甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用的制作方法

本发明是关于甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用，具体地说，是关于血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为肿瘤相关疾病药物靶点及其应用，特别涉及血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段作为药物筛选靶点、以及其抑制剂和/或拮抗剂在治疗癌症中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是全球性的常见病及多发病，是危害人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤是一种类系统性疾病，涉及细胞的异常增殖、侵袭以及向身体其他部位的转移。常见症状包括肿块、异常流血、久咳不愈、体重下降及肠道蠕动异常。男性中最常见的癌症类型包括肺癌、前列腺癌、结直肠癌和胃癌；女性中最常见的癌症类型包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌和宫颈癌；儿童中，除非洲非霍奇金淋巴瘤最常见外，急性淋巴细胞性白血病和脑癌是发病率最高的癌症类型(worldhealthorganization，2014)。2012年约有16.5万名15岁以下的儿童被诊断患有癌症。癌症发病率随年龄增长而显著上升，而且多种癌症类型在发达国家也为常见。随着人们生活方式的改变，发展中国家的癌症发病率也不断上升。我国2015年约有429.2万例新增癌症病例，平均每天新增1.2万例；同时约有281.4万人死于癌症，平均每天死亡例数达7500例。其中肺和支气管癌、胃癌、肝癌、食道癌和结直肠癌占所有癌症死亡情况的四分之三(cacancerjclin.2016；66:115-132.)。我国恶性肿瘤发病率近年来呈持续高发趋势，已成为国内居民的首要死因。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，gapdh)是糖酵解过程中重要的酶。分子量37kda，催化3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde3-phosphate)到1,3-二磷酸甘油酸的反应(d-glycerate1,3-bisphosphate)。除此众所周知的代谢调控功能外，近几年研究证明gapdh还参与了许多非代谢调控过程，包括转录激活(oncogene.2007；26(18):2606–2620.)等。

有研究报道在黑色素瘤(anticancerresearch.2013；35(1):439–444.)和非小细胞肺癌组织中(plosone.2013；8(4):e61262)gapdh的mrna水平显著上升，且表达水平与肿瘤恶性程度正相关。这是因为gapdh在糖酵解过程中的重要作用以及其抗凋亡功能对肿瘤细胞的增殖和保护也十分重要，例如gapdh可以保护因化疗药物的作用导致的端粒缩短。但如果氧化压力等条件破坏了gapdh的功能，细胞就会老化或者死亡(clinicalandexperimentalpharmacology&physiology.2012；39(8):674–679.)，gapdh的缺失同样会导致肿瘤细胞老化(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2011；411(2):409–415.)。我国科研工作者针对gapdh在肿瘤中转录水平升高也有过类似报道，例如利用荧光定量pcr方法检测乳腺癌患者血清中的游离dna，结果发现84.5％的乳腺癌患者dna检测为阳性，i～ii期乳腺癌患者阳性率为84％(肿瘤2011；31(12)：1099-1102)。目前，相关研究主要集中在几个瘤种中gapdh基因水平，特别是mrna的表达量的变化与肿瘤的关系，其蛋白水平的表达和变化情况鲜有报道。

经查，未见关于gapdh与肿瘤发生发展的相关性以及gapdh作为肿瘤及其相关疾病药物筛选靶点的应用报道。

技术实现要素：

本发明的主要内容涉及gapdh与肿瘤发生发展的相关性以及gapdh作为肿瘤及其相关疾病药物筛选靶点的应用。

本案发明人在研究中发现，人宫颈癌细胞hela分泌甘油醛-3-磷酸脱氢酶显著高于人正常细胞hek293，癌症患者血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量显著高于健康人。并进一步研究发现甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够促进癌症细胞增殖和迁移；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体均能抑制肿瘤生长，抑制黑色素瘤转移，证明了甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

从而，本发明提供了血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用。

具体而言，一方面，本发明提供了血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段作为靶点在开发、筛选和/或制备用于防治和/或抑制肿瘤相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段包括如下a、b和c所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段：

a.由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；

b.由a限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的具有与a相同或相似功能的蛋白或其免疫性片段；

c.与a所示的氨基酸序列具有75％以上同源性且具有与a相同或相似功能的衍生蛋白或其免疫性片段。

根据本发明的具体实施方案，由a限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的具有与a相同或相似功能的蛋白或其免疫性片段，是指所述的由a限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的衍生的蛋白或其免疫性片段，与本发明的seqidno:2所示氨基酸序列组成的蛋白具有相同或相似的生物学功能。

根据本发明的具体实施方案，与a所示的氨基酸序列具有75％以上同源性且具有与a相同或相似功能的衍生蛋白或其免疫性片段，优选与a所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，更优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更进一步特别优选超过99％的序列同源性。这些衍生蛋白或其免疫性片段与本发明的seqidno:2所示氨基酸序列组成的蛋白具有相同或相似的生物学功能。

根据本发明的具体实施方案，本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用中，所述肿瘤相关疾病包括但不局限于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或甲状腺瘤。

另一方面，本发明还提供了所述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段在制备促进肿瘤细胞增殖和/或促进肿瘤细胞迁移的制剂中的应用。

根据本发明的具体实施方案，优选地，所述肿瘤细胞包括但不局限于肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞、淋巴瘤细胞或甲状腺瘤细胞。

另一方面，本发明还提供了针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂在制备用于防治和/或抑制肿瘤相关疾病的药物中的应用。

另一方面，本发明还提供了针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂在制备用于抑制肿瘤细胞增殖和/或迁移侵袭的制剂中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用中，针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂为抗体、竞争性多肽或化合物。优选地，针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂为抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抗体；更优选为单克隆抗体。在本发明的一些具体实施方案中，针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂为针对血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的抑制剂或拮抗剂。

另一方面，本发明还提供了甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段、或编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的多核苷酸在制备肿瘤防治性疫苗中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段包括如下a、b和c所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段：

a.由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白或其免疫性片段；

b.由a限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的具有与a相同或相似功能的蛋白或其免疫性片段；

c.与a所示的氨基酸序列具有75％以上同源性且具有与a相同或相似功能的衍生蛋白或其免疫性片段。

根据本发明的具体实施方案，本发明的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用中，所述肿瘤包括但不局限于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤。

根据本发明的一些具体实施方案，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫性片段包括seqidno.5所示氨基酸序列组成的多肽片段。

根据本发明的一些具体实施方案，编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的多核苷酸包括编码seqidno.2或seqidno.5所示的氨基酸序列的多核苷酸。在一些更具体的实施方案中，编码所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的多核苷酸包括seqidno.1及其密码子优化后的多核苷酸序列seqidno.3或seqidno.4所示多核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，证明了癌症细胞大量分泌甘油醛-3-磷酸脱氢酶到细胞培养基中。本发明的另一些具体实施方案发现，肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤患者血清中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量显著高于健康人。向肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937培养基中添加甘油醛-3-磷酸脱氢酶显著促进了癌细胞的增殖和迁移能力。证明胞外甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有促进肿瘤细胞增殖和迁移的能力。说明血液中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶可作为肿瘤相关疾病药物的靶点。阻断其功能可显著抑制肿瘤的生长和转移。

在本发明的一些具体实施方案中，综合运用质粒构建、原核表达、亲和层析等方法制备和纯化甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段(序列如seqidno.5所示)，并使用sds-page、westernblot和maldi-tof-ms等分析方法进行验证，确认制备的蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段。

在本发明的一些具体实施方案中，使用制备的甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段，综合运用免疫小鼠、细胞融合及亲和层析等方法制备了抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段单克隆抗体，并将其用于肿瘤生长和转移的抑制。

在本发明的一些具体实施方案中，利用小鼠模型，使用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段单克隆抗体成功抑制了肿瘤的生长。具体的，本发明分别将人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937接种于balb/c-null裸鼠右后肢皮下，待肿瘤长至一定体积后定期注射抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段单克隆抗体，同时定期监测小鼠体重和肿瘤体积。实验持续6-7周时间。实验结束后比较对照igg组与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体组的肿瘤生长差异。本发明发现抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段单克隆抗体抑制了肿瘤的生长。结果表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有促进肿瘤生长的作用，将其抑制可显著抑制肿瘤的生长。说明甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

在本发明的一些具体实施方案中，利用小鼠模型，本发明还使用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体成功抑制了肿瘤的转移。具体的，本发明将小鼠黑色素瘤b16-f10细胞尾静脉注射于c57小鼠体内使其形成肺转移，同时定期注射抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体。实验持续18天，待实验结束后比较对照igg组与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体组肺组织中黑色素瘤的转移情况。本发明发现抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体抑制了肿瘤的转移。结果表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有促进肿瘤转移的作用，将其抑制可显著抑制肿瘤的转移。再次说明甘油醛-3-磷酸脱氢酶可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

本发明中各氨基酸和核苷酸序列如下：

seqidno.1：

atggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaa

seqidno.2：

mgkvkvgvngfgrigrlvtraafnsgkvdivaindpfidlnymvymfqydsthgkfhgtvkaengklvingnpitifqerdpskikwgdagaeyvvestgvfttmekagahlqggakrviisapsadapmfvmgvnhekydnslkiisnascttnclaplakvihdnfgiveglmttvhaitatqktvdgpsgklwrdgrgalqniipastgaakavgkvipelngkltgmafrvptanvsvvdltcrlekpakyddikkvvkqasegplkgilgytehqvvssdfnsdthsstfdagagialndhfvkliswydnefgysnrvvdlmahmaske

seqidno.3：

atgggcaaagttaaagttggggttaatgggtttgggcggattggtcggttagttacgcgtgcggcctttaatagcgggaaagttgacattgttgcgattaatgacccgtttattgacttaaattacatggtgtatatgttccagtacgatagtacccacggtaaatttcatggtaccgttaaagccgagaatgggaaactggtgattaatggtaatccgattaccatctttcaagagcgtgatccgagtaaaattaagtggggtgatgcaggtgcagaatacgttgttgagagcaccggagtttttaccaccatggaaaaagcaggcgcacaccttcagggcggcgcgaaaagagtaattatttcagcgccgagcgcagatgcaccaatgtttgttatgggggttaatcatgaaaaatacgataatagcctgaagatcattagtaatgcaagctgtacaacaaattgtttagcaccgttagccaaagttattcatgataatttcgggattgtggaaggtctgatgaccacagttcacgcaatcaccgccacccagaagaccgttgatggtcctagcggaaaactgtggcgtgatgggagaggtgcactgcagaatatcattccggccagtacaggtgccgcgaaagcagttggtaaagttatcccagaattaaatggcaaactgacaggtatggcattcagagtgccgaccgcaaacgttagcgtcgttgacctgacctgtcgtttagaaaaaccggcaaaatatgatgatatcaaaaaggttgtgaagcaggcgagcgaaggaccgctgaaaggcatactgggttataccgaacatcaagttgtttctagcgactttaatagcgatacccacagtagcacctttgatgcaggagcgggtattgcgttaaatgatcattttgttaagctgattagctggtatgataacgaattcggttatagtaatcgggttgttgacctgatggcacacatggcaagcaaggaataa

seqidno.4：

atggtggaaggcttaatgacgacggttcatgcgattacggccacgcagaaaaccgttgacgggccgtcggggaaactgtggcgggacggtcggggtgcactgcagaacattattccggcgagtaccggtgcagccaaagcagttggtaaagttattccggaattaaacggaaaactgacaggtatggcattccgtgttcctaccgcaaatgtgagcgttgttgatctgacctgtcgtttagaaaagccggcaaaatatgatgatatcaaaaaggttgtgaagcaggcaagcgaaggcccgctgaaaggtattctgggttataccgagcatcaggttgtttcatcagacttcaatagcgacacccatagcagcacctttgatgcaggagcaggtattgcattaaatgatcattttgttaagctgatcagctggtatgataatgaattcggttatagtaaccgtgttgttgatttaatggcacacatggcaagcaaggagtaa

seqidno.5：

mveglmttvhaitatqktvdgpsgklwrdgrgalqniipastgaakavgkvipelngkltgmafrvptanvsvvdltcrlekpakyddikkvvkqasegplkgilgytehqvvssdfnsdthsstfdagagialndhfvkliswydnefgysnrvvdlmahmaske

综上所述，本发明提供了血液中甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段作为药物筛选靶点的应用，也提供了甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫性片段的抑制剂和/或拮抗剂在治疗癌症中的应用。

附图说明

图1：人正常细胞hek293、人宫颈癌细胞hela分泌甘油醛-3-磷酸脱氢酶测试结果。

图2：癌症患者血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量检测结果。

图3：重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，未诱导；2，诱导后；3，诱导碎裂后上清；4，诱导碎裂后沉淀。

图4：重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段表达结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，未诱导；2，诱导后；3，诱导碎裂后上清；4，诱导碎裂后沉淀。

图5：重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶纯化结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，破碎后处理样品；2，流出；3，洗脱。

图6：重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段纯化结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，破碎后处理样品；2，流出；3，洗脱。

图7：westernblot鉴定重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶实验结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，纯化后样品。

图8：westernblot鉴定重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段实验结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，纯化后样品。

图9：甘油醛-3-磷酸脱氢酶促进癌症细胞增殖实验结果。

图10：甘油醛-3-磷酸脱氢酶促进癌症细胞迁移实验结果。

图11：westernblot检测抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体实验结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，gapdh天然蛋白(0.5μg)；2，gapdh天然蛋白(1μg)。

图12：westernblot检测抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体实验结果。其中各泳道：m，蛋白分子量标准；1，gapdh天然蛋白(0.5μg)；2，gapdh天然蛋白(1μg)。

图13：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体抑制肿瘤生长实验结果。

图14：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体抑制肿瘤生长实验结果。

图15：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体抑制小鼠黑色素瘤肺转移实验结果。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件操作。

实施例1：人正常细胞hek293、人宫颈癌细胞hela分泌甘油醛-3-磷酸脱氢酶，且后者分泌量显著高于前者。

接种生长状况良好的人正常细胞hek293和人宫颈癌细胞hela于6孔细胞培养板中，使用dmem加10％fbs的培养基培养36小时至汇合度达到80％，细胞活性95％以上。此时更换细胞培养基为新鲜dmem继续培养12小时后回收培养基用于westernblot检测，样品上样量根据两种细胞的细胞数量进行调整。检测结果如图1所示，与人正常细胞hek293相比，相同数量的人宫颈癌细胞hela分泌大量的甘油醛-3-磷酸脱氢酶到培养基中。

实施例2：癌症患者血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量显著高于健康人。

收集健康人与肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤患者的血清，采用酶联免疫夹心法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)检测血清中gapdh的浓度，具体实验方法如下：

1.样本选择

健康人：未经生化、影像或病理学方法诊断，暂被认为非癌患者的人群。此处非癌患者包括健康人和癌症相关疾病患者。

癌症患者：经病理学诊断确诊为癌症的患者，包括癌症的不同类型和不同分期。

2.样本收集

分别收集健康人和癌症患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000rpm，10分钟)，将血清分装至ep管中(每份50μl)，迅速放置于-20℃冷冻保存。

3.样本检测

采用elisa方法对收集的血清样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的浓度进行检测。

4.研究结果

检测结果参见图2所示，肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤患者血清中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量显著高于健康人。

实施例3：甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段的体外原核表达、纯化和鉴定。

本实施例综合运用质粒构建、原核表达、亲和层析等方法制备和纯化甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段，并使用sds-page、westernblot和maldi-tof-ms等分析方法进行验证，确认制备的蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其免疫片段。

1.实验材料

主要实验材料包括pczn1质粒，top10菌株，proteinmarker(thermo公司)，iptg、acr、bis、tris(sigma公司)，sds(amresco公司)，temed(bio-rad公司)，限制性内切酶(takara)，pfudna聚合酶(zoonbio,货号pc12)，tyrptone、yeastextract(oxoid公司)，agarose(上海基因公司)，dna胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(axygen公司)，pcr管、枪头等耗材(fisher公司)，0.22μm无菌滤器和透析袋(millipore公司)，ni-ida亲和层析胶(novagen公司)。

2.仪器设备

使用的主要仪器设备包括allegra21r台式高速冷冻离心机(beckman公司)，台式高速离心机(sorval公司)，biologiclp层析系统、miniproteanii垂直平板电泳系统、geldoc2000成像系统、水平电泳系统(bio-rad公司)，ptc-200基因扩增仪(美国mjresearch公司)，320-sph计(美国mettlertoledo公司)，ar5120电子天平(ahoms公司)，multitempiii恒温水浴锅、hoferμv-25紫外透射仪(amershampharmacia公司)，制冰机(日本sanyo公司)，jy92-2d超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所)，超净工作台(中国苏净集团)nanodrop2000(thermo公司)。

3.实验步骤及结果

(1)质粒构建。全长蛋白采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法,设计全长拼接引物，经pcr、酶切、连接等步骤构建重组质粒pczn1-gapdh。后将获得的重组质粒pczn1-gapdh转入top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与seqidno.3所示的多核苷酸序列相符。免疫片段采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法，设计全长拼接引物，将获得的重组质粒pczn1-gapdh-c转入top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与seqidno.4所示的多核苷酸序列相符。

(2)重组蛋白的表达。转化：将1μl质粒pczn1-gapdh或pczn1-gapdh-c加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μllb培养液；37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mlamp的lb平板，37℃倒置培养过夜。融合蛋白表达：挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mlamp的3mllb培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；次日按1:100接种于50μg/mlamp的30mllb培养液中，37℃220r/min振摇至菌体od600为0.6-0.8(约2h)；取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min,弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5mm，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用pbs重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬；进行12％sds-page检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图3、图4所示。

(3)重组蛋白的纯化。利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idawashing-buffer以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idaelution-buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mmtris-hcl，0.15mnacl，ph8.0进行透析过夜；进行12％sds-page分析，结果如图5、图6所示。图中所示纯化后的条带经maldi-tof-ms方法鉴定与seqidno.2和seqidno.5的氨基酸序列吻合。

(4)重组蛋白的鉴定。westernblot方法鉴定：取样品上样5μl；上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升200v直到电泳结束；电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma；电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min；将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜；次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h；反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；ecl显影，曝光。全长蛋白westernblot结果如图7所示，免疫片段westernblot结果如图8所示。

实施例4：甘油醛-3-磷酸脱氢酶促进癌症细胞增殖。

将生长状况良好的人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937分别接种于6孔细胞培养板中，使用dmem加10％fbs的培养基培养24小时后更换为新鲜dmem加1％fbs加2μg/ml甘油醛-3-磷酸脱氢酶、对照组加2μg/mlbsa的培养基继续培养24小时，细胞活性95％以上。使用cck-8细胞活性检测方法检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶处理组和对照组的细胞增殖情况。结果如图9所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的加入显著促进了人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937的增殖。

实施例5：甘油醛-3-磷酸脱氢酶促进癌症细胞迁移。

首先在24孔板中加入500μldmem培养基(含2％胎牛血清)，再放入底部铺有20μlmatrigel的transwell，37℃静置30min；人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937收集后，用空dmem培养基将细胞配制成5×10⁵个/ml的细胞悬液。每个transwell中加入100μl细胞悬浮，37℃培养36-48小时；培养结束后将transwell小篮取出，吸除上室液体，用4％的多聚甲醛溶液固定30min；用pbs洗transwell膜一次，将膜在结晶紫溶液中染色60min；用pbs洗transwell膜两次，用棉签擦去膜上层matrigel和细胞；在倒置相差显微镜下观察并拍照，每个transwell选取5个视野，计算平均值。结果如图10所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的加入显著促进了人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937的迁移。

实施例6：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其免疫片段单克隆抗体的制备、纯化和检测。

1.实验材料

balb/c小鼠；重组gapdh蛋白；弗氏佐剂(sigma公司)；羊抗鼠-hrp二抗；proteinmarker；acr、bis、tris、peg(sigma公司)，sds、液体石蜡(amresco公司)，temed(bio-rad公司)，0.22μm无菌滤器和透析袋(millipore公司)，高糖dmem培养基(gibco公司)，细胞计数板(购自improvedneubauer)，96孔细胞培养板(costar)。

2.仪器设备

使用的主要仪器设备包括allegra21r台式高速冷冻离心机(beckman公司)，台式高速离心机(sorval公司)，320-sph计(美国mettlertoledo公司)，ar5120电子天平(ahoms公司)，multitempiii恒温水浴锅(amershampharmacia公司)，制冰机(日本sanyo公司)，酶标仪、洗板仪、nanodrop2000(thermo公司)，超净工作台(中国苏净集团)。

3.实验步骤及结果

(1)免疫动物。分别选取8只6－8周龄雌性balb/c小鼠，将gapdh蛋白与弗氏佐剂混合免疫，按皮下注射100ug/只进行免疫，2－3周加强免疫一次。采血检测，通过间接elisa方法确定抗血清针对gapdh或gapdh-c蛋白的效价。

(2)细胞融合。混合骨髓瘤细胞和脾细胞。把细胞放到50ml离心管中，用dmem基础培养基稀释，然后离心1000rpm5min，弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml50％peg，反应90秒，然后加入20-30mldmem培养基终止peg，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000rpm5min，弃上清然后加入hatdmem培养基。把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到co2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，细胞生长状态良好。

(3)抗体纯化。将proteina琼脂糖凝胶介质装入亲和纯化层析柱，将gapdh或gapdh-c蛋白免疫小鼠后的腹水，分别与pbs等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱即得到所需纯化抗体，立即在pbs中进行4度透析过夜。

(4)抗体检测。westernblot方法检测：取重组gapdh蛋白和天然gapdh蛋白上样5μl；上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升200v直到电泳结束；电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma；电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min；将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜；次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min；用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h；反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；ecl显影，曝光。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体westernblot结果如图11所示，抗其免疫片段单克隆抗体westernblot结果如图12所示。

实施例7：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体抑制肿瘤生长。

待生长状态良好的人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937生长至90％汇合度时，收集细胞。用dmem培养基重悬，使用细胞计数器计数,然后将细胞与matrigel按1:1的比例混合，接种于balb/c-null裸鼠右后肢皮下，每只小鼠接种100μl1×10⁷个细胞。待肿瘤长至一定体积后定期注射抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体2.5mg/kg小鼠，对照组注射igg。定期监测小鼠体重和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验持续6-7周时间，实验结束后比较对照igg组与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体组的肿瘤生长差异。图13所示实验结果表明抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体显著抑制了人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937肿瘤的生长。体内实验验证了甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有促进肿瘤生长的作用，将其抑制可显著抑制肿瘤的生长。证明甘油醛-3-磷酸脱氢酶可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

实施例8：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体抑制肿瘤生长。

待生长状态良好的人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937生长至90％汇合度时，收集细胞。用dmem培养基重悬，使用细胞计数器计数,然后将细胞与matrigel按1:1的比例混合，接种于balb/c-null裸鼠右后肢皮下，每只小鼠接种100μl1×10⁷个细胞。待肿瘤长至一定体积后定期注射抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体2.5mg/kg小鼠，对照组注射igg。定期监测小鼠体重和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验持续6-7周时间，实验结束后比较对照igg组与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体组的肿瘤生长差异。图14所示实验结果表明抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫片段单克隆抗体显著抑制了人肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mda-mb-231、胃癌细胞sgc7901、胰腺癌细胞panc-1、结直肠癌细胞sw620、食道癌细胞caes-17、宫颈癌细胞hela、淋巴瘤细胞u937肿瘤的生长。证明甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫片段可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

实施例9：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体抑制黑色素瘤转移。

待生长状态良好的黑色素瘤细胞b16-f10生长至90％汇合度时，收集细胞。用dmem培养基重悬，使用细胞计数器计数，尾静脉注射于c57小鼠体内，每只小鼠接种100μl2×10⁵个细胞，使其形成肺转移。定期注射抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体2.5mg/kg小鼠，对照组注射igg。实验持续18天，待实验结束后比较对照igg组与抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体组肺组织中黑色素瘤的转移情况。图15所示实验结果表明抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体抑制了黑色素瘤细胞的肺转移。体内实验验证甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有促进肿瘤转移的作用，将其抑制可显著抑制肿瘤的转移。再次证明甘油醛-3-磷酸脱氢酶可作为肿瘤防治的靶点用于药物筛选。

序列表

<110>王泽宋

<120>甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白或其免疫性片段的新应用

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