一种耐热醋酸菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种耐热醋酸菌及其应用。

背景技术：

果醋中不仅有机酸的含量丰富，还富有人体所需的矿物质元素、氨基酸及维生素；不仅有传统食醋的功能，还保留了水果原有的营养价值。果醋还拥有调节人体酸碱平衡，促进消化，增强食欲，消除疲劳的功效，而其他饮料无法与之相比，因此果醋在饮料行业的发展中是具有很大的潜能。

在果醋的酿造过程中，首先进行果酒发酵，在此基础上进一步采用醋酸菌发酵为果醋，因此醋酸菌菌种是影响生产效率和果醋品质的关键因素之一。目前，蜜桔果醋的醋酸菌多为延用粮食醋菌种，如食醋菌种as1.41和沪酿1.01醋酸杆菌等，缺乏适合于蜜桔发酵的专用醋酸菌菌株，导致蜜桔果醋风味不突出。

此外，当前在果酒发酵阶段获得的酒精浓度一般为8～10％，而国内厂家常用as1.41和沪酿1.01生产果醋，需要将果酒进行稀释4％以下才能继续醋酸发酵。一方面，需要更大的发酵罐来进行发酵。另一方面，发酵获得的果醋原浆营养成分浓度被稀释。因此，产品质量得不到保障，成本增加。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种耐热醋酸菌，用于(蜜桔)果醋发酵。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种耐热醋酸菌，所述耐热醋酸菌为巴氏醋酸杆菌nf-171(acetobacterpasteurianus)，于2018年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2018824。

进一步的，所述耐热醋酸菌是从南丰蜜桔果醋陈酿原浆中分离纯化获得的。

本发明还提供了该耐热醋酸菌于果醋发酵的应用。

进一步肚饿，所述果醋发酵包括蜜桔果醋发酵。

本发明还公布了一种利用上述的耐热醋酸菌酿造果醋的方法，包括如下步骤：

步骤一：将所述耐热醋酸菌接种到斜面固体培养基上进行活化培养12～24小时，然后用接种环挑取一环菌种接入到已灭菌的种子培养基中，置于温度为28～35℃、转速为120～160r/min的摇床中，连续培养1～2天，即至菌体的对数生长期；

步骤二：按照1～10％(w/v)的接种量把上述培养好的种子接种至含4％～14％乙醇或果酒的发酵培养基中，发酵产酸至含量基本恒定。

进一步的，所述步骤一中的种子培养基的成分及配比为：酒精度2％～6％，葡萄糖5g～20g/l，kh2po41.2～3.2g/l，nh4no32.0～5.0g/l，nacl0.5～1.0g/l，酵母膏0.05～0.3g/l，mgso4·7h2o0.25～0.5g/l，cacl20.011～0.11g/l，纯水1000ml；调节ph5.0～7.0，121℃高压蒸汽下灭菌30min。

进一步的，发酵培养基的成分及配比为：酒精度4％～14％，kh2po41.2～3.2g/l，nacl0.5～1.0g/l，mgso4·7h2o0.25～0.5g/l，cacl20.011～0.11g/l，纯水1000ml；调节ph5.0～7.0，121℃高压蒸汽下灭菌30min。

进一步的，在步骤二中培养条件为：温度36～45℃、转速120～200r/min。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

该菌能耐受较高温度，可以耐受40℃；

利用耐热醋酸菌(也耐乙醇)发酵生产蜜桔果醋提高了发酵罐使用效率，无需稀释果酒，节省成本，低耗能，发酵制得的果醋原浆活性成分浓度高，风味良好。

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1为本发明巴氏醋酸杆菌nf-171(acetobacterpasteurianus)的菌落形态；

图2为本发明巴氏醋酸杆菌nf-171(acetobacterpasteurianus)光学显微镜下菌落形态，(1：大肠杆菌标号；2,3：nf-171)；

图3为巴氏醋酸杆菌nf-171的系统发育进化树；

图4为巴氏醋酸杆菌nf171在不同温度下发酵产醋酸的情况；

图5为利用巴氏醋酸杆菌nf171以南丰蜜桔果酒为原料发酵生产蜜桔果醋。

具体实施方式

一株耐热醋酸菌所述的醋酸菌是从南丰蜜桔果醋陈酿原浆中分离纯化获得的，经微生物分类学鉴定命名为巴氏醋酸杆菌nf-171(acetobacterpasteurianus)，于2018年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:m2018824，该菌能耐受较高温度，可以耐受40℃。

本发明所述的一株耐热醋酸菌(acetobacterpasteurianus)nf-171形态特征为：在固体培养基(葡萄糖1％，酵母膏1％，caco32％，无水乙醇4％vol，琼脂2％，自然ph值)上菌落形态呈圆形，表面光滑，有凸起，菌落周围有明显的碳酸钙透明圈。对菌种nf-171进行革兰氏染色，呈阴性反应。在光学显微镜下，无芽孢，呈短杆状，单个或成对、成链排列，后期部分呈长杆、丝状。(如图1，图2所示)。

本发明所述的一株耐热醋酸菌(acetobacterpasteurianus)nf-171，它的its碱基序列如下：

catggggggctgcttacacatgcaagtcgcacgaaggtttcggccttagtggcggacgggtgagtaacgcgtaggtatctatccatgggtgggggataacactgggaaactggtgctaataccgcatgacacctgagggtcaaaggcgcaagtcgcctgtggaggagcctgcgtttgattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgatgatcaatagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttcgacggggacgatgatgacggtacccgtagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctcggaatgactgggcgtaaagggcgtgtaggcggtttgtacagtcagatgtgaaatccccgggcttaacctgggagctgcatttgatacgtgcagactagagtgtgagagagggttgtggaattcccagtgtagaggtgaaattcgtagatattgggaagaacaccggtggcgaaggcggcaacctggctcattactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtgtgctagatgttgggtgacttagtcattcagtgtcgcagttaacgcgttaagcacaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagggcttgaatgtagaggctgcaggcagagatgtctgtttcccgcaagggacctctaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatctttagttgccatcaggttgggctgggcactctagagagactgccggtgacaagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggaagctaggtggtgacaccatgctgatctctaaaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtttgaccttaagccggtgagcgaaccgcaaggacgcagccgaccacgtcgttaggggt

实施例1：本发明耐乙醇醋酸菌(acetobacterpasteurianus)nf-171的分离

(1)富集培养：吸取1ml南丰蜜桔果醋陈酿原浆加入到含有50ml富集培养液的250ml的三角瓶中，在30℃，150r/min的摇床中培养3d，选取有醋酸味的三角瓶进行下一步的菌种分离。

(2)菌种分离纯化：取1ml富集培养菌液，稀释至10^-6～10^-8浓度，涂布在初筛培养皿中，放置在培养箱中30℃培养3d。每天观察培养情况，记录下透明圈情况。选择透明圈大的菌株(透明圈直径/菌株直径即dp/dc)。

(3)菌株复筛：对初筛获得的菌株，进行摇瓶液体培养(培养基中添加4％无水乙醇)复筛，30℃，150r/min培养3d。将菌液10000r/min离心3min，取上清液1ml，加20ml蒸馏水稀释，再用0.05mol/l的naoh滴定至浅粉色，再滴加5％的fecl3，煮沸5min，若出现了红色褐色絮状沉淀初步判断为醋酸产生菌。经过初筛，复筛得到一株能产醋酸的菌株nf-171(如图1，图2)。

实施例2醋酸菌的鉴定

(1)对菌株nf-171进行形态学，进行鉴定醋酸菌的生理生化试验参照伯杰士细菌鉴定手册(第八版)。如下表1所示，为巴氏醋酸杆菌nf-171的筛选结果及部分生理生化结果：

表1

(2)16srdna鉴定：

将斜面接种的nf-171置于恒温培养箱中32℃培养3天，当菌体长满整个斜面时，取出提取dna。

利用细菌dna提取试剂盒的操作说明对所筛选的菌株进行菌株dna提取。并对所提的dna样品，选用细菌16srdna的通用引物(27f:50-agagtttgatcmtggctcag和1492r:50-tacggytaccttgttacgactt)对16srdna进行pcr扩增。pcr扩增体系为20μlpcdmix、2μl引物27f、2μl引物1492r、1μl模板及15μldd水；反应在95℃变性2min，95℃复性30s，55℃延伸30s，72℃退火90s，整个过程循环30次后72℃再培养5min，使反应物充分扩增后再逐渐冷切至4℃，取出样品后取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测其pcr结果及纯度。

将pcr样品送至上海生工，进行16srdna基因序列分析。根据上海生工提供的检测结果中的16srdna基因序列，在ncbi数据库中找到同源性最大的相关菌种，之后进行系统发育分析，利用mega7对所得到的dna序列进行同源性比对，并构建其系统发育进化树。(如图3)

实施例3：耐高温实验

将通过产酸定量实验筛选得到的高产酸醋酸菌于32℃，150r/min振荡培养(22±2)h活化后，分别接种于乙醇含量分别为4％(v/v)的产酸培养基中，29℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃，150r/min振荡培养72h，测定菌株产酸量。相同条件下，测定菌株的产酸量(如图4)。

实施例4：南丰蜜桔果醋发酵过程

取实验室酿造的南丰蜜桔果酒250ml分装于50ml的离心管中，10000r/min离心10min，取上清液80ml装入250ml的锥形瓶中，75℃、15分钟，灭菌，取出放操作台室温下培养24h，再次与75℃、15分钟，灭菌，重复三次。

取培养了24h的nf-171种子液8ml接种于灭好菌的果酒中，40℃、150r/min振荡培养，每24h取样2ml，测定菌株的产酸量。结果如图5所示。所有实验重复三次。

实施例5对南丰蜜桔果醋进行各营养成分检测

取实验室所酿的果醋，12000r/min离心10min，再取上清液，0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液10μl，用流动相稀释100倍，采用高效液相色谱法对部分营养成分进行检测，其中包括有机酸、黄酮、酚类。(结果如表2所示)。

以上所述的实例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。