油茶良种赣兴46的特征性核苷酸序列、特异性引物及鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及油茶良种赣兴46的特征性核苷酸序列、特异性引物及鉴定方法。

背景技术：

油茶(camelliaoleifera)是我国南方重要的木本油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料植物。其主产品茶油富含多不饱和酸，是优质的保健食用油，被称之为东方的橄榄树。

目前，我国油茶林总面积达5000多万亩，但产量仍然很低，平均每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是绝大部分林地为低产油茶林，品种质量差，国家和省级审(认)定的优良品种没有及时得到推广应用，此外，一些地方良种意识淡薄、良种推广力度不高，加上经营管理粗放。因此，加快油茶优良种的推广及配套栽培管理力度。是保障油茶产业又好又快发展的关键。

目前我国对油茶种苗质量的监督管理，主要依靠管理层面制定的各项制度，而在技术层面尚未取得关键性突破，特别是缺乏油茶良种的早期快速鉴别技术体系。目前通过国家林木良种审定的18个赣无系列品种分别为赣无1号、赣无2、赣永5、赣永6、赣8、赣无11、赣无12、赣抚20、赣无24、赣兴46、赣兴48、赣70、赣石83-1、赣石83-4、赣石84-3、赣石84-8、赣190、赣447。这些油茶良种具有早实丰产、稳产、抗性强、适应性广等特点。对油茶种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上油茶种苗的混乱局面，并首先从技术层面上对赣无系列油茶良种进行鉴别保护。

目前对油茶品种的鉴别主要依据表观特征，但由于油茶良种的形态性状较相似，形态鉴定较困难，并且许多形态性状鉴定的周期长、受环境影响大，并且随着品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自20世纪以来，一些基于pcr的分子标记技术如rapd(randomamplifiedpolymorphicdna，随机扩增多态性dna)、issr(inter-simplesequencerepeat，简单序列重复区间扩增多态性)和srap(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性)相继用于了油茶的种质资源遗传多样性等研究，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间的分子鉴别研究很少。况且，这些分子标记技术所采用的均为通用引物，其pcr扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴别，只有开发出某个品种稳定、特异的dna指纹标记才能真正用于该品种的准确快速鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供油茶良种赣兴46的特征性核苷酸序列、特异性引物及鉴定方法。

本发明经过大量筛选试验获得油茶良种赣兴46的特异性dna片段，发明人据此设计并制备了用于快速鉴定油茶良种赣兴46的特异性引物，以该特异性引物对油茶良种进行pcr扩增，仅赣兴46可稳定获得441bp大小的特异性片段(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，而其他油茶品种均不能获得该特异性片段。需要说明的是，本发明的特异性引物仅限于油茶良种的鉴别(鉴别其是否为赣兴46)，即待测样品仅限于油茶。

本发明方法关键在于特征性核苷酸序列和扩增引物的选择，dna提取、pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

因此，本发明的第一个目的是提供一种快速鉴定油茶良种赣兴46的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定油茶良种赣兴46的特异性引物，所述的特异性引物包括：

上游引物：5’-gactgcgtacgaattcaagaggtggt-3’(如seqidno.2所示)；

下游引物：5’-gagtccaaaccggataacaaagacgt-3’(如seqidno.3所示)。

本发明的第三个目的是提供一种油茶良种赣兴46的快速鉴定试剂盒，包括所述的特异性引物，所述的特异性引物包括：

上游引物：5’-gactgcgtacgaattcaagaggtggt-3’(如seqidno.2所示)；

下游引物：5’-gagtccaaaccggataacaaagacgt-3’(如seqidno.3所示)。

本发明的第四个目的是提供一种利用所述的特异性引物对油茶良种赣兴46进行快速鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测油茶品种的基因组dna作为模板，以所述的特异性引物作为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现dna条带，则待测油茶品种为油茶良种赣兴46，若电泳结果没有出现dna条带，则待测油茶品种不是油茶良种赣兴46；所述的特异性引物包括：

上游引物：5’-gactgcgtacgaattcaagaggtggt-3’(如seqidno.2所示)；

下游引物：5’-gagtccaaaccggataacaaagacgt-3’(如seqidno.3所示)。

所述的pcr扩增的反应体系总体积优选为20μl，包括premistaqmix10μl，10μm上、下游引物各0.8μl，模板dna54ng，余量为ddh2o。

所述的pcr扩增的反应条件优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min。

本发明有益效果主要体现在：本发明的特异性引物可对油茶良种赣兴46进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。

附图说明：

图1为对油茶良种进行pcr扩增的结果；m为takaradl2000marker；编号1～18代表油茶良种依次为：1：赣无1号；2：赣无2；3：赣永5；4：赣永6；5：赣8；6：赣无11；7：赣无12；8：赣抚20；9：赣无24；10：赣兴46；11：赣兴48；12：赣70；13：赣石83-1；14：赣石83-4；15：赣石84-3；16：赣石84-8；17：赣190；18：赣447。

具体实施方式：

以下结合具体实施例是对本发明的进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1：

(1)油茶良种基因组dna的提取：

取待测油茶良种幼嫩叶片0.3g，加液氮彻底磨碎，采用ctab法提取待测油茶的基因组dna，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸蛋白测定仪(ulite，bio-rad)检测样品的完整性、纯度和浓度，od260/od280为1.8-1.9的dna样品用于后续的pcr扩增，dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异pcr扩增引物，引物对的序列为：

上游引物5’-gactgcgtacgaattcaagaggtggt-3’(如seqidno.2所示)和下游引物：5’-gagtccaaaccggataacaaagacgt-3’(如seqidno.3所示)，由上海生物工程技术有限公司合成。

(3)pcr扩增：

pcr反应液组成：premistaq^tmmix(takarataq^tmversion2.0plusdye,rr901a,takara)10μl，10μm上下游引物各0.8μl，30ng/μl模板dna1.8μl，ddh2o6.6μl。

扩增反应在pcr仪(t100，bio-rad)上进行。

扩增条件：

94℃预变性5min；

94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)pcr扩增产物6μl，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×tae缓冲液中，100v电压下电泳，电泳结束后eb染色，在美国伯乐自动凝胶图像分析仪(伯乐，型号：geldocxr+，bio-rad，usa)上照相。

按照上述方法，分别对多个油茶良种(编号1～18代表油茶良种依次为：1：赣无1号；2：赣无2；3：赣永5；4：赣永6；5：赣8；6：赣无11；7：赣无12；8：赣抚20；9：赣无24；10：赣兴46；11：赣兴48；12：赣70；13：赣石83-1；14：赣石83-4；15：赣石84-3；16：赣石84-8；17：赣190；18：赣447)的特异引物pcr扩增图谱进行电泳检测(油茶良种均来自江西省林科院国家油茶良种基地种子园)，结果见图1。

图1中只有编号为10的油茶良种赣兴46中扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量为441bp大小的特异dna条带(如seqidno.1所示)，其余编号的赣无油茶良种，未见有该441bp大小的特异dna条带产生，可见本发明的特异性引物用于油茶良种赣兴46的鉴别，其稳定性、特异性非常高。

序列表

<110>江西省林业科学院

<120>油茶良种赣兴46的特征性核苷酸序列、特异性引物及鉴定方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>441

<212>dna

<213>油茶(camelliaoleifera)

<400>1

gactgcgtacgaattcaagaggtggtgtaacaaccctaatctttgccatagttatgtttg60

catacattcatgaatgtccttgtttgatatgattacaagcttgttttgccttggtttgtt120

tgaagtattgcttgtttgatgttgatccttgctcagttgtggccgagatcgccttgagct180

ttgttcactcttgagccttagtacatagaaccgtctggaaccacttggttgatcgttatc240

ttaacctcggcatgtttgccgcgatgtcaccctttgggccgaagtgcttagagcctaggc300

cgagatgttttgcattagtactccttacttgggggcaggtatgacctaggccgagatgtg360

gcacacccaggccaaggtgtggtacagcttagtcaagtgtcgtcctccctagccgacgtc420

tttgttatccggtttggactc441

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gactgcgtacgaattcaagaggtggt26

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gagtccaaaccggataacaaagacgt26