HIV-1RNA定量检测的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用的制作方法

本发明属于hiv病毒检测检测技术领域，具体涉及hiv-1rna定量检测的实时荧光定量pcr引物和探针及其应用。

背景技术：

艾滋病(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)是由感染人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)所导致的传染病，分为hiv-1和hiv-2型，目前流行的主要是hiv-1。根据联合国艾滋病总署(unaids)的统计资料：2017年全球hiv-1感染者约有3790万人，新发感染者约有180万人；全球累计有7730万人感染hiv-1，死于aids相关疾病人数累计约3540万人。然而，hiv-1是一种具有高度变异性的rna病毒，根据其遗传变异度可以分为m、n、o和p群，其中m群又可以分为9个亚型和96个流行重组型(circulatingrecombinantforms,crf)和200个以上独特重组型(uniquerecombinantforms，urf)。因此，定量检测hiv-1感染者体内的rna水平具有极大困难。众所周知，hiv-1血浆中病毒载量是监测疾病进展和预后的重要指标之一，也是诊断hiv-1早期感染的重要参考指标，对于临床用药、发病机制、疫苗研发都至关重要。病毒载量更是指导艾滋病治疗的实验室指标，直接影响到我国的aids防治和控制情况。

目前，常用的hiv-1病毒载量检测方法为：核酸序列依赖性扩增(nasba)技术、分支dna信号放大系统(bdna)技术和实时荧光定量pcr扩增技术(real-timepcr)。国际上开发的hiv-1核酸检测试剂盒主要包括：cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1test,version2.0(roche公司)、nuclisenshiv-1qttest(nasba)，organonteknika公司和versanthiv-1rna3.0assay(bdna)bayer公司。但是，没有一种商业化的试剂适用于hiv-1所有亚型，主要针对是m群的亚型，而我国流行的大部分是重组毒株：crf01_ae、crf07_bc、crf08_bc和b亚型，近些年重组株在各国也越来越常见。并且，上述三种试剂盒检测费用过于昂贵，每份样本高达1200-1800元不等，对于经济负担高、收入过低的家庭根本无法承担，严重限制其在发展中国家和资源匮乏地区大规模推广和应用。

因此，建立一种低成本、简单、精确的hiv-1病毒载量的引物、探针、试剂盒以及检测方法是非常有必要的，可以进一步有效评估hiv-1患者的疾病进展与预后。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种hiv-1rna定量检测的实时荧光定量pcr引物和探针，该引物和探针对hiv-1具有高特异性，可用于实时荧光定量rt-qpcr技术检测hiv-1。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种hiv-1rna定量检测试剂盒。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种hiv-1病毒载量的实时荧光定量pcr检测方法，该方法快速、高效，特异性高。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述引物和探针、试剂盒在定量检测hiv-1病毒载量方面的应用。

本发明所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种hiv-1rna定量检测的实时荧光定量pcr引物和探针，所述引物包括上游引物hivf1和下游引物hivr1，所述上游引物hivf1的序列如seqidno.1所示，所述下游引物hivr1的序列如seqidno.2所示；所述探针为hivprobe1，所述hivprobe的序列如seqidno.3所示。

具体的，上游引物hivf1、下游引物hivr1和探针的核苷酸序列如下：

上游引物hivf1：acagcagtacaaatggc；

下游引物hivr1：tarctgtaataaacccgaaaat；

探针：attggggggtacagtgcaggggaa。

优选的，所述探针hivprobe1的5’端标记有报告荧光基团fam，3’端标记有淬灭荧光基团tamra。

本发明所要解决的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种hiv-1rna定量检测试剂盒，包括上述的引物和探针。

进一步的，所述试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液和dntp。

其中dna聚合酶和缓冲液都是本领域常规的聚合酶和缓冲液。

更佳的，dna聚合酶可以是利用抗taq抗体的hotstart聚合酶，缓冲液由tris-hcl缓冲液、mg²⁺、kcl等组成，还添加了tlirnaseh(耐热性rnaseh)，以cdna作为模板进行pcr反应时，可以很好地抑制由于cdna中残存mrna对pcr反应造成的阻害作用。

进一步的，将用带目的基因的质粒dna作为标准品，测量质粒dna浓度，计算出拷贝数，进行梯度稀释得到不同拷贝数的标准品，绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

该试剂盒在使用时，先提取待测样品rna反转录得到cdna，然后用上述引物和探针进行实时荧光定量pcr反应。

反应结果判定：根据样本的ct值带入已建立的标准曲线，可计算出病毒拷贝数。

本发明所要解决的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种hiv-1病毒载量的实时荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的rna，然后逆转录，得cdna，再利用上述的引物和探针进行实时荧光定量pcr反应，即可获得hiv-1病毒载量。

具体的，该方法包括待测病毒rna的提取，然后逆转录，得cdna，在实时荧光定量rt-qpcr反应体系进行实时荧光定量rt-qpcr反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立，计算得出待测结果，实时荧光定量rt-qpcr反应体系中含有上述引物和探针，可以通过实时荧光定量rt-qpcr反应对hiv-1病毒进行定性和定量检测。

优选的，实时荧光定量pcr反应时，反应体系包括2μlcdna，上下游引物hivf1和hivr1各0.4μl，探针hivprobe0.4μl，10μlpcr预混试剂，余量ddh2o，共20μl。

优选的，所述pcr预混试剂包括dna聚合酶、缓冲液和dntp。

优选的，实时荧光定量pcr反应时，反应条件为：预变性95℃30s，95℃15s，退火温度59℃60s，收集荧光72℃15s，共50循环，37℃冷却30s。

本发明所要解决的第四个技术问题是通过如下技术方案来实现的：上述引物和探针、上述试剂盒在定量检测hiv-1病毒载量方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明公开了一组定量检测hiv-1病毒载量实时荧光定量pcr引物和探针；其不仅能够在定性诊断样本中是否感染hiv-1，并对hiv-1rna的水平进行定量分析，特异度强，线性范围广，有较好的灵敏度；利用此对引物和探针对hiv-1病毒含量的检测下限可达到400copies/ml，重复性好。

(2)利用本发明中的引物和探针对hiv-1病毒含量进行检测的费用仅需约85元/份，仅是市场上的商业试剂盒的1/12-1/15，有着非常好的应用前景。

附图说明

图1是实施例2中常规pcr反应扩增产物的琼脂糖电泳分析结果，样本依次为线性质粒10⁷-10²copies/ml和阴性样本；

图2是实施例2中本发明检测hiv-1质粒的定量增殖放大结果，y轴表示的是荧光值(fluorescence)，x轴表示的是扩增的循环数(cycle)；

图3是实施例2中定量检测hiv-1质粒的标准曲线，r²表示相关系数，e表示引物的扩增效率，y轴表示的是ct值，x轴表示的是hiv-1病毒的数量；

图4是实施例3中利用本发明构建的引物和探针检测hiv-1rna和商业化试剂盒定量结果比较的关联性分析；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1

1、引物设计

从美国losalamos国家实验室网站下载hiv-1主要流行毒株基因序列(包括crfs)，采用mega7.0和bioedit软件进行同源性比对，找出hiv-1基因组的高度保守区域，设计两对引物，一对用于构建克隆载体，一对引物用于荧光定量检测，在扩增片段中设计合适探针，所有的引物和探针都经过ncbiblast和ncbiprimerdesign验证。

用于构建克隆载体的引物对为：

hivf2：cctacaatccccaaagtca

hivr2：cakcacctgccatctgttttccata

用于荧光定量检测的引物对包括上游引物hivf1和下游引物hivr1：

上游引物hivf1：acagcagtacaaatggc，如seqidno.1所示；

下游引物hivr1：tarctgtaataaacccgaaaat，如seqidno.2所示；

探针：attggggggtacagtgcaggggaa，如seqidno.3所示。

其中探针hivprobe1的5’端标记有报告荧光基团fam，3’端标记有淬灭荧光基团tamra。

可以将上述引物和探针用于试剂盒中，该试剂盒还包括本领域常规的dna聚合酶、缓冲液和dntp等。

其中dna聚合酶是利用抗taq抗体的hotstart聚合酶，缓冲液由tris-hcl缓冲液、mg²⁺、kcl等组成，还添加了tlirnaseh(耐热性rnaseh)，以cdna作为模板进行pcr反应时，可以很好地抑制由于cdna中残存mrna对pcr反应造成的阻害作用。

还可以将用带目的基因的质粒dna作为标准品，测量质粒dna浓度，计算出拷贝数，进行梯度稀释得到不同拷贝数的标准品，绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

实施例2

本实施例提供的hiv-1病毒载量的实时荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的rna，然后逆转录，得cdna，再利用上述的引物和探针进行实时荧光定量pcr反应，即可获得hiv-1病毒载量。

具体的，该方法包括待测病毒rna的提取，然后逆转录，得cdna，在实时荧光定量rt-qpcr反应体系进行实时荧光定量rt-qpcr反应，通过标准品的制备及标准曲线的建立，计算得出待测结果，实时荧光定量rt-qpcr反应体系中含有上述引物和探针，可以通过实时荧光定量rt-qpcr反应对hiv-1病毒进行定性和定量检测。

以下详细描述该检测方法：

(1)rna提取

采用roche的highpureviralrnakit试剂盒，按照说明书操作如下：加入4μlcarrierrna、400μlbingdingbuffer和200μl的血浆，经过裂解-洗脱-溶解(30-50μl，的原理，得到一定浓度的rna，rna浓度具体根据样本里面本身的含量而定。

(2)逆转录

采用roche的transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit试剂盒，按照说明书操作如下：3μl下游特异性引物r1，10μlrna，预变性65℃10min，然后加入4μl逆转录buffer、2μldntp混合物、0.5μlrna酶抑制、0.5μl逆转录酶，程序：25℃10min，50℃60min，85℃、5min，cdna置于-20°保存。

(3)质粒标准分子及其工程菌菌株的构建

通过pcr扩增纯化得到pol基因特异性片段10a，并将其连接到pmd18-t载体上，构建质粒标准分子pmd18-t-10a，并转染到e.coli，获得能生产该质粒的工程菌菌株。经过该e.coli工程菌菌株的发酵，重组质粒提取纯化，获得的质粒标准分子pmd18-t-10a，经琼脂糖跑胶和测序结果鉴定164bp，与预期大小相符合。

用紫外分光光度计测定其a260、a280以及a260/a280值，a260/a280比值表示质粒dna的纯度，比值＞1.8，满足实验要求。

质粒标准分子拷贝数计算公式如下：

dna浓度(ng/ul)＝a260×稀释倍数×50ng/μl

dna拷贝数＝a×n/dna长度*每对碱基质量数

其中：a代表质粒浓度(ng/μl)；n代表阿伏伽德罗常数(6.02×10²³/mol)。

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，这里构建标准品是为了得到不同梯度稀释的hiv-1含量。

(4)基于质粒标准分子构建hiv-定量核酸检测体系

4.1常规pcr反应体系

反应体系(25μl)：无菌水8.5μl、extaq酶12.5μl、10μmol/l的上下游引物hivf1、hivr1各1μl和dna模板(线性化质粒稀释标准分子：10⁷-10²copies/ml)各2μl，用于定性判断是否感染hiv-1。

扩增条件：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；充分延伸72℃10min。扩增产物进行2％琼脂糖电泳分析，结果如图1所示，从图1中可以看出，本发明中的pcr方法能有效的检测到不同浓度的hiv-1病毒，并且对非靶标不会有非特异性的扩增，即对非hiv-1患者呈现阴性。

4.2实时荧光定量pcr(rt-qpcr，realtimequantitativepolymerasechainreaction)反应体系，制备标准品。

反应体系(20μl)：无菌水、qpcrmix酶(主要包括dna聚合酶、缓冲液和dntp)10μl、10μmol/l的上下游引物(实施例1中获得的)各0.4μl、10μmol/l的探针(实施例1中获得的)0.4μl、模板dna(步骤(3)中制备的线性化质粒标准分子)2μl，空白对照以超纯水代替模板dna。

扩增条件：预变性95℃30s；95℃15s，59℃60s，72℃15s，程序进行50个循环；37℃冷却30s。在退火59℃60s时，rochelightcycler96qpcr扩增仪进行实时荧光信号收集，结果如图2所示，从图2中可以看出，在扩增10⁷-10²copies/ml的病毒浓度时都呈现良好的线性关系，说明该体系能准确的定量样品中hiv-1rna的含量，另外，结果也说明了本发明所述的体系检测病毒载量的最低下限能够达到400copies/ml。

(5)标准曲线的建立以及重复性分析

标准曲线是通过ct(thresholdcycle)值和样品初始浓度的对数值形成的线性曲线。在标准曲线构建中，使用2μl连续稀释的质粒标准分子pmd18-t-10a，以10倍倍比稀释5个梯度，其浓度为10⁷到10²copies/ml，其扩增效率在94％-110％，r²在0.98-1之间，如图3所示。

定量检测体系的重复性(repeatability)是指不同时间段重复实验之间的差异，用标准偏差(standarddeviation,sd)和相对标准偏差(relativestandarddeviation,rsd)来表示。

本发明通过7次重复实验对检测体系的重复性进行评价。结果如下表1，sd范围在0.02～0.56之间，而rsd范围在0.06％～1.44％之间(表1)。

表1质粒标准分子pmd18-t-10a建立的qpcr的重复性分析

meanct是7次重复实验获得ct值的平均值

(6)特异性分析

本研究选择了24健康人样本进行检测，按照4.2的实验步骤，提核酸-逆转录-荧光定量qpcr检测，该24个样本同时进行荧光定量pcr，同时做阳性对照和空白对照(以无核酶水为模板)，结果显示只有阳性样本出现扩增曲线，其余样本均为阴性结果。

(7)检测结果判定和病毒的定量

根据样本的ct值带入已建立的标准曲线，可计算出病毒拷贝数，

标准曲线为：y＝-3.42x+48.58，r²＝1，扩增效率为：10^[-(1/slope)]-1。

病毒载量计算公式如下：

待测样品(copies/ml)＝10^{(ct-48.58)/(-3.42)}

(注：slope为标准曲线斜率)。

实施例3

本发明建立的定量检测方法与cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1test,version2.0(cap/ctmv2.0,roche)商品化试剂盒在检测hiv-1阳性和阴性样本的结果比较，如图4所示，从图4中可以看出，本发明建立的检测方法和cap/ctmv2.0商品化试剂盒的一致性为0.916，说明本发明建立的荧光定量检测方法检测结果是可靠的，满足实际的检测和定量需要。

具体实施步骤如下：

(1)收集72份经wb和elisa确证hiv-1感染者和24名健康人血液，装有edta的收集管在6个小时内进行离心，分离血浆后置于-80℃保存；

(2)cap/ctmv2.0试剂盒购买自roche公司(瑞士)，根据两种试剂盒的说明书独立操作，剔除两个试剂盒都判断为阴性的样本；

(3)利用本发明实施例2中建立的检测方法检测上述样本：

3.1提取rna：采用roche的highpureviralrnakit试剂盒，按照说明书操作如下：加入4μlcarrierrna、400μlbingdingbuffer和200μl的血浆，经过裂解-洗脱-溶解的原理，得到一定浓度的rna；

3.2逆转录：采用roche的transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit试剂盒，混合3μl下游特异性引物r1(实施例1中构建的)，10μlrna(3.1中提取的)，预变性65℃10min，然后加入4μl逆转录buffer、2μldntp混合物、0.5μlrna酶抑制、0.5μl逆转录酶，程序：25℃10min，50℃60min，85℃、5min，cdna置于-20°保存；

3.3hiv-1rna荧光定量检测：

反应体系(20μl)：无菌水、qpcrmix酶10μl、10μmol/l的引物(实施例1中构建的)各0.4μl、10μmol/l的探针(实施例1中构建的)0.4μl、cdna2μl(3.2中逆转录获得的)，空白对照以超纯水代替模板dna。

扩增条件：预变性95℃30s；95℃15s，59℃60s，72℃15s，程序进行50个循环；37℃冷却30s。每次重复3个平行，在退火59℃60s时，rochelightcycler96qpcr扩增仪进行实时荧光信号收集。

表2ampliprep和rt-qpcr检测72份样本结果

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

序列表

<110>南方医科大学

<120>hiv-1rna定量检测的实时荧光定量pcr引物和探针及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acagcagtacaaatggc17

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tarctgtaataaacccgaaaat22

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

attggggggtacagtgcaggggaa24