一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术：
：猪蓝耳病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，最早发现于1987年，现已遍及北美洲及欧洲，在全球范围内传播。郭宝清等(1996)首次从国内疑似prrs感染猪群中分离出prrsv，从而证实了该病毒在我国存在。该病毒传播速度快，尤其在技术进步和经济发达国家，由于猪群密集、流动频繁，更易引起流行。猪蓝耳病毒感染会造成病猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍等症，对养猪业造成巨大的经济损失。现有猪蓝耳病病毒核酸的检测方法有抗体检测和抗原检测。抗体检测往往滞后于抗原检测，从而不能及时准确的快速发现疫病，导致疫病的爆发流行，造成巨大的经济损失。而现有的抗原检测方法中病毒分离时间长、环境设施要求高，技术水平要求高，灵敏度也难以满足实际需求。技术实现要素：有鉴于
背景技术：
中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合、试剂盒及其应用。本发明提供了一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合，所述引物组合包括上游内部引物fip、下游内部引物bip、上游外部引物f3和下游外部引物b3；所述上游内部引物fip的核苷酸序列如seqidno:1所示；所述下游内部引物bip的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述上游外部引物f3的核苷酸序列如seqidno:3所示；所述下游外部引物b3的核苷酸序列如seqidno:4所示。本发明提供了一种猪蓝耳病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括primermix，buffer，逆转录酶，bstdna聚合酶，稳定液，mncl2溶液，显色指示剂和depc水；所述primermix包括上述的引物组合。优选的，在所述primermix中，fip和bip的浓度分别为7～9μmol/l；f3和b3的浓度分别为0.8～1.2μmol/l。优选的，所述buffer包括13～15mmol/l的dntps，75～85mmol/l的mgso4，180～220mmol/l的tris，90～110mmol/l的(nh4)2so4，450～550mmol/l的kcl和0.8～1.2％体积浓度的tween-20。优选的，所述逆转录酶为amv逆转录酶，所述amv逆转录酶的比活力为4～6u/μl；所述bstdna聚合酶的比活力为8～12u/μl。优选的，所述稳定液为4～6mol/l的甜菜碱水溶液。优选的，所述mncl2溶液的浓度为8～20mmol/l。优选的，所述显色指示剂为8～20mmol/l浓度的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚溶液。优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照和/或阴性对照；所述阳性对照包括猪蓝耳病毒nsp2基因片段；所述阴性对照不包括猪蓝耳病毒nsp2基因片段。本发明还提供了上述引物组合或者试剂盒在检测猪蓝耳病毒中的应用，所述应用不以疾病的诊断为目的。优选的，所述应用包括对猪饲料、饮水中的猪蓝耳病毒检测或者对猪养殖环境(如猪舍)中的猪蓝耳病毒检测。有益效果：本发明提供了一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合，所述引物组合包括上游内部引物fip、下游内部引物bip、上游外部引物f3和下游外部引物b3；各引物序列依次如seqidno:1～4所示。本发明提供的引物组合利用靶基因猪蓝耳病毒nsp2基因片段上的6个特异性位点设计得到，其能在bstdna聚合酶的作用下，在55～65℃等温扩增，通过链置换反应大量扩增靶序列。本发明通过在反应体系中加入显色指示剂，阴、阳性结果区别明显，可通过颜色变化判读结果，且该方法灵敏度高，最低可检测到10拷贝的猪蓝耳病病毒，灵敏度比常规的rt-pcr检测试剂灵敏度高10倍。另外，使用本发明提供的引物组合或者试剂盒对猪蓝耳病毒进行检测，操作简单便捷，将酶、引物等反应组分混匀后，保温一小时即可完成鉴定；反应前加入显色指示剂，反应后通过肉眼观察反应液颜色变化判读结果，直观方便，且可有效避免反应后开盖造成的气溶胶污染。本发明利用靶基因序列上的多个独立区域设计多条引物，能保证扩增反应的高度特异性。附图说明图1为本发明所述引物组合与靶基因的结构对应关系图。具体实施方式本发明提供了一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合，所述引物组合包括上游内部引物fip、下游内部引物bip、上游外部引物f3和下游外部引物b3；所述上游内部引物fip的核苷酸序列如seqidno:1所示；所述下游内部引物bip的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述上游外部引物f3的核苷酸序列如seqidno:3所示；所述下游外部引物b3的核苷酸序列如seqidno:4所示。本发明提供的引物组合是利用靶基因猪蓝耳病毒nsp2基因片段上的6个特异性位点设计得到，所述引物组合与靶基因的结构对应关系如图1所示。其中，上游内部引物fip(forwardinnerprimer)是由f2区和f1c区域组成，f2区能与靶基因3'端的f2c区域互补，f1c区与靶基因5'端的flc区域序列相同。下游内部引物bip(backwardinnerprimer)是由b1c和b2区域组成，b2区与靶基因3'端的b2c区域互补，b1c与靶基因5'端的blc区域序列相同。上游外部引物f3(forwardouterprimer)是由f3区组成，与靶基因的f3c区域互补。下游外部引物b3(backwardouterprimer)是由b3区域组成，能和靶基因的b3c区域互补。本发明对上述引物组合的制备方法不作特别限定，采用本领域的常规方法合成得到即可。本发明提供的引物组合能在bstdna聚合酶的作用下，55～65℃等温扩增，通过链置换反应大量扩增靶序列，灵敏度高。本发明提供了一种猪蓝耳病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括primermix，buffer，逆转录酶，bstdna聚合酶，稳定液，mncl2溶液，显色指示剂和depc水。在本发明中，所述primermix用于对猪蓝耳病毒核酸特异性位点进行识别；所述buffer用于为逆转录及链置换反应提供合适的反应条件；所述逆转录酶用于病毒核酸的逆转录得到cdna序列，为链置换反应提供模板；所述bstdna聚合酶介导等温链置换反应；所述稳定液用于增强反应稳定性及特异性；所述mncl2溶液在反应前结合显色指示剂，使指示剂呈橙红色；显色指示剂为反应提供可视化指示，阳性反应后指示剂由橙红色变为黄色。depc水用于补足反应体系中的体积。本发明所述试剂盒包括primermix。所述primermix包括上述的引物组合，在所述primermix中，fip和bip的浓度分别优选为7～9μmol/l，更优选为8μmol/l；f3和b3的浓度分别优选为0.8～1.2μmol/l，更优选为1μmol/l。所述primermix在所述试剂盒中的规格优选为90～110μl×1管，更优选为100μl×1管。本发明所述试剂盒包括buffer。在本发明中，所述buffer优选包括dntps，mgso4，tris，(nh4)2so4，kcl和tween-20。所述dntps的浓度优选为13～15mmol/l，更优选为14mmol/l。所述mgso4的浓度优选为75～85mmol/l，更优选为80mmol/l。所述tris的浓度优选为180～220mmol/l，更优选为200mmol/l。所述(nh4)2so4的浓度优选为90～110mmol/l，更优选为100mmol/l。所述kcl的浓度优选为450～550mmol/l，更优选为500mmol/l。所述tween-20的体积浓度优选为0.8～1.2％，更优选为1％。所述buffer在所述试剂盒中的规格优选为90～110μl×1管，更优选为100μl×1管。本发明所述试剂盒包括逆转录酶和bstdna聚合酶。在本发明中，所述逆转录酶优选为amv逆转录酶，所述amv逆转录酶的比活力优选为4～6u/μl，更优选为5u/μl。所述bstdna聚合酶的比活力优选为8～12u/μl，更优选为10u/μl。本发明对所述逆转录酶和bstdna聚合酶的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述逆转录酶为购买自takara公司的amv逆转录酶(reversetranscriptase)，规格为200u(5u/μl)。所述bstdna聚合酶为购买自河南佰柯生物科技有限公司，规格为10000u(10u/μl)。在本发明中，所述逆转录酶在所述试剂盒中的规格优选为15～25μl×1管，更优选为20μl×1管；所述bstdna聚合酶在所述试剂盒中的规格优选为15～25μl×1管，更优选为20μl×1管本发明所述试剂盒包括稳定液、mncl2溶液和显色指示液。在本发明中，所述稳定液优选为甜菜碱溶液。所述甜菜碱溶液的浓度优选为4～6mol/l，更优选为5mol/l。所述mncl2溶液的浓度优选为8～20mmol/l，更优选为10mmol/l。所述显色指示液优选为4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚溶液。所述4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚溶液的浓度优选为8～20mmol/l，更优选为10mmol/l。本发明对所述稳定液、mncl2溶液和显色指示液的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述稳定液在所述试剂盒中的规格优选为400～600μl×1管，更优选为500μl×1管；所述mncl2溶液在所述试剂盒中的规格优选为400～600μl×1管，更优选为500μl×1管；所述显色指示液在所述试剂盒中的规格优选为70～90μl×1管，更优选为80μl×1管。本发明所述试剂盒还包括depc水。本发明对所述depc水的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明所述试剂盒优选还包括阳性对照和/或阴性对照。在本发明中，所述阳性对照包括猪蓝耳病毒nsp2基因片段，优选为合成的猪蓝耳病毒nsp2基因片段；所述阴性对照不包括猪蓝耳病毒nsp2基因片段，优选为无污染的无菌水。所述阳性对照和/或阴性对照在本发明中能用于佐证检测结果的准确性。本发明还提供了上述引物组合或者试剂盒在检测猪蓝耳病毒中的应用，所述应用不以疾病的诊断为目的。优选的，所述应用包括对畜牧饲料、饮水中的猪蓝耳病毒检测，对畜牧养殖现场环境(如猪舍)中的猪蓝耳病毒检测或者对出口猪肉食品的卫生检测。在本发明中，所述检测的体系优选为25μl体系，所述25μl体系优选包括2μl待测样品，5μlprimer，2.5μlbuffer(10×)，1.5μl稳定剂，1μl逆转录酶，1μlbstdna聚合酶，1.25μlmncl2溶液，1.25μl显色指示剂和9.5μldepc水。本发明配好检测体系后，进行反应。所述反应的温度优选为55～65℃，更优选为60℃。所述反应的时间优选为45～60min，更优选为50min。反应结束后，本发明取出反应管，冷却至室温，2000r/min离心10s，观察离心液的颜色：若离心液颜色为橙红色或者橙色，则说明待测样品中不含有猪蓝耳病毒；若离心液颜色为黄色或者浅黄色，则说明待测样品中含有猪蓝耳病毒。若阴、阳性对照反应结果与上述判断标准不符，则说明检测结果无效，应当重新检测。下面结合实施例对本发明提供的一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1一种猪蓝耳病毒核酸检测试剂盒，包括如表1所示的组成。表1猪蓝耳病毒核酸检测试剂盒组成组分名称(20test/kit)规格×数量带盖pcr8连管0.2ml×3排primermix100μl×1管10×buffer100μl×1管阳性对照1管逆转录酶20ul×1管bstdna聚合酶20ul×1管稳定液500ul×1管mncl2500ul×1管显色指示剂80μl×1管depc水1ml×1管说明书1份在表1中，primermix为引物fip、bip、f3、b3的混合物，其中fip/bip浓度为8μmol/l，f3/b3浓度为1μmol/l。在表1中，阳性对照为合成的猪蓝耳病毒nsp2基因片段；逆转录酶为takara的amv逆转录酶(reversetranscriptase)，规格200u(5u/ul)；bstdna聚合酶为河南佰柯生物科技有限公司的bstdna聚合酶，规格为10000u(10u/ul)；稳定液为5mol/l的甜菜碱；mncl2的浓度为10mmol/l；显示指示剂为10mmol/l浓度的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(par)；depc水为depc处理后高压灭菌的分装水。在表1中，10×buffer的组成如表2所示：表210×buffer组成实施例2利用实施例1所述试剂盒进行猪蓝耳病毒核酸检测(1)取0.1g猪肉，加入trizol试剂进行研磨，离心得到200ul的研磨液上清，提取病毒rna，并将提取的病毒rna溶于20uldepc水中，直接进行检测或贮存-20℃以下备用。(2)核酸扩增①试剂盒内反应液、引物、显色剂等使用前室温融化混匀。②设所需rt-lamp反应管数为n(n＝样品数+1阳性对照+1阴性对照)，每管反应体系如表3所示。表3：扩增体系试剂用量primermix5ul10xbuffer2.5ul稳定剂1.5ul逆转录酶1ulbst酶1ulmncl21.25ul指示剂1.25uldepc水9.5ul总体积23ul按每管所需量×n计算好各试剂用量，加入一洁净1.5mlep管中，混合均匀，2000r/min离心10s，向pcr8连管中分别加入23ul上述混合液。移至样品处理区加样。③向上述各管中按顺序加入阴性对照、待检测模板、阳性对照各2ul，盖紧管盖做好标记，移至反应区。④60℃恒温反应50min。⑤结果判断：取出反应管，冷却至室温，2000r/min离心10s，观察颜色变化。在阴性对照反应管液体为橙红色，阳性对照反应管呈浅黄色条件下：待检测样品呈黄色，该样品结果为猪蓝耳病病毒阳性；待检测样品呈橙色，该样品结果为猪蓝耳病病毒阴性；若阴阳性对照反应结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。(3)注意事项1，本试剂盒仅用于体外检测，使用前请仔细阅读试剂盒说明书全文。2，实验请严格分区操作：一区：试剂准备区----准备所需试剂；二区：样本制备区----待测样品及对照样品处理；三区：反应区-----扩增及结果分析。3，反应温度在60-65℃，确保仪器真实温度。4，各区物品专区专用，避免交叉污染。5，试剂盒内各试剂使用前融化均匀。6，加样、分装时避免产生气泡，反应前检查各反应管是否盖紧管盖，避免泄漏污染。7，反应管完成反应后冷却至室温观察，避免打开管盖，有效防止扩增产物外逸污染。8，分析完毕后个反应管密封于专用容器内，定点丢弃。实验过程中废弃物及一次性耗材灭菌后丢弃。9，工作台及各物品定期消毒。10，实验过程中请穿戴工作服，带一次性手套，建议使用带滤芯的一次性枪头。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>许昌佰柯蛋白与基因工程研究院有限公司<120>一种用于猪蓝耳病毒核酸检测的引物组合、试剂盒及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtgaatgagccgacaccacctgggagtctgacgagagca39<210>2<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgccgtcttcagatggtgtggggtctaagagccttcctgct42<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccaaaggtccccggatgt18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acgaggctaaaaacctggc19当前第1页12