一种抗肿瘤的水凝胶多肽和制法的制作方法

本发明涉及生物医药领域，更特别地，涉及一种抗肿瘤的水凝胶多肽和制法，该多肽可促进活性多肽细胞摄取效率和胞浆定位、可自组装形成水凝胶。

背景技术：

目前，恶性肿瘤已经严重威胁人类健康，传统的治疗手段(包括手术治疗、化学治疗、放射治疗等)不仅选择性低、毒副作用大，且容易产生治疗耐药或抵抗。抗肿瘤活性多肽是一类功能性的氨基酸序列，各种小分子多肽能通过不同的机制来抑制肿瘤细胞的生长，其具有较好的生物安全性和特异性。但在抗肿瘤应用上面临的主要问题有两点：①很多活性多肽无法高效进入肿瘤细胞，无法有效发挥抗肿瘤作用；②多肽一般通过内吞进入细胞，主要聚集在内体/溶酶体中，而多肽一般只有进入细胞胞浆中才能有效发挥抗肿瘤效应。比如kla多肽可定位于细胞线粒体，通过破坏线粒体膜而发挥抗肿瘤作用，但是其穿透细胞膜能力极低，且进入细胞后主要定位于内体/溶酶体中，无法高效从内体/溶酶体中释放出来从而到达位于细胞胞浆中的线粒体。因此，急需建立有效方法和手段解决以上问题。

目前，针对活性肽细胞摄取低主要采用三种方法解决：①对活性肽进行改性，主要在活性肽基础上引入穿模肽或靶向肽，通过构建融合多肽的方式提高细胞摄取效率；②采用纳米颗粒载体负载活性肽，通过肿瘤细胞对纳米颗粒的增强的特异性或非特异性摄取而实现；③通过电穿孔等手段改变细胞膜的通透性。引入穿模肽或靶向肽需要对活性肽本身进行重新设计，操作比较复杂，有可能会改变活性肽本身的特性。采用纳米颗粒载体负载活性肽可以帮助其更好进入细胞，但是未能改变其细胞内的定位。电穿孔等手段在体外有一定的作用，但无法应用于在体研究，且往往对细胞的毒性较大。因此，我们可以考虑借鉴纳米材料的递送优势，以及电穿孔的细胞定位特点，设计一种能用于活体实验，安全和更容易操作的方法。

针对肿瘤的局部给药治疗实体恶性肿瘤已经取得了快速进展，这种方法不仅可以提高药物的缓释性和靶向性，还可以减低化疗药物的全身毒副作用。多肽水凝胶是由自组装多肽分子在阳离子或一定的ph条件下触发形成的、具有网状结构的纳米纤维水凝胶材料。这种材料经局部注射后可维持凝胶状态，降解产物为氨基酸，因此生物相容性较好。目前，rada-16分子，即(rada)4是比较常用的自组装多肽分子，也可携载功能片段形成融合多肽的方式获得功能性的水凝胶。

蜂毒肽(melittin，mlt)是一种两亲性的α螺旋结构的多肽，是蜂毒中的最主要活性成分。蜂毒肽对于细胞膜结构具有极其高效的破坏性，其作用机制主要是通过其两亲性的结构基团嵌入至膜结构中，在膜上打孔，致使膜结构发生破裂，从而导致细胞内含物外流而引起细胞死亡。我们设想，若能采用构建功能性水凝胶的方式，最大程度的降低蜂毒肽的杀伤能力，又能保持其对细胞膜打孔的特性，将有可能实现活性多肽的细胞摄取和胞浆定位。

因此，如何研制出一种安全、生物相容性好、能促进活性多肽细胞摄取效率和胞浆定位、具有抗肿瘤活性的功能性水凝胶载体，是一个亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抗肿瘤的水凝胶多肽及制法，可解决促进活性多肽细胞摄取效率和胞浆定位，解决一种抗肿瘤的水凝胶多肽及制法技术问题。

本发明采用如下技术方案：

一种抗肿瘤的水凝胶多肽，包括c端的自组装结构域和n端的杀伤结构域，所述自组装结构域和所述杀伤结构域通过柔性结构域连接；

所述自组装结构域的氨基酸序列如seqidno.1；

所述杀伤结构域为蜂毒肽，所述蜂毒肽的氨基酸序列如seqidno.2；

所述柔性结构域的氨基酸序列为gg。

一种抗肿瘤的水凝胶多肽在制备抗肿瘤复合物中的应用。

一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂，所述的一种抗肿瘤的水凝胶多肽搭载抗肿瘤活性多肽制得，所述抗肿瘤活性多肽的氨基酸序列如seqidno.3。所述抗肿瘤活性多肽主要通过与水凝胶多肽结合而负载到水凝胶的网状孔洞中。

一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂的制备方法，包括以下步骤：

1)配制抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液和抗肿瘤活性多肽的水溶液；

2)将所述步骤1)中制得的抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液和抗肿瘤活性多肽的水溶液混合，得到混合溶液；

3)将nacl溶液逐滴加入步骤s2制得的混合溶液中，直至nacl溶液浓度为0.9％，静置、经氨基酸分子间的氢键作用自组装即得到一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂；所述nacl溶液的初始浓度为10％。

所述步骤2)中得到的混合溶液中的抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液的浓度为5-40mg/ml。

所述步骤2)中得到的混合溶液中的抗肿瘤活性多肽的水溶液的浓度为2-4mg/ml。

所述步骤3)中氨基酸分子间的氢键作用自组装的反应条件为，在4℃下静置2-12小时。

本发明具有以下优点：

①促进活性多肽细胞摄取效率和胞浆定位，具有抑制肿瘤细胞生长的作用；

②(rada)5-6-melittin融合多肽可以自组装形成自身具有抗肿瘤活性的水凝胶材料；

③本发明提供的抗肿瘤的水凝胶多肽，在本发明目的完成之后，在后续的临床应用中，可以通过反复多次局部注射直接将水凝胶负载活性多肽后的缓释药剂注射到瘤体内或瘤旁，可增强局部抗肿瘤效果，同时可减少患者副作用及经济负担；

④本发明提供的抗肿瘤的水凝胶多肽，在体内经过生物化学反应后，反应降解产物为氨基酸，不产生免疫反应和炎症反应；

⑤制备工艺简单，便于规模化生产。

附图说明

图1为mr-kla水凝胶的电镜图；

图2为体外mr52肽水凝胶促进kla杀伤肿瘤细胞的光镜图；

图3为采用cck8实验定量研究mr52肽促进kla杀伤肿瘤细胞作用的统计图；

图4为采用流式细胞术定量研究mr水凝胶52肽促进活性多肽kla进入肿瘤细胞的数量直方图；

图5为采用流式细胞术定量研究mr水凝胶52肽促进活性多肽kla进入肿瘤细胞的平均荧光强度统计图；

图6为激光共聚焦拍摄mr52肽促进荧光标记的活性多肽kla-fitc胞浆定位图；

图7为mr水凝胶装载kla治疗小鼠ct26结肠癌皮下瘤的效果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一种抗肿瘤的水凝胶多肽，包括c端的自组装结构域和n端的杀伤结构域，所述自组装结构域和所述杀伤结构域通过柔性结构域连接；

所述自组装结构域的氨基酸序列如seqidno.1，具体为(rada)5-6。

所述杀伤结构域为蜂毒肽，所述蜂毒肽的氨基酸序列如seqidno.2，具体为gigavlkvlttglpaliswikrkrqq。

所述柔性结构域的氨基酸序列为gg。

一种抗肿瘤的水凝胶多肽在制备抗肿瘤复合物中的应用。

一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂，所述的一种抗肿瘤的水凝胶多肽搭载抗肿瘤活性多肽制得，所述抗肿瘤活性多肽的氨基酸序列如seqidno.3，具体为klaklakklaklak。

一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂的制备方法，包括以下步骤：

1)配制抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液和抗肿瘤活性多肽的水溶液；

2)将所述步骤1)中制得的抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液和抗肿瘤活性多肽的水溶液混合，得到混合溶液；

3)将nacl溶液逐滴加入步骤s2制得的混合溶液中，直至nacl溶液浓度为0.9％，静置、经氨基酸分子间的氢键作用自组装即得到一种抗肿瘤蜂毒肽水凝胶缓释药剂；所述nacl溶液的初始浓度为10％。

所述步骤2)中得到的混合溶液中的抗肿瘤的水凝胶多肽水溶液的浓度为5-40mg/ml。

所述步骤2)中得到的混合溶液中的抗肿瘤活性多肽的水溶液的浓度为2-4mg/ml。

所述步骤3)中氨基酸分子间的氢键作用自组装的反应条件为，在4℃下静置2-12小时。

以下结合具体实验验证本发明的效果。

1.配置mr-kla(自组装蜂毒肽水凝胶-抗肿瘤活性多肽复合物)

取5mg无菌kla粉末溶解于328ul无菌三蒸水中，获得摩尔浓度为10mm的kla溶液。配置20mg/ml的mr水凝胶，与kla溶液等体积混合，获得mr-kla水凝胶，其中mr浓度为10mg/ml，kla浓度为5mm。将该混合液置于4℃下放置2小时即可形成凝胶。

2.体外mr促进kla杀伤肿瘤细胞；

ct26细胞培养处于对数生长期。24孔板每孔接种4x10*4细胞，在37.0℃、co2浓度为5％的培养箱孵育至细胞贴壁。设置分组为：control组、kla组、mr组、mrk(mr包载kla)组。每孔换上500ul新鲜培养基，给药处理使每500ul体系含有15ulmr，kla终浓度为150um。药物作用48h后，光镜下观察细胞的生长状况并拍照如图2，可见kla组或者mr组肿瘤细胞数量与control组并无明显差别，而mrk组细胞数量明显减少，提示mr可有效促进kla多肽杀伤肿瘤细胞。

3.cck8实验定量研究mr52肽促进kla杀伤肿瘤细胞作用

ct26细胞培养处于对数生长期。96孔板每孔接种5000个细胞，37.0℃、5％co2培养箱孵育至细胞贴壁，贴壁后每孔换150ul培养基。设置分组为kla、mr+kla。kla浓度梯度为：0um、100um、150um、200um、250um、300um。mr+kla组每孔加入3.0ul10mg/mlmr。药物作用48h后弃培养基，加入含有6％cck8试剂的培养基，培养箱避光孵育1.5h后，酶标仪检测吸光度od值。统计分析后得图3，如图可见，与单独的kla相比，加入了mr后，细胞的增殖明显受到抑制。提示mr可有效促进kla抑制细胞生长。

4.mr52肽水凝胶促进活性多肽kla进入肿瘤细胞

本部分实验使用fitc(异硫氰酸荧光素)标记的kla。ct26细胞培养处于对数生长期。24孔板每孔接种1x10*5个细胞，37.0℃、5％co2培养箱孵育至细胞贴壁，贴壁后每孔换150ul培养基。设置分组为kla组、mrk组。将kla和mrk分别加入到孔板中，使500ul体系中含有15ulmr，kla终浓度为10um。作用3h后弃培养基，收集细胞，pbs(磷酸缓冲盐溶液)洗涤2遍后，流式细胞术检测fitc+ct26细胞的比例及平均荧光强度。统计分析后得图4、5，由图可见，mrk组fitc+ct26细胞即摄取了kla-fitc的细胞数目明显多于kla组，提示mr可有效促进kla进入细胞中。

5.激光共聚焦拍摄mr促进kla定位于胞浆。

本部分实验使用fitc标记的kla；ct26细胞培养处于对数生长期。24孔板放置12mm的小圆玻片，每孔接种1x10*5个细胞，37.0℃、5％co2培养箱孵育至细胞贴壁，贴壁后每孔换500ul培养基。加入15ulmrk，使kla-fitc终浓度为5um。培养箱孵育3h后弃培养基，pbs洗涤2遍以去除非特异性黏附的kla-fitc。2％多聚甲醛固定30min后，pbs洗涤1次。加入用pbs1：1000稀释的鬼笔环肽，避光37℃孵育1h，pbs洗涤1次。室温下dapi染色10min后pbs洗涤。将小圆玻片取出置于滴加了抗荧光淬灭剂的载玻片上，4℃避光保存。共聚焦拍摄得图6，如图绿色表示kla-fitc，红色为细胞骨架蛋白，蓝色为细胞核。提示mr可以促进kla进入细胞内，进而使kla发挥抗肿瘤作用。

6.在体研究mr促进kla抗肿瘤作用的动物实验

ct26细胞培养处于对数生长期。收集细胞，pbs洗涤后调整细胞浓度为1x10*7/ml，每只小鼠右侧后肢皮下注射50ul细胞悬液。待肿瘤生长至40-50mm3，随机分为4组，分别为pbs组、kla组、mr组、mrk组，每组5-6只鼠。每只鼠瘤旁注射kla15mg/kg，10mg/mlmr150ul。每隔一天用游标卡尺和体重计测量小鼠的肿瘤大小及体重，得到结果如图7。可见mrk组小鼠肿瘤体积明显较mr组、kla组小，且差异具有统计学意义。证明在体内，mr可有效促进kla杀伤肿瘤。mr包载kla瘤旁局部注射是一个有效的治疗策略。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种抗肿瘤的水凝胶多肽和制法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4

<212>prt

<213>自组装结构域(人工序列)

<400>1

argalaaspala

1

<210>2

<211>26

<212>prt

<213>蜂毒肽(mlt)

<400>2

glyileglyalavalleulysvalleuthrthrglyleuproalaleu

151015

ilesertrpilelysarglysargglngln

2025

<210>3

<211>14

<212>prt

<213>抗肿瘤活性多肽(人工序列)

<400>3

lysleualalysleualalyslysleualalysleualalys

1510