基)磷酰基)乙酸甲酯(5.4g,16.9mmol)于无水thf(10ml)中的搅拌溶液中添加18-冠-6(22.43g,84.96mmol)和khmds(16.99ml，16.99mmol，1.0m于thf中)，并将反应混合物搅拌20分钟。然后将于(5ml)thf中的化合物4g(2.6g,16.993mmol)添加到反应混合物中，使其升温至25℃并搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.3，uv活性)监测反应进展。反应完成后，将其用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取产物，并经无水硫酸钠干燥。将溶剂减压蒸发，获得3g粗产物。通过二氧化硅柱使用于己烷中的50％etoac纯化粗产物。通过uv鉴别所收集洗脱份中的产物，将其减压蒸发，获得呈淡黄色胶状物的化合物5g(500mg,14.08％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm：6.48-6.53(dd,j＝8.8hz1h),6.19-6.23(m,1h),5.87-5.84(d,j＝1.2hz1h),3.76(s,3h),2.42(s,3h),2.34(s,3h),1.58-1.60(d,3h)；lcms：74.79％(210.11,m+h),rt＝1.24分钟。

步骤5.(z)-4-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)戊-2-烯酸，化合物6g。向化合物5g(500mg,16.99mmol)于thf(8ml)和水(2ml)中的搅拌溶液中添加lioh.h2o(120.57g,2.87mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过tlc(于dcm中的20％meoh，rf＝0.4，uv活性)监测反应进展。反应完成后，将溶剂减压蒸发，获得粗产物，其用酸和碱处理进行处理。将粗制化合物溶解在1ml水中并用二乙醚(5ml)萃取。用饱和柠檬酸(0.2ml,ph＝5)使经分离的水层酸化，并用于dcm中的20％meoh(2×20ml)萃取。使经分离的有机层经无水硫酸钠干燥，并将溶剂减压蒸发，获得300mg所需产物。将这种300mg最终产物与早期批次(80mg,lcms97％)合并，用水(1ml)洗涤并将所过滤固体真空干燥，获得呈灰白色固体的化合物6g(240mg,39.02％)。烯烃双键的jj恒定偶联指示所述化合物是z几何异构体。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm：12.76(brs,1h),6.36(dd,j＝11.18,8.99hz,1h),6.00-6.16(m,1h),5.83(d,j＝11.40hz,1h),2.30(s,3h),2.18(s,3h),1.48(d,j＝6.58hz,3h)；lcms：98.64％(196.22,m+h),rt＝1.10分钟。

部分b：

步骤1.(z)-4-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)-n-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基)戊-2-烯酰胺，化合物1h。在室温下向化合物8(300mg,1.435mmol)、化合物6g(167.6mg,0.85mmol)于thf(10ml)中的搅拌溶液中添加dipea(924mg，7.15毫摩尔)和t3p(50％于etoac中)(1.36g,4.29mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。通过tlc(etoac，rf＝0.1，uv活性)监测反应进展。将反应溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的90％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈无色胶状物的化合物1h(130mg,23.5％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.53(brd,j＝1.96hz,1h)6.23-6.42(m,2h)5.81-5.94(m,1h)5.68-5.78(m,1h)5.45(brt,j＝7.09hz,1h)5.30(s,2h)5.05-5.16(m,1h)4.88-5.03(m,1h)4.12(q,j＝7.34hz,3h)3.89-3.99(m,1h)3.64-3.76(m,1h)3.51-3.60(m,1h)2.72-2.90(m,1h)2.32-2.50(m,7h)2.19-2.29(m,2h)2.08-2.14(m,3h)2.05(s,5h)1.87-1.98(m,3h)1.70-1.85(m,4h)1.59(dd,j＝6.60,3.18hz,3h)1.39-1.46(m,3h)1.19-1.33(m,11h)1.09-1.19(m,3h)1.01(brdd,j＝16.14,7.34hz,3h)0.81-0.92(m,2h)；lcms：82.3％(387.38,m+h)，rt：2.31,2.35分钟。

步骤2.2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(3,5-二甲基-1h-1,2,4-三唑-1-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物3。在氩气气氛下在室温下向化合物1h(100mg,0.258mmol)和化合物9(100mg,0.438mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加grubbs-ii催化剂(65.7mg,0.0774mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(100％etoac，uv活性)监测反应进展。经硅藻土垫过滤反应混合物并用dcm(2ml)洗涤。将溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；柱：x-bridge(150×19mm),5u；方法：(t/％b)：0/30、2/30、20/30、20/60、20.5、90、22/90；流速：18ml/min；溶解性：-acn+thf+水；环境温度]纯化粗产物。将所收集的洗脱份冻干，获得呈灰白色固体的纯产物化合物3(3mg,1.9％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.44-6.60(m,1h)6.22-6.43(m,2h)5.86(td,j＝7.23,1.32hz,1h)5.77(brd,j＝9.21hz,1h)5.58-5.72(m,1h)5.51(brt,j＝7.02hz,1h)4.44-4.56(m,1h)4.20(brt,j＝6.80hz,1h)3.87-4.00(m,2h)3.60-3.76(m,5h)3.45-3.57(m,3h)2.89-3.02(m,2h)2.61-2.78(m,4h)2.40-2.49(m,4h)2.29-2.38(m,9h)2.13-2.26(m,4h)2.07-2.11(m,3h)1.88-2.03(m,4h)1.71-1.85(m,6h)1.51-1.55(m,3h)1.47(brd,j＝2.85hz,2h)1.43(s,6h)1.22-1.35(m,3h)1.16(d,j＝6.36hz,3h)0.98(d,j＝7.45hz,3h)；lcms：75％(587.17,m+h)，rt：2.95分钟。

实施例4

2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(异噁唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物4)的合成

部分a：

步骤1.异噁唑-3-基甲醇，化合物2i。将异噁唑-3-甲酸乙酯(化合物1i)(24g,170.2mmol)于乙醇(400ml)中的搅拌溶液冷却到0℃，添加硼氢化钠(16.17g,425.5mmol)并将混合物搅拌3小时。通过tlc(于dcm中的10％甲醇，rf：0.3，碘和uv活性)监测反应进展。将反应混合物减压蒸发，用冰冷水(30ml)淬灭，用于dcm中的10％甲醇(6×500ml)萃取，并使有机层经无水硫酸钠干燥。将有机溶剂减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物2i(16.8g,99.32％)。gcms：56％(99m/z)，rt：5.109分钟；¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm2.238(s,1h),4.813(s,2h)6.428-6.386(d,j＝2hz,1h)8.392(d,j＝2hz,1h)。

步骤2.3-(溴甲基)异噁唑，化合物3i。将化合物2i(16.8g,169.69mmol)于dcm(350ml)中的搅拌溶液冷却到0℃，添加三苯基膦(44.5g,169.69mmol)和cbr4(56.27g,169.69mmol)，并将混合物在室温下搅拌4小时。通过tlc(于己烷中的20％乙酸乙酯，rf：0.7，碘和uv活性)监测反应进展。将反应混合物用水(2×100ml)、盐水溶液(100ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，获得呈淡黄色液体的粗产物(23g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于己烷中的10％乙酸乙酯洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物3i(16.5g,62.6％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm4.461(s,2h)6.463(d,j＝1.6hz,1h)8.396(d,j＝1.6hz,1h)；lcms：85％(162,m+h)，rt：1.69分钟。

步骤3.2-(异噁唑-3-基)乙腈，化合物4i。在0℃下向化合物3i(16.5g,102.4mmol)于dmso(35ml)和水(15ml)中的搅拌溶液中添加kcn(9.92g,153.72mmol)，然后使反应物升温至25℃并搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的30％乙酸乙酯，rf：0.5，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物用水(100ml)稀释并用乙酸乙酯(2×150ml)萃取。将合并的有机层用水(100ml)和盐水溶液(100ml)洗涤，经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(12g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)和于己烷中的20％etoac作为洗脱液进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物4i(8g,72.7％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm3.87(s,2h)6.49(d,j＝1.47hz,1h)8.48(d,j＝1.47hz,1h)；lcms：96.57％(109.09,m+h)，rt：1.19分钟。

步骤4.2-(异噁唑-3-基)丙腈，化合物5i。在0℃下向化合物4i(8g,92.5mmol)于thf(300ml)中的溶液中添加kotbu(9.35g,83.33mmol)，并将混合物搅拌20分钟。然后在0℃下将碘甲烷(28ml,462.5mmol)添加到反应物中并使反应混合物升温至25℃并搅拌16小时。通过tlc(于己烷中的30％乙酸乙酯，rf＝0.45，kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，将混合物过滤，用乙酸乙酯(250ml)稀释滤液并用水(100ml)和盐水溶液(100ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(15g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于己烷中的15％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物5i(5g,55.37％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.748-1.730(d,j＝7,3h),4.178-4.113(m,1h),6.49(d,j＝1.47hz,1h)8.48(d,j＝1.47hz,1h)；lcms：92.66％(123.16,m+h)，rt：1.44分钟。

步骤5.2-(异噁唑-3-基)丙酸乙酯，化合物6i。在250ml管中向化合物5i(4.5g,36.88mmol)于乙醇(45ml)中的溶液中添加于1,4-二噁烷(45ml)中的4.0mhcl，然后将管密封。将管加热至80℃并搅拌24小时。通过tlc(于己烷中的30％乙酸乙酯，rf＝0.7，kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，将反应混合物浓缩，并且将残余物溶于乙酸乙酯(100ml)中，并用nahco3溶液(2×50ml)、水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(3.5g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于己烷中的10％乙酸乙酯洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，得到呈淡黄色液体的化合物6i(6g,96.3％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm8.34-8.38(m,1h)6.37-6.42(m,1h)4.15-4.22(m,2h)3.96-4.03(m,1h)1.55-1.58(m,3h)1.25-1.28(m,3h)；lcms：88.80％(170.16,m+h)，rt：1.97分钟。

步骤6.2-(异噁唑-3-基)-n-甲氧基-n-甲基丙酰胺，化合物7i。向化合物6i(6g,35.5mmol)于thf(200ml)中的搅拌溶液中添加n,o-二甲基羟胺盐酸盐(6.92g,71mmol)，并将反应混合物冷却到0℃。然后添加异丙基氯化镁氯化锂复合物(1.3m)(109.2ml,142mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的50％乙酸乙酯，rf：0.4，kmno4活性)监测反应进展。通过使用饱和氯化铵水溶液将反应混合物淬灭，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。使合并的有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(9g)。通过硅胶柱使用于己烷中的50％乙酸乙酯作为洗脱液纯化粗产物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈淡黄色油状物的化合物7i(2g,30.62％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.50(d,j＝7.02hz,3h)3.21(s,3h)3.63-3.71(m,3h)4.53(brd,j＝6.14hz,1h)6.45(d,j＝1.53hz,1h)8.33(d,j＝1.53hz,1h)；lcms：97.05％(185.22,m+h)，rt：1.23分钟。

步骤7.2-(异噁唑-3-基)丙醛，化合物8i。在-70℃下向化合物7i(2g,10.87mmol)于thf(50ml)中的搅拌溶液中添加lah(5.43ml，10.87mmol，2m于thf中)。添加后，将反应混合物在0℃下搅拌1小时。通过tlc(于己烷中的50％乙酸乙酯，rf＝0.15，2,4-dnp活性)监测反应进展。反应完成后，用硫酸钠浆液使混合物淬灭，并在室温下搅拌30分钟。固体是过滤固体，用乙酸乙酯(50ml)洗涤。使滤液经无水硫酸钠干燥，并减压蒸发，得到化合物8i(1.2g)。粗产物不经纯化即用于下一步骤中。¹hnmr显示特征醛质子在9.8ppm处并且积分值为0.12(由于化合物不纯，因此未列出其它峰值)。

步骤8.(z)-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)戊-2-烯酸甲酯，化合物9i。在-75℃下向18-冠-6(19.18g,72.58mmol)和2-(二苯氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(3.34g,9.6mmol)于thf(40ml)中的搅拌溶液中滴加于thf中的1mkhmds溶液(9.6ml,9.6mmol)。添加后，将反应混合物在-75℃下搅拌20分钟。然后在-75℃下将于thf(10ml)中的化合物8i(1.2g,14.51mmol)添加到反应混合物中。添加后，将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的30％乙酸乙酯，rf＝0.6，uv活性)监测反应进展。反应完成后，将其用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×30ml)萃取并经无水硫酸钠干燥。将溶剂减压蒸发并获得4g粗产物。通过二氧化硅柱使用于己烷中的15％乙酸乙酯作为梯度纯化粗产物。收集纯洗脱份并减压蒸发，得到呈黄色胶状物的化合物9i(430mg,19.6％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.42(d,j＝7.02hz,3h),1.55(s,9h)5.002-4.961(m,1h)5.796-5.767(d,j＝11.6hz,1h)6.255-6.196(m,2h)8.316-8.312(d,j＝1.6hz,1h)；z几何异构体通过烯烃键的jj恒定偶联值证实：11.6hz；lcms：85.78％(224.26,m+h)，rt：2.49分钟。

步骤9.(z)-4-(异噁唑-3-基)戊-2-烯酸，化合物10i。在25℃下向化合物9i(420mg,1.88mmol)于dcm(42ml)中的搅拌溶液中添加tfa(4.2ml,41.50mmol)，并将混合物搅拌4小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.1，uv活性)监测反应进展。反应完成后，将溶剂在25℃下减压蒸发，获得粗产物。经由制备型hplc[流动相a：10fa；流动相b：乙腈，柱：xselect苯基己基(150×19)mm，5u；流速：16ml/min；方法：0/20、2/20、10/50；溶解性：-acn+水+thf；环境温度]纯化粗制化合物，获得呈无色油状物的化合物10i(142mg,45.2％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.33(d,j＝7.02hz,3h)4.90-5.02(m,1h)5.81(d,j＝11.40hz,1h)6.31(t,j＝10.74hz,1h)6.57(d,j＝1.32hz,1h)8.81(d,j＝1.32hz,1h)12.31(s,1h)；lcms：98.16％(166.15,m-h)，rt：1.43分钟。

部分b：

步骤1.(z)-n-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-基)-4-(异噁唑-3-基)戊-2-烯酰胺，化合物1j。在23℃下向化合物8(150mg,0.716mmol)和化合物10i(119mg,0.716mmol)于thf(10ml)中的搅拌溶液中添加dipea(0.65ml,3.58mmol)和t3p(50％于etoac中)(0.68ml,2.14mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.6，uv可见)监测反应进展。完成后，将反应混合物真空浓缩，获得粗制化合物。通过快速色谱法(于己烷中的20％至50％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色液体的化合物1j(130mg,50.78％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm8.27-8.32(m,1h)6.37(dd,j＝17.33,10.68hz,1h)6.24-6.30(m,1h)6.14(td,j＝11.20,9.97hz,1h)5.72-5.88(m,2h)5.40-5.50(m,1h)5.06-5.21(m,2h)4.96(d,j＝10.57hz,1h)3.91-4.02(m,1h)3.63-3.73(m,1h)3.51-3.59(m,1h)2.33-2.45(m,1h)2.19-2.31(m,1h)1.91-1.99(m,2h)1.81(ddd,j＝9.92,4.96,2.45hz,1h)1.76(s,3h)1.43-1.50(m,4h)1.24-1.28(m,3h)1.15(dd,j＝13.19,6.43hz,3h)1.02(dd,j＝13.95,7.41hz,3h)；lcms：93.58％(359.40,m+h)，rt：2.73分钟和2.75分钟。

步骤2.2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(异噁唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物4。在氮气气氛下在23℃下向化合物1j(120mg,0.335mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加化合物9(114mg,0.502mmol)和grubbs-ii催化剂(85mg,0.10mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.1，uv可见)监测反应进展。经由硅藻土过滤反应混合物并用dcm(5ml)洗涤，并且将滤液减压浓缩，获得粗制化合物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；柱：x-select苯基己基(150×19)mm,5u；方法：(t/％b)：0/20、2/20、12/55、20.50/90、22/90；流速：16ml/min；环境温度]纯化粗制残余物。将所收集的洗脱份冻干，得到呈淡棕色胶状物的化合物4(5mg)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm8.30(s,1h)6.38(brd,j＝15.89hz,1h)6.28(dd,j＝3.30,1.59hz,1h)6.07-6.20(m,1h)5.80-5.87(m,1h)5.76(dd,j＝11.13,3.06hz,1h)5.63(dd,j＝15.77,6.24hz,1h)5.52(brt,j＝6.85hz,1h)5.05-5.23(m,1h)4.50(ddd,j＝11.68,7.15,4.89hz,1h)4.21(brt,j＝6.72hz,1h)3.92-4.01(m,1h)3.63-3.75(m,7h)3.46-3.58(m,2h)2.89-3.03(m,2h)2.60-2.74(m,2h)2.34-2.46(m,1h)2.13-2.32(m,3h)1.90-1.99(m,2h)1.71-1.85(m,6h)1.47(dd,j＝6.97,2.57hz,3h)1.15(dd,j＝13.45,6.36hz,3h)1.02(dd,j＝14.18,7.34hz,3h)；lcms：92.45％(559.3,m+h)，rt：4.75分钟和4.80分钟。

实施例5

2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(3-甲氧基异噁唑-5-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物5)的合成

部分a：

步骤1.3-甲氧基异噁唑-5-甲酸甲酯，化合物2k。在0℃下向3-羟基异噁唑-5-甲酸甲酯(化合物1k)(23.5g,16.433mmol)于dmf(200ml)中的搅拌溶液中添加k2co3(34.01g,24.65mmol)，并将混合物搅拌10分钟。然后添加碘甲烷(15.35ml)，并使反应物升温至29℃，搅拌16小时。通过tlc(于己烷中的20％etoac，rf：0.7，uv活性)监测反应进展。将反应混合物用水(100ml)稀释并通过添加6nhcl酸化至ph约4并用etoac(3×100ml)萃取。将有机层用盐水溶液(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物(30g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于石油醚中的10％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈灰白色固体的化合物2k(20g,72.8％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：3.95(s,3h),4.03(s,3h),6.54(s,1h)；lcms：99.16％(158.07,m+h)，rt：1.43分钟。

步骤2.(3-甲氧基异噁唑-5-基)甲醇，化合物3k。向化合物2k(20g,127.38mmol)于冷却到0℃的甲醇(200ml)中的搅拌溶液中逐份添加nabh4(12.047g,318.47mmol)。使反应物升温至20℃，并搅拌5小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf：0.3，pma活性)监测反应进展。在0℃下用nh4cl水溶液(20ml)淬灭反应混合物。将溶剂在30℃下减压蒸发，获得残余物，将其于水(100ml)中稀释并用于dcm中的10％meoh(3×200ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩，获得呈淡黄色液体的化合物3k(13g,79％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：2.49(s,1h),3.96(s,3h),4.64(d,j＝5.70hz,2h),5.88(s,1h)；lcms：98.84％(130.06,m+h)，rt：0.90分钟。

步骤3.5-(溴甲基)-3-甲氧基异噁唑，化合物4k。在0℃下向化合物3k(13g,100.77mmol)于dcm(200ml)中的搅拌溶液中添加tpp(26.4g,100.77mmol)和cbr4(33.42g,100mmol)，然后使反应混合物升温至25℃并搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的20％etoac，rf：0.8，uv活性)监测反应进展。将反应混合物用水(2×100ml)和盐水溶液(100ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩，获得呈淡黄色液体的粗产物(23g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于石油醚中的10％etoac作为洗脱液来洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物4k(15g,78％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：5.94(s,1h),4.33(s,2h),3.97(s,3h)；lcms：92.15％(192.16,m+h)，rt：1.59分钟。

步骤4.2-(3-甲氧基异噁唑-5-基)乙腈，化合物5k。在0℃下向化合物4k(15g,78.53mmol)于dmso(150ml)和水(40ml)中的搅拌溶液中添加kcn(7.65g,117.80mmol)，并且使反应物升温至25℃并搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf：0.3，碘活性)监测反应进展。将反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(2×150ml)萃取。将合并的有机层用水(100ml)和盐水溶液(100ml)洗涤，经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(12g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于石油醚中的15％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色固体的化合物5k(6g,55％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：6.00(s,1h),3.98(s,3h),3.79(s,2h)；lcms：77.99％(138.92,m+h)，rt：1.54分钟。

步骤5.2-(3-甲氧基异噁唑-5-基)丙腈，化合物6k。在0℃下向化合物5k(6g,43.478mmol)于乙腈(60ml)中的悬浮液中添加k2co3(6.6g,47.825mmol)，并将反应物搅拌20分钟。在0℃下将于乙腈(20ml)中的碘甲烷(16.22ml,260.86mmol)添加到反应物。添加后，使反应混合物升温至25℃，并搅拌48小时。通过tlc(30％etoac，rf＝0.4，kmno4活性)监测反应进展。反应完成后，将混合物过滤，用etoac(150ml)稀释滤液并用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(9g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)并用于石油醚中的8％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物6k(3g,45％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：5.96(s,1h),4.01(m,1h),3.99(s,3h),1.71(d,3h)；lcms：85.72％(153.21,m+h)，rt：1.43分钟。

步骤6.2-(3-甲氧基异噁唑-5-基)丙酸甲酯，化合物7k。在100ml密封管中向化合物6k(3g,19.736mmol)于meoh(20ml)中的溶液中添加于1,4-二噁烷中的4.0mhcl(20ml)，将其加热至70℃并搅拌24小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf＝0.6，pma活性)监测反应进展。反应完成后，将反应混合物浓缩，且将残余物溶于etoac(100ml)中并用nahco3溶液(2×50ml)、水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤。使有机层经na2so4干燥并减压浓缩，获得粗制化合物(3.5g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)用于石油醚中的5％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色胶状物的化合物7k(3g,83％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：5.80(s,1h),3.95(s,3h),3.82(m,1h),3.73(s,3h),1.55(d,3h)；lcms：94.48％(186.22,m+h)，rt：1.54分钟。

步骤7.n-甲氧基-2-(3-甲氧基异噁唑-5-基)-n-甲基丙酰胺，化合物8k。在0℃下向化合物7k(3g,16.216mmol)和n,o-二甲基羟胺盐酸盐(3.16g,32.43mmol)于thf(50ml)中的搅拌溶液中添加异丙基氯化镁氯化锂复合物(37.42ml,48.648mmol)。添加后，将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过tlc(50％etoac，rf＝0.3，pma活性)监测反应进展。完成后，在0℃下用饱和氯化铵溶液淬灭反应混合物并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩，获得粗产物(5g)，其通过正相柱色谱法使用硅胶(100-200目)用于石油醚中的20％etoac洗脱进行纯化。将所收集的洗脱份蒸发，获得呈淡黄色液体的化合物8k(2.1g,60％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：5.80(s,1h),4.31(m,1h),3.94(s,3h),3.68(s,3h),3.21(s,3h),1.47(d,3h)；lcms：97.22％(215.23,m+h)，rt：1.40分钟。

步骤8.2-(3-甲氧基异噁唑-5-基)丙醛，化合物9k。在-78℃下向化合物8k(1.8g,8.411mmol)于thf(30ml)中的搅拌溶液中添加lah(4.2ml，8.411mmol，2m于thf中)，并将混合物在-78℃下搅拌30分钟。通过tlc(30％etoac，rf＝0.4，2,4-dnp活性)监测反应进展。反应完成后，将其用硫酸钠浆液淬灭，并在室温下搅拌30分钟。将未溶解的固体过滤并用乙酸乙酯(50ml)洗涤。使滤液经硫酸钠干燥并减压蒸发，得到化合物9k(1.1g)。粗产物不经纯化即用于下一步骤。通过¹hnmr证实醛化合物的存在。

步骤9.(z)-4-(3-甲氧基异噁唑-5-基)戊-2-烯酸叔丁酯，化合物10k。在-78℃下向18-冠-6(19.18g,72.58mmol)和2-(二苯氧基膦基)乙酸叔丁酯(4.61g,14.51mmol)于thf(50ml)中的搅拌溶液中滴加lihmds(14.51ml，14.51mmol，1m于thf中)。添加后，将反应混合物在-78℃下搅拌40分钟。然后在-78℃下向反应混合物中添加于thf(10ml)中的化合物9k(1.1g,14.51mmol)。添加后，将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的20％etoac，rf＝0.7，pma活性)监测反应进展。反应完成后，将其用饱和氯化铵溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取并用硫酸钠干燥。将溶剂减压蒸发，获得粗产物(3g)，其通过二氧化硅柱使用于己烷中的2％etoac梯度进行纯化。收集纯洗脱份并减压蒸发，得到呈黄色液体的化合物10k(350mg,19％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm：1.40(d,j＝7.02hz,3h),1.45-1.52(m,9h),3.94(s,3h),4.87-4.97(m,1h),5.64(s,1h),5.77(d,j＝11.40hz,1h),6.10(dd,j＝11.18,9.87hz,1h)；lcms：91.94％(254.31,m+h)，rt：2.60分钟。

步骤10.(z)-4-(3-甲氧基异噁唑-5-基)戊-2-烯酸，化合物11k。在29℃下向化合物10k(350mg,1.383mmol)于dcm(35ml)中的搅拌溶液中添加tfa(3.17ml,41.50mmol)，并将混合物搅拌6小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.2，uv活性)监测反应进展。反应完成后，将溶剂在25℃下减压蒸发，获得粗产物。用正戊烷(2×10ml)洗涤粗制化合物并将固体残余物在减压下干燥，获得呈灰白色固体的化合物11k(202mg,87％)。jj恒定偶联值证实z几何异构体的形成。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm：12.62(br,1h),6.25(dd,j＝11.18,9.87hz,1h),6.06(s,1h),5.87(d,j＝11.40hz,1h),4.80-4.91(m,1h),3.86(s,3h),1.32(d,j＝7.02hz,3h)；lcms：90.09％(198.24,m+h)，rt：2.54分钟。

部分b：

步骤1.(z)-n-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基)-4-(3-甲氧基异噁唑-5-基)戊-2-烯酰胺，化合物1m。在室温下向化合物8(300mg,1.435mmol)、化合物11k(170mg,0.861mmol)于thf(10ml)中的搅拌溶液中添加dipea(925mg,7.175mmol)和t3p(50％于etoac中)(1.36g,4.305mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过tlc(于石油醚中的20％etoac，rf＝0.5，uv活性)监测反应进展。将反应溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的10％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈无色胶状物的化合物1m(90mg,16％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.37(dd,j＝17.61,10.76hz,1h)5.97-6.07(m,1h)5.70-5.81(m,2h)5.66(s,1h)5.46(brt,j＝7.09hz,1h)5.07-5.22(m,2h)4.96(d,j＝10.76hz,1h)3.94(d,j＝1.96hz,4h)3.68(q,j＝6.68hz,1h)3.55(td,j＝7.21,2.69hz,1h)2.34-2.46(m,1h)2.25(dt,j＝15.16,7.58hz,1h)1.95(q,j＝3.42hz,2h)1.78-1.85(m,1h)1.76(s,3h)1.41(dd,j＝6.85,1.96hz,3h)1.21-1.30(m,2h)1.15(t,j＝6.36hz,3h)1.02(t,j＝7.34hz,3h)；lcms：85.73％(389.36,m+h)，rt：2.71分钟和2.74分钟。

步骤2.2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-5-((z)-4-(3-甲氧基异噁唑-5-基)戊-2-烯酰胺基)-3,6-二甲基四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物5。在氩气气氛下在室温下向化合物1m(77mg,0.198mmol)和化合物9(77mg,0.337mmol)于dcm(8ml)中的搅拌溶液中添加grubbs-ii催化剂(50mg,0.059mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(于石油醚中的50％etoac，rf＝0.1，uv活性)监测反应进展。经硅藻土垫过滤反应混合物并用dcm(2ml)洗涤。将溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；柱：x-bridge(150×19)mm,5u；柱：方法：(t/％b)：0/30、2/30、20/30.20/60、20.5、90、22/90；流速：18ml/min；溶解性：acn+thf+水；环境温度]纯化粗产物。将合并的洗脱份冻干，获得呈灰白色固体的纯产物化合物5(7.5mg,6.4％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.37(d,j＝15.78hz,1h)6.02(ddd,j＝11.18,9.76,2.52hz,1h)5.68-5.80(m,2h)5.57-5.67(m,2h)5.51(brt,j＝7.13hz,1h)5.06-5.22(m,1h)4.43-4.55(m,1h)4.20(brt,j＝6.69hz,1h)3.94(d,j＝1.75hz,4h)3.61-3.73(m,4h)3.46-3.57(m,2h)2.87-3.02(m,2h)2.60-2.74(m,2h)2.33-2.48(m,2h)2.20-2.32(m,2h)2.16(dd,j＝13.81,5.48hz,1h)1.90-1.98(m,2h)1.71-1.85(m,6h)1.41(dd,j＝7.02,1.97hz,3h)1.14(t,j＝6.36hz,3h)1.01(t,j＝7.34hz,3h)；lcms：90.65％(589.11,m+h)，rt：3.95,4.01分钟。

实施例6

2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-3,6-二甲基-5-((z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物6)的合成

部分a：

步骤1.3-(羟基氨基)-3-亚氨基-2-甲基丙酸乙酯，化合物2n。在0℃下向2-氰基丙酸乙酯(化合物1n)(20g,15.7mmol)于thf(500ml)中的搅拌溶液中添加kotbu溶液(314ml，31.4mmol，1m于thf中)。10分钟后，添加羟胺盐酸盐(27g,39.3mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌48小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf：0.1，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物减压蒸发，并通过二氧化硅柱使用于己烷中的40％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化残余物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物2n(5.5g,21.8％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.17(t,j＝7.15hz,3h),1.24(d,j＝7.15hz,3h),3.10-3.20(m,1h),3.92-4.23(q,2h),5.31-5.45(br,2h)；lcms：43.4％(161.13,m+h)，rt＝0.37分钟，和49.48％(161.13,m+h)，rt＝0.41分钟。

步骤2.2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸乙酯，化合物3n。在室温下于密封管中向化合物2n(5.5g,34.3mmol)于吡啶(50ml)中的搅拌溶液中添加乙酸酐(9.7ml,10.3mmol)。将反应混合物在120℃下加热24小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf：0.5，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物减压蒸发，并通过二氧化硅柱使用于己烷中的20％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化残余物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈黄色油状物的化合物3n(4.5g,71.4％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.26(t,j＝7.09hz,3h),1.58-1.62(d,3h),2.61(s,3h),3.89-4.00(q,1h),4.15-4.26(q,2h)；lcms：86.56％(185.22,m+h)，rt＝1.48分钟。

步骤3.2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸，化合物4n。在0℃下向化合物3n(4.5g,24.4mmol)于meoh:thf:h2o(45ml,4:4:1)中的搅拌溶液中添加lioh.h2o(4g,9.7mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf：0.1，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物减压蒸发，使用6nhcl(约10ml)将残余物的ph调节至约1，然后用乙酸乙酯(25ml×2)萃取。使用na2so4将合并的有机层干燥并减压浓缩，获得呈无色油状物的化合物4n(3.5g,92％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.41(d,j＝7.23hz,3h),2.57(s,3h),3.88-3.97(q,1h),12.65-12.82(brs,1h)；lcms：94.38％(157.1,m+h)，rt＝1.05分钟。

步骤4.n-甲氧基-n-甲基-2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酰胺，化合物5n。在0℃下向化合物4n(3.5g,22.4mmol)于dcm(100ml)中的搅拌溶液中添加edc·hcl(6.4g,33.6mmol)、hobt(4.5g,33.6mmol)和dipea(11.7ml,67.2mmol)。10分钟后，在0℃下添加n,o-二甲基羟胺盐酸盐(3.2g,33.6mol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf：0.2，kmno4活性)监测反应进展。用dcm(40ml)稀释反应混合物并用碳酸氢钠饱和溶液(30ml)洗涤。将有机层分离并经硫酸钠干燥。将有机层减压蒸发并获得5g粗制化合物5n。通过二氧化硅柱使用于己烷中的40％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化粗制化合物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物5n(2.2g,50％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.57(d,j＝7.03hz,3h),2.60(s,3h),3.26(s,3h),3.72(s,3h),4.34-4.42(q,1h)；lcms：96.65％(200.16,m+h)，rt＝1.21分钟。

步骤5.2-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)丙醛，化合物6n。在0℃下向lah(380mg,10mmol)于thf(10ml)中的搅拌溶液中缓慢添加于thf(20ml)中的化合物5n(1g,50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。通过tlc(于己烷中的40％etoac，rf：0.3，kmno4活性和2,4-dnp轻微活性)监测反应进展。在0℃下使用1nhcl(约3ml)淬灭反应混合物并搅拌10分钟，然后添加乙酸乙酯(20ml)。经由硅藻土床过滤反应混合物。使用硫酸钠干燥滤液并将体积最小化至4ml(约800mg，粗制)化合物6n。化合物6n不经进一步纯化即用于步骤6。esms：40.4％(141.1,m+h)，rt＝2.24分钟(粗制)；注意：¹hnmr不提供可读光谱。

步骤6.(z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸甲酯，化合物7n。在0℃下向18-冠-6-醚(7.5g,28.5mmol)于无水thf(30ml)中的搅拌溶液中添加2-(双(2,2,2-三氟乙氧基)磷酰基)乙酸甲酯(1.3ml,6.2mmol)，接着在-78℃下添加于thf(6.2ml,6.2mmol)中的1mkhmds。将反应混合物在-78℃下维持30分钟，然后在-78℃下添加于无水thf(10ml)中的化合物6n(约800mg)。使反应混合物逐渐升温至室温并在相同温度下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf：0.5，kmno4活性)监测反应进展。使用h2o(30ml)淬灭反应混合物并于乙酸乙酯(50ml×2)中萃取。使合并的有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩，获得600mg粗制化合物7n。通过二氧化硅柱使用于己烷中的10％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化粗制化合物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈黄色油状物的化合物7n(420mg，根据lcms为59％纯，37％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.44-1.48(d,3h),2.57(s,3h)3.74(s,3h),5.01-5.10(q,1h),5.92-5.89(d,j＝10hz,1h),6.35-6.46(dd,j＝10hz,1h)；lcms：59％(197.21,m+h)，rt＝1.57分钟。通过烯烃键的jj偶联恒定值10hz证实z几何异构体。

步骤7.(z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酸，化合物8n。将化合物7n(550mg，28mmol，根据lcms为80％纯)添加于二噁烷(10ml)和2nhcl(5ml)中。将反应混合物在55℃下加热48小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf：0.1，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物减压浓缩并使用制备型hplc纯化，获得呈无色油状物的纯化合物8n(138mg,28.6％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.33(d,j＝7.02hz,3h),2.55(s,3h),4.86-5.08(q,1h),5.84(dd,j＝11.40hz,1h),6.24(m,j＝10.52hz,1h),11.64-12.96(brs,1h)；lcms：98.59％(183.21,m+h)，rt＝1.4分钟。

部分b：

步骤1.(z)-n-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺，化合物1p。在23℃下向化合物8(150mg,0.716mmol)、化合物8n(130mg,0.716mmol)于thf(5ml)中的搅拌溶液中添加dipea(0.65ml,2.385mmol)和t3p(50％于etoac中)(0.68ml,1.431mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.6，uv可见)监测反应进展。完成后，将反应混合物真空浓缩，获得粗制化合物。通过快速色谱法(于己烷中的10％至50％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色液体的化合物1p(130mg,48.68％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.45-6.33(m,1h)6.17-6.12(m,1h)6.07-6.01(m,1h)5.85-5.79(m,1h)5.46-5.45(m,1h)5.13-5.09(m,1h)4.97-4.88(m,1h)3.96(br,1h)3.68-3.66(m,1h)3.55-3.52(m,1h)2.569s,3h)2.39-2.35(m,1h)2.27-2.21(m,1h)2.04-1.98(m,1h)1.93-1.90(m,2h)1.82-1.76(m,3h)1.49-1.46(m,3h)1.28-1.21(m5h)1.16-1.10(m,3h)1.06-0.97(m,3h)；lcms：85.98％(374.42,m+h)，rt：2.61分钟和2.63分钟。

步骤2.2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-3,6-二甲基-5-((z)-4-(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物6。在氮气气氛下在23℃下向化合物1p(120mg,0.321mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加化合物9(109mg,0.481mmol)和grubbs-ii催化剂(81mg,0.096mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.1，uv可见)监测反应进展。经由硅藻土过滤反应混合物，用dcm(5ml)洗涤并将滤液减压浓缩，获得粗制化合物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；柱：x-bridge(150×19)mm,5u；方法：(t/％b)：0/30、2/30、20/60、20.50/90、22/90；流速：18ml/min；溶解性：acn+thf+水；环境温度]纯化粗制残余物。将所收集的洗脱份冻干，得到呈白色固体的化合物6(5mg)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.31-6.44(m,1h)5.99-6.19(m,2h)5.77-5.89(m,1h)5.63(brdd,j＝15.89,6.25hz,1h)5.45-5.56(m,1h)5.02-5.17(m,1h)4.83-4.96(m,1h)4.44-4.54(m,1h)4.20(brt,j＝6.69hz,1h)3.90-4.02(m,1h)3.61-3.77(m,4h)3.44-3.58(m,3h)2.88-3.02(m,2h)2.61-2.76(m,2h)2.56(s,3h)2.38(td,j＝14.85,7.34hz,1h)2.12-2.29(m,2h)1.87-2.04(m,3h)1.70-1.84(m,5h)1.48(dd,j＝6.91,4.71hz,3h)1.08-1.20(m,3h)0.94-1.07(m,3h)；lcms：96.43％(574.15,m+h)，rt：3.59分钟和3.64分钟。

实施例7

2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-3,6-二甲基-5-((z)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯(化合物7)的合成

部分a：

步骤1.3-甲基氧杂环丁-3-醇，化合物2q。在0℃下经2小时的时期向氧杂环丁-3-酮(化合物2q)(25g,346.9mmol)于无水二乙醚(1.25l)中的搅拌溶液中滴加3m于二乙醚(127.2ml,381.6mmol)中的甲基溴化镁。将反应物料在0℃下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的40％etoac，rf：0.2，pma活性)监测反应进展。在0℃下使用饱和nh4cl溶液(约1l)经1小时的时期缓慢淬灭反应物料。将有机层分离并再用于dcm中的10％meoh(200ml×5)萃取水层。使合并的有机层经无水na2so4干燥并在减压下在20℃下蒸发，获得呈橙色油状物的化合物2q(16g,52％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.38-1.40(s,3h)4.26(d,j＝6.58hz,2h),4.43(d,j＝5.92hz,2h),5.50(s,1h)；gcms＝98.87％。

步骤2.2-(((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)甲基)丙烯酸乙酯，化合物4q。在0℃下向化合物2q(10.5g,119.16mmol)于dmf(120ml)中的搅拌溶液中逐份添加nah(5.72g,238.33mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，接着在0℃下添加化合物3q(23g,119.16mmol)并在室温下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的10％etoac，rf：0.5，uv和pma活性)监测反应进展。使用冰冷水(120ml)将反应混合物淬灭并使用二乙醚(100ml×3)萃取。将合并的有机层用冷水(100ml×3)洗涤。将有机层分离并经无水硫酸钠干燥。将有机层减压蒸发，并通过二氧化硅柱使用于己烷中的10％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化残余物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物4q(7g,29％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.29-1.34(t,3h),1.58-1.60(s,3h),4.13(s,j＝1.67hz,2h),4.20-4.27(q,2h),4.37-4.40(d,2h),4.73(d,j＝6.32hz,2h),5.93(s,1h)6.32(s,j＝1.55hz,1h)；lcms：71.79％(201.23,m+h)，rt＝1.57分钟。

步骤3.2-甲基-3-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)丙酸乙酯，化合物5q。在氮气下向化合物4q(7g,35mmol)于乙醇(100ml)中的搅拌溶液中添加10％pd/c(2g)。使用氢气囊在氢气气氛下(约20psi)将反应混合物在室温下搅拌48小时。通过tlc(于己烷中的10％etoac，rf：0.5，pma活性)监测反应进展。经由硅藻土床过滤反应混合物并用乙酸乙酯(200ml×2)洗涤。将反应混合物减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物5q(6g,84％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm0.99-1.13(d,3h),1.14-1.26(t,3h),1.32-1.44(s,3h),2.57-2.67(m,1h),3.34-3.47(m,2h),4.00-4.14(q,2h),4.22-4.28(d,2h),4.40-4.48(m,2h)；lcms：85.89％(203.2,m+h)，rt＝2.72分钟。

步骤4.2-甲基-3-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)丙-1-醇，化合物6q。在0℃下向化合物5q(1g,4.95mmol)于无水thf(10ml)中的搅拌溶液中添加lah(282mg,7.42mmol)，并将混合物在室温下搅拌16小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf：0.2，kmno4活性)监测反应进展。在0℃下使用冰冷水(20ml)将反应混合物淬灭并在室温下搅拌1小时。经由硅藻土床过滤反应混合物并用于dcm中的10％meoh(20ml×5)洗涤。使用于dcm中的10％meoh(20ml×7)从母液中萃取产物。将有机层分离并经无水硫酸钠干燥，接着减压蒸发，获得呈无色油状物的粗制化合物6q(700mg,88％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm0.86(d,j＝6.80hz,3h),1.43(s,3h),1.66-1.76(m,1h),3.11-3.39(m,5h),4.23-4.26(d,2h),4.37-4.41(t,1h),4.46-4.50(d,2h)。

步骤5.2-甲基-3-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)丙醛，化合物7q。在0℃下向化合物6q(500mg,3.12mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(dess-martinperiodinane，dmp)(1.72g,4.06mmol)，在室温下搅拌2小时。通过tlc(于己烷中的30％etoac，rf：0.6，2,4-dnp和kmno4活性)监测反应进展。使用饱和nahco3溶液(约20ml)将反应混合物淬灭，并经由硅藻土床过滤并用二氯甲烷(30ml×2)洗涤。使用二氯甲烷(20ml×2)从母液中萃取产物。将合并的有机层分离，经na2so4干燥并减压蒸发。通过二氧化硅柱使用于己烷中的15％乙酸乙酯作为洗脱液来纯化残余物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈无色胶状化合物的化合物7q(270mg,54％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm1.17(d,j＝7.19hz,3h),1.54(s,3h),2.48-2.71(m,1h),3.44-3.62(m,2h),4.35(d,j＝6.54hz,2h),4.57-4.75(d,2h),9.60-9.80(s,1h)。

步骤6.(z)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酸甲酯，化合物8q。在0℃下向18-冠-6-醚(2.27g,8.54mmol)于无水thf(10ml)中的搅拌溶液中添加2-(双(2,2,2-三氟乙氧基)磷酰基)乙酸甲酯(597mg,1.87mmol)，接着在-78℃下添加于thf(1.7ml,1.70mmol)中的1mkhmds。将反应混合物在-78℃下维持30分钟，然后在-78℃下添加于无水thf(5ml)中的化合物7q(270mg,1.70mmol)，并使反应混合物于1.5小时内逐渐升温至室温。通过tlc(于己烷中的20％etoac，rf：0.5，kmno4活性)监测反应进展。使用冰冷水(10ml)将反应混合物淬灭并于乙酸乙酯(10ml×2)中萃取。使合并的有机层经na2so4干燥并减压蒸发，获得600mg粗制化合物7q。通过二氧化硅柱使用于己烷中的8％乙酸乙酯作为洗脱液纯化粗制化合物。收集纯洗脱份并减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物7q(170mg,46％)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δppm0.99(d,j＝6.60hz,3h),1.38(s,3h)3.25(m,j＝6.42,2.02hz,2h),3.45-3.68(m,4h),4.24(d,j＝6.60hz,2h),4.47(m,j＝5.69hz,2h),5.78-5.87(d,1h),6.14-6.24(dd,1h)；lcms：72％(215.4,m+h)，rt＝1.68分钟。

步骤7.(z)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酸，化合物9q。在室温下向化合物7q(170mg,0.794mmol)于thf(2ml)和h2o(0.5ml)中的搅拌溶液中添加lioh.h2o(100mg,2.38mmol)。将反应混合物在室温下搅拌72小时。通过tlc(于己烷中的70％etoac，rf：0.2，kmno4活性)监测反应进展。将反应混合物减压蒸发并用水(10ml)稀释并用于dcm中的10％meoh(5ml×10)洗涤。将水层分离并使用1nhcl酸化且调节至ph约2。使用于dcm中的10％meoh(10ml×3)萃取粗产物。将有机层分离并经无水硫酸钠干燥并减压蒸发，获得呈无色油状物的化合物9q(119mg,75％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm0.98(d,j＝6.80hz,3h),1.43(s,3h),3.24(d,j＝6.36hz,2h),3.51-3.65(m,1h),4.24(d,j＝6.36hz,2h),4.47(t,j＝5.81hz,2h),5.71-5.74(dd,j＝12,0.77hz,1h)6.06-6.12(dd,j＝10,9.76hz,1h)。12.12-12.33(brs,1h)；elsd：98.47％(201.1,m+h)，rt＝2.44分钟；烯烃键的jj偶联恒定值证实z几何异构体：j＝12,10hz。

部分b：

步骤1.(z)-n-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)四氢-2h-吡喃-3-基)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酰胺，化合物1r。在23℃下向化合物8(100mg,0.477mmol)、(z)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酸(化合物1q)(95mg,0.477mmol)于thf(5ml)中的搅拌溶液中添加dipea(0.43ml,2.385mmol)和t3p(50％于etoac中)(0.45ml,1.431mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.5，uv可见)监测反应进展。完成后，将反应混合物真空浓缩，获得粗制化合物。通过快速色谱法(于己烷中的10％至50％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色液体的化合物1r(75mg,40.10％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.37(dd,j＝17.38,10.52hz,1h)6.03-6.17(m,1h)5.68-5.85(m,2h)5.46(brt,j＝7.14hz,1h)5.11(d,j＝17.44hz,1h)4.96(d,j＝10.68hz,1h)4.61-4.75(m,2h)4.28-4.37(m,2h)3.85-4.05(m,1h)3.47-3.73(m,4h)3.33-3.42(m,1h)3.14-3.25(m,1h)2.32-2.45(m,1h)2.19-2.30(m,1h)1.87-2.07(m,3h)1.49-1.64(m,12h)1.24-1.32(m,3h)1.16-1.22(m,2h)1.10-1.15(m,2h)1.05(td,j＝4.82,2.23hz,5h)0.99(d,j＝7.30hz,2h)；lcms：89.55％(392.13,m+h)，rt：2.21分钟。

步骤2.2-((3r,5s,7r,8r)-7-((1e,3e)-5-((2s,3s,5r,6r)-3,6-二甲基-5-((z)-4-甲基-5-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)氧基)戊-2-烯酰胺基)四氢-2h-吡喃-2-基)-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基)-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸甲酯，化合物7。在氮气气氛下在23℃下向化合物1r(70mg,0.178mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加化合物9(61mg,0.268mmol)和grubbs-ii催化剂(45mg,0.053mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.1，uv可见)监测反应进展。经由硅藻土过滤反应混合物，用dcm(5ml)洗涤并将滤液减压浓缩，获得粗制化合物。通过制备型hplc[流动相a：10mmabc；流动相b：乙腈；柱：x-bridge(150×19)mm,5u；方法：(t/％b)：0/30、2/30、20/60、20.50/90、22/90；流速：18ml/min；溶解性：acn+thf+水；环境温度]纯化粗制残余物。将所收集的洗脱份冻干，得到呈白色固体的化合物7(3.5mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.57(brdd,j＝12.39,8.00hz,1h)6.28(brd,j＝15.78hz,1h)5.99-6.08(m,1h)5.68-5.78(m,1h)5.58(brdd,j＝16.00,5.04hz,1h)5.52(brt,j＝6.91hz,1h)5.04(brd,j＝5.92hz,1h)4.44-4.53(m,2h)4.19-4.32(m,4h)3.77(ddt,j＝15.65,12.91,6.55,6.55hz,1h)3.65(brd,j＝5.92hz,2h)3.60(s,3h)3.46-3.54(m,1h)3.23-3.27(m,3h)3.20(dd,j＝6.25,2.52hz,2h)2.76(d,j＝5.26hz,1h)2.67(dt,j＝4.00,2.27hz,3h)2.58-2.65(m,1h)2.15-2.36(m,3h)1.77-1.91(m,2h)1.70(s,3h)1.65(brdd,j＝6.47,3.40hz,3h)1.53(brdd,j＝12.93,3.73hz,1h)1.42(s,3h)1.03-1.11(m,3h)0.91-0.99(m,6h)；lcms：95.81％(592.24,m+h)，rt：3.72分钟和3.74分钟。

实施例8

(z)-4-氟苯甲酸5-(((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-7-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基)氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯(化合物10)的合成

部分a：

步骤1.(z)-4-氟苯甲酸5-((2r,3r,5s,6s)-2,5-二甲基-6-((e)-3-甲基戊-2,4-二烯基)四氢-2h-吡喃-3-基氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物1f。在室温下向室温下的化合物8的搅拌溶液(400mg，1.91毫摩尔)中添加于thf(12ml)中的化合物4e(273mg，1.14毫摩尔)、dipea(1.23g，9.55毫摩尔)和t3p(50％于etoac中)(1.82g)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过tlc(于石油醚中的30％etoac，rf＝0.2，pma活性)监测反应进展。将反应混合物减压浓缩，获得粗产物。通过柱色谱法(100-200硅胶/于石油醚中的10％etoac洗脱液)纯化粗产物，得到呈无色胶状物的化合物1f(220mg)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm0.99-1.08(m,3h)1.11-1.20(m,3h)1.36-1.44(m,3h)1.47-1.55(m,5h)1.69-1.85(m,4h)1.89-2.03(m,2h)2.19-2.32(m,1h)2.34-2.49(m,1h)3.49-3.59(m,1h)3.62-3.75(m,1h)3.91-4.04(m,1h)4.87-5.01(m,1h)5.11(d,j＝17.44hz,1h)5.47(brd,j＝3.81hz,1h)5.76(ddd,j＝11.61,5.94,1.20hz,1h)5.88-6.09(m,2h)6.18-6.58(m,3h)7.05-7.16(m,2h)7.99-8.10(m,2h)；lcms：87.8％(430.07,m+h)，rt：2.50分钟和2.52分钟。

部分b：

步骤1.2-((2s,5s,6r)-5-羟基-4-亚甲基-6-乙烯基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸，化合物1s。在23℃下向化合物8c(600mg,2.83mmol)于thf(9ml)和水(1ml)中的搅拌溶液中添加氢氧化锂单水合物(178mg,4.24mmol)。将反应混合物在23℃下搅拌16小时。通过tlc(于dcm中的10％meoh，rf：0.1，pma可见)监测反应进展。完成后，将thf减压蒸发。将所得残余物用饱和柠檬酸酸化，用于dcm中的10％meoh(3×50ml)萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩，得到呈淡黄色液体的化合物1s(200mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δppm12.15(brs,1h)5.87(ddd,j＝17.33,10.73,4.95hz,1h)5.11-5.31(m,3h)5.05(s,1h)4.83(s,1h)4.14-4.26(m,1h)3.83-3.94(m,1h)3.68(t,j＝6.24hz,1h)3.17(d,j＝5.14hz,1h)2.43(dd,j＝6.97,4.03hz,2h)2.20-2.38(m,2h)。

步骤2.2-((2s,5s,6r)-5-羟基-4-亚甲基-6-乙烯基四氢-2h-吡喃-2-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，化合物2s。在23℃下向化合物1s(200mg,1.008mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(174mg,1.513mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加edc盐酸盐(289mg,1.513mmol)。将混合物在23℃下搅拌12小时。通过tlc(tlc系统：于己烷中的50％etoac，rf＝0.4，pma可见)监测反应进展。反应完成后，将溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过快速色谱法(于己烷中的20％至50％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化这种残余物，得到呈淡黄色液体的化合物2s(180g,60.60％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm5.87(ddd,j＝17.44,10.79,5.99hz,1h)5.31-5.44(m,2h)5.15(s,1h)5.02(d,j＝0.98hz,1h)4.37(qd,j＝6.68,4.36hz,1h)4.14-4.22(m,1h)3.96(t,j＝5.34hz,1h)2.89(dd,j＝6.54,3.27hz,2h)2.79-2.86(m,4h)2.51-2.59(m,1h)2.39-2.48(m,1h)2.30(d,j＝5.99hz,1h)；lcms：79.10％(296.09,m+h)，rt：1.37分钟。

步骤3.2-((3r,5s,7r,8r)-8-羟基-7-乙烯基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，化合物3s。在-20℃下向化合物2s(180mg,0.609mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加乙酰丙酮酸氧钒(16mg,0.060mmol)和叔丁基过氧化氢(tbhp)(5.5m于癸烷中)(0.22ml)。然后使所得混合物升温至0℃并搅拌2小时。2小时后，使反应混合物升温至23℃并搅拌18小时。反应完成后，如通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.2，pma可见)所测定，将溶剂减压浓缩，获得粗产物。通过快速色谱法(于己烷中的30％至60％etoac)于二氧化硅(100-200目)上纯化粗制残余物，得到呈淡黄色液体的化合物3s(110mg,58.20％)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm6.00(s,1h)5.44(dt,j＝17.41,1.54hz,1h)5.31-5.36(m,1h)4.51-4.59(m,1h)4.20-4.27(m,1h)3.48-3.55(m,1h)3.10-3.20(m,1h)2.96-3.06(m,2h)2.79-2.90(m,6h)2.70(d,j＝4.47hz,1h)2.05(t,j＝2.34hz,1h)1.90-2.01(m,2h)。

步骤4.(z)-4-氟苯甲酸5-(((2r,3r,5s,6s)-6-((2e,4e)-5-((3r,4r,5r,7s)-7-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基)-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基)-2,5-二甲基四氢-2h-吡喃-3-基)氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基酯，化合物10。在氮气气氛下在23℃下向化合物1f(100mg,0.233mmol)于dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加化合物3s(108mg,0.502mmol)和grubbs-ii催化剂(59mg,0.069mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌6小时。通过tlc(于己烷中的50％etoac，rf＝0.1，uv可见)监测反应进展。经由硅藻土过滤反应混合物并用dcm(5ml)洗涤。将滤液减压浓缩，获得粗产物。lcms分析显示产率为15％的所需产物以及未反应的化合物1f。通过制备型hplc纯化粗制化合物。将所收集的洗脱份冻干，得到呈白色固体的化合物10(11mg)(7％产率)。产物通过制备型hplc[流动相a：0.1％甲酸，流动相b：乙腈；柱：synergypolar(250×21.2)mm,4u；方法：(t/％b)：65:35(等度)；流速：18ml/min；溶解性：acn+thf+水；环境温度]分离为非对映异构体的混合物。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δppm8.05(ddd,j＝8.60,5.65,2.41hz,2h)7.10(t,j＝8.55hz,2h)6.36-6.58(m,2h)5.91-6.08(m,2h)5.76(dd,j＝11.62,5.48hz,1h)5.64(dd,j＝15.78,5.92hz,1h)5.54(brs,1h)4.48-4.60(m,1h)4.23(brt,j＝6.36hz,1h)3.98(brdd,j＝5.26,2.85hz,1h)3.68(q,j＝6.28hz,1h)3.54(brt,j＝7.67hz,2h)3.02-3.20(m,2h)2.99(d,j＝4.60hz,1h)2.75-2.90(m,4h)2.69(d,j＝4.60hz,1h)2.34-2.48(m,1h)2.11-2.31(m,2h)1.86-2.05(m,4h)1.73-1.84(m,4h)1.53(brd,j＝6.58hz,3h)1.17(t,j＝6.14hz,3h)1.04(t,j＝7.56hz,3h)；lcms：96.58％(713.27,m+h)，rt：4.63分钟和4.67分钟。

实施例9

含曲妥珠单抗抗体化合物11和帕利珠单抗(palivizumab)抗体化合物12的adc的合成

化合物10缀合至曲妥珠单抗的化合物11和化合物10缀合至帕利珠单抗的化合物12是以改编自arlotta等(antibodies,2018,7(1):6)的程序合成。将21mg市售曲妥珠单抗(genentech；pharmaceuticalbuyersinc.,newhydepark,ny)和5mg帕利珠单抗(medimmune；pharmaceuticalbuyersinc.)在原始制造商的包装插页中所列示的制剂中制备成3mg/ml的浓度，并使用slide-a-lyzer^tm透析装置(thermofisherscientific,waltham,ma)透析至缀合缓冲液[(50mm硼酸盐)(alfaaesar,haverill,ma)、50mmnacl(sigma；st.louis,mo)、2mmedta(sigma)，ph8.5]中。将二甲基乙酰胺(dma；mpbiomedicals,santaana,ca)添加到每个制剂以使总有机含量至10％v/v。然后使每个抗体与来自于dma中的20mm储备液的8摩尔当量的化合物10反应。使缀合反应物在室温下在摇台上温育2小时。为使未反应的化合物10淬灭，添加80摩尔当量的tris缓冲盐水(tbs；sigma)并在室温下在摇动下温育1小时。将adc纯化并使用sephadex^tmpd-10g-25脱盐柱(gehealthcare,chicago,il)缓冲液交换至储存缓冲液[10mm组氨酸(vwr)、50mm海藻糖(acrosorganics,waltham,ma)，ph6.0]中。使用uv/vis分光光度法测定adc的最终回收和浓度(4ml，5.0mg/ml化合物11；3.2ml，1.1mg/ml化合物12)。通过uv/vis分光光度法测定药物/抗体比(dar)并使用lc-ms质量位移来确认(化合物11为3.5；化合物12为2.8)。使用尺寸排阻色谱法(sec)在increase5/150gl柱(gehealthcare)上针对每个adc进行聚集分析以确保单体物质的完整性(化合物11>98％；化合物12>99％)。使用toxinsensor^tmgelclot测定(genscript；georgetown,grandcayman,caymanislands)确认每个adc的内毒素含量≤1eu/ml。

遵循类似程序以合成所公开发明的额外adc，其中与赖氨酸残基的酰胺键联形成药物缀合物。不同毒素可取代化合物2并且可利用除酰胺以外的接头来产生adc。此外，取决于所靶向的癌细胞，其它抗体可取代曲妥珠单抗和帕利珠单抗。

实施例10

体外细胞测定

在第1天，将96孔板以预定的细胞数量/孔于培养基中接种癌细胞系skbr3、hcc1954、mcf7和mdamb231。使用泰兰他汀a作为每个细胞系的阳性毒性对照测试化合物以及仅稀释剂作为阴性对照。将板于37℃增湿的co2温育器中温育20小时。在第2天，制备待测试的测试化合物的稀释液。于适当培养基中制备样品的初始工作储备液。然后制备每个测试化合物的于培养基中的1/3连续稀释液。将5ul稀释液添加到约100ul细胞的每个孔中。最终样品浓度在nm至pm范围内(作为1/3连续稀释液)。所有样品均获得一式两份/或一式三份数据点。使用行b、c、d、e、f、g中的孔产生每板的三个/两个样品。然后将板在37℃增湿的co2温育器中温育72小时。

在第5天，使用cell-titer试剂使用以下程序来读取细胞存活率。从96孔板中吸出培养基。将100ulcell-titerglo试剂(promega,inc.,madison,wi)添加到每个孔。将板在室温下温育10分钟。使用tecan读板器读取所得发光。

分析所得数据并绘制为存活率百分比对浓度(nm)。使用非线性回归拟合所得曲线。然后计算每个测试化合物的ic50并制表。

本发明化合物的毒性可以类似方式在上述测定中使用以下癌细胞系来测定：白血病细胞系，包括ccrf-cem、hl-60(tb)、k-562、molt-4、rpmi-8226和sr；非小细胞肺癌细胞系，包括a549/atcc、ekvx、hop-62、hop-92、nci-h226、nci-h23、nci-h322m、nci-h460和nci-h522；结肠癌细胞系，包括colo205、hcc-2998、hct-116、hct-15、ht29、km12和sw-620；cns癌细胞系，包括sf-268、sf-539、snb-19、snb-75和u251；黑色素瘤细胞系，包括loximvi、malme-3m、m14、sk-mel-2、sk-mel-28、sk-mel-5、uacc-257和uacc-62；卵巢癌细胞系，包括igrov1、ovcar-3、ovcar-4、ovcar-5、ovcar-8和sk-ov-3；肾癌细胞系，包括786-0、a498、achn、caki-1、rxf393、sn12c、tk-10和uo-31；乳腺癌细胞系，包括mcf7、hs578t、mda-mb-435、bt-549、t-47d和mda-mb-468；以及前列腺癌细胞系pc-3和du-145。

实施例11

体外细胞测定

或者，本发明化合物的体外细胞毒性可如本实施例中所述来测量。将180μl于mccoy5a改性培养基(st.louis,mo)+10％胎牛血清中的hct116细胞(atcc，目录号ccl-247)以5,000个细胞/孔的密度接种于白色不透明96孔板中，并于5％co2温育器中在370℃下温育24小时。细胞接种后24小时，将20μl10×测试化合物稀释，从而使得测试化合物的最终浓度为μm浓度。使用从10μm开始直到0.0001μm的半对数稀释液。使用嘌呤霉素和未处理的细胞作为阳性对照。将细胞与化合物一起在5％co2温育器中在370℃下温育72小时。72小时后，将100μl/孔的发光细胞存活率测定试剂(promega,inc.,madison,wi；目录号g7573)添加到板中并在室温下温育30分钟。使用envision2105多模式读板器(perkinelmer,waltham,ma)捕获发光信号。通过将药物浓度绘制在x轴上并将平均抑制％值绘制在y轴上，使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,lajolla,ca)中的非线性回归曲线拟合(s形剂量反应)分析数据。

表1汇总所指示毒素化合物观测到的细胞毒性。

表1

实施例12

毒素化合物的体外细胞毒性

各种癌细胞系是从美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection，)获得。在增湿的5％co2温育器中使细胞在由rpmi1640、l-谷氨酰胺和10％fbs组成的培养基中培养。使用标准组织培养技术根据需要将细胞传代。收集细胞并以5000个细胞/孔的密度平铺至96孔组织培养物处理的板中。在增湿的5％co2温育器中使细胞平衡约24小时后，用指示浓度的测试化合物处理细胞。使细胞暴露于测试化合物达三天而不更换培养基。处理期后，将发光细胞存活率分析试剂溶液(promega,inc.,madison,wi；目录号g7573)引入每个孔。然后在id3多模式酶标仪(moleculardevices,llc,sanjose,ca)上读取含celltiterglo的板。发光程度取决于活细胞的丰度。使用graphpadprism7.0(graphpadsoftware,lajolla,ca)非线性回归分析计算细胞毒性50％抑制浓度(ic50)。

以下表格汇总所指定毒素化合物对所指示癌细胞系nci-h23、du145、sw480、skov3、a549、ht29、sk-mes-1、skbr3、hct116、mcf7、n87和a431(atcc命名)所观测到的细胞毒性(ic50)nm。表2给出化合物2、化合物4和化合物6的细胞毒性。

表2

表3显示使用泰兰他汀a作为阳性对照，化合物1至化合物7对两种人类胰腺癌细胞系panc10.05和panc05.04的细胞毒性。

表3

表4给出化合物2、化合物4和化合物6对所指示癌细胞系hl60、kg-1、nci-h69、sk-mel-1、hel-92.1.7和k562(atcc命名)的细胞毒性数据。

表4

实施例13

adc的体外细胞毒性

在与实施例12中所述类似的程序中，测定adc化合物11对所指示癌细胞系的细胞毒性。使用化合物12作为阴性对照。

表3

实施例14

雌性balb/c裸小鼠中皮下nci-n87人类胃癌异种移植物治疗的体内功效研究

使用人类胃癌异种移植物癌症模型nci＝n87(登录号crl-5822^tm)来测试所公开发明的adc的体内功效。将在与基质胶(1:1)混合的0.1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的1×10⁷个nci-n87肿瘤细胞注射到6至8周龄雌性balb/c裸小鼠的右侧腹中。将肿瘤细胞接种日指定为第0天，并且每周两次测量肿瘤体积。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm³表示体积：v＝(l×w×w)/2，其中v是肿瘤体积，l是肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)并且w是肿瘤宽度(垂直于l的最长肿瘤尺寸)。当平均肿瘤大小达到150-300mm³时，将小鼠随机化并分成8个治疗组。

治疗组如下，其中“q4d*4”意指在第6天开始各剂量间间隔4天施用4个总剂量的药物物质：

第1组：仅媒介物(pbs)；q4d*4；

第2组：1mg/kg化合物11；q4d*4

第3组：3mg/kg化合物11；q4d*4；

第4组：3mg/kg化合物11；在第6天单一剂量；

第5组：3mg/kg化合物12；q4d*4；

第6组：10mg/kg化合物11；在第6天单一剂量；

第7组：10mg/kgkadcyla；在第6天单一剂量；以及

第8组：3mg/kgkadcyla；q4d*4。

通过静脉内注射向所述八组中的每一个施用所示测试物。使用媒介物(pbs)和化合物12作为阴性对照以探询对于研究媒介物(pbs)的影响和作为adc递送分子的化合物10的靶标独立效应。施用(阿多-曲妥珠单抗艾坦辛(ado-trastuzumabemtansine)；genentech,southsanfrancisco,ca)作为比较剂和阳性adc对照。

在注射后第6天、第9天、第12天、第15天、第19天、第21天、第23天、第25天、第27天、第29天和第31天测量每个小鼠的肿瘤体积以测定每个治疗降低肿瘤体积的功效。使用graphpadprism7.04软件进行数据分析。

图1显示数据的图形表示。表3a和表3b呈现图1的数值基础，其中avg表示平均肿瘤体积(mm³)。sem表示平均值的标准误差，并且n表示研究组中个别动物的数量。

表3a

表3b

这些体内实验的结果证实，用仅pbs媒介物(第1组)或用化合物12(第5组)治疗的小鼠在治疗后不显示可观测到的肿瘤体积的降低。实际上，这些动物中的肿瘤继续随时间增长。如预期，阳性对照kadcyla(第7组和第8组)降低肿瘤体积。化合物11在多种剂量水平和时间表(第2组、第3组、第4组和第6组)下的体内功效由肿瘤体积的降低清晰地证实。肿瘤体积降低的程度与kadcyla组中所观测到的类似。

初始给药后在第3组、第4组、第5组和第6组中观测到体重减轻；分别是化合物11(3mg/kg，q4*4)、化合物11(3mg/kg，单一剂量)、化合物12(3mg/kg，q4*4)和化合物11(10mg/kg，单一剂量)。在第4组、第5组和第6组中观测到导致死亡的体重减轻；分别是化合物11(3mg/kg，单一剂量)、化合物12(3mg/kg，s(q4*4)和化合物12(10mg/kg，单一剂量)。在第6组(化合物11(10mg/kg，单一剂量))中观测到最严重的作用，其中在第9天，构成治疗组的10只小鼠中有10只发现已死亡。在第3组(化合物11(3mg/kg单一剂量))中，尽管试图以基于水和饮食的干预来逆转严重的体重减轻(>15％起始体重)，但发现10只小鼠中有两只在次日死亡。发现化合物12第5组中有1只小鼠体重减轻15.94％并实施安乐死。不利效应的数量和严重程度与所施用的化合物10adc的剂量水平相关，并在非her2靶向化合物12以及her2靶向化合物11中观测到。因此，体重减轻和死亡归因于在adc情况下增加接头毒素化合物10的水平的效应。

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根据上文，应了解，尽管本文已出于说明的目的描述本发明的具体实施方案，但可在不偏离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，本发明仅受所附权利要求限制。