一种抗人B7-H3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗人b7-h3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒。

背景技术：

近年来，越来越多的研究发现，b7-h3分子异常表达在各种肿瘤组织，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。临床回顾性病例分析发现，b7-h3的表达与临床病理学特征存在相关性，通过生存分析发现高表达b7-h3的病例预后差，死亡率高，并且在肿瘤患者外周血中也发现了高水平的可溶性b7-h3（sb7-h3）。此外，研究还发现，b7-h3与移植免疫排斥和自身免疫病理相关，转染了b7-h3基因的移植物可以抑制宿主t细胞的活性，从而延长移植物的生存时间。这些研究结果都提示，b7-h3是个重要的负性共刺激分子，具有重要的研究和运用价值。

人类很多肿瘤中，b7-h3在mrna和蛋白水平上均有表达并且与病人的预后呈负相关。目前已有不少文献对各类肿瘤进行回顾性研究，从临床角度分析b7-h3在抗肿瘤免疫中的功能，包括卵巢癌、食管癌、肾癌、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。

b7-h3异常表达于肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中，并和年龄、病理类型、肿瘤生物学效应和患者生存率密切相关。

因此，研制鼠抗人b7-h3单克隆抗体可以为进一步研究该分子在肿瘤中的作用奠定物质基础，同时也为探明b7-h3信号传导通路及机制提供有效的研究手段，有功能的抗人b7-h3单克隆抗体更有望成为肿瘤生物治疗的潜在靶点。

技术实现要素：

为了克服现有技术当中的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种抗人b7-h3单克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供一种抗人b7-h3抗体在重链和轻链可变区的检测方法。

本发明的目的之三在于提供一种抗人b7-h3单克隆抗体的应用。

本发明的目的之四在于提供一种抗人b7-h3单克隆抗体的试剂盒。

为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：

一种抗人b7-h3单克隆抗体，包括重链和轻链，其中，所述重链可变区(mvh)的氨基酸序列与seqidno.1相同，具体如下：

evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsryamswvrqtpekrlewvatisddgrntydrdsvkgrftisrdnarntlylqmsslrsedtalyycvrhraittarfdywgqgtsltvss；

所述轻链可变区(mvl)的氨基酸序列与seqidno.2相同，具体如下：

dilmtqspssmsvslgdtvsitchasqdissnigwlqqgpgnsfkgliyhgtnledgvpsrfsgsgsgadysltisglesedfadyytlqsvqfpytfgggtkleik。

在本发明的一个优选实施例中，所述所述重链可变区(mvh)具有三个高变区为：gftfsrya、isddgrnt、vrhraittarfdy。

在本发明的一个优选实施例中，所述轻链可变区(mvl)具有三个高变区为：qdissn、hgt、lqsvqfpyt。

为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：

一种抗人b7-h3抗体在重链和轻链可变区的检测方法，包括如下步骤：

（1）b7-h3单克隆抗体的杂交瘤的制备；

（1.1）免疫小鼠；

（1.2）细胞培养；

（1.3）融合与筛选；

（2）b7-h3鼠/人嵌合抗体的制备；

（2.1）提取杂交瘤细胞的cdna：从该杂交瘤细胞株中提取rna，并使用rt-pcr技术，将获得的rna反转录为cdna；

利用特定设计的上下游引物pcr克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸seqidno.3和核苷酸序列4；

（2.2）所述重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)分别与克隆载体(pjetcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌dh5a，由于pjet载体带有氨苄(amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在amp抗性的lb固体培养基上，37°过夜培养；

（2.3）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；

（2.4）根据测序结果保留候选的重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)序列，再次pcr扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)序列，将pcr产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌dh5a，由于表达载体带有卡那霉素(kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在kana抗性的lb固体培养基上，37°过夜培养；

（2.5）测序方法参照（2.4）对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；

（2.6）连接有目的单抗重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)基因的表达载体共转染真核表达细胞株293；

（2.7）收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与m435结合良好，阳性率达95%以上，表明已获得正确的抗体重链和轻链可变区序列。

在本发明的一个优选实施例中，其中，步骤（2.6）中，所述真核表达细胞株293为悬浮培养，sfm4transfx-293withoutl-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用gibco®freestyle™293expressionmedium无血清培养基替换；通过7天连续培养后收获上清，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45um滤器过滤除菌。

为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：

一种抗人b7-h3单克隆抗体的应用，其中，所述抗人b7-h3单克隆抗体用于制备用于肿瘤组织的免疫组化检测的试剂盒。

为了实现本发明的目的之四，所采用的技术方案是：

一种抗人b7-h3单克隆抗体的试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述抗人b7-h3单克隆抗体。

另外本发明还提供了一种抗人b7-h3单克隆抗体用于免疫组化检测组织标本，发现用该抗体b7-h3检测结直肠癌和胃癌组织标本，结果显示b7-h3在正常结直肠组织和胃炎组织基本不表达，瘤变阶段表达上调，在结直肠癌和胃癌高表达，且与病人的预后及生存相关。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的抗人b7-h3单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测，提高肿瘤标本免疫组化检测的精确度，有助于恶性肿瘤的诊断、确定原发部位和病理分型，提高肿瘤尤其是低分化或未分化肿瘤的诊断准确率。

附图说明

图1a为流式细胞术分析抗人b7-h3单抗4h12对l929/b7-h3表面b7-h3分子的阳性对照(positivecontrol)示意图。

图1b为流式细胞术分析抗人b7-h3单抗4h12对l929/b7-h3表面b7-h3分子的实验组示意图。

图2为b7-h3抗体用于免疫组化检测结直肠癌组织示意图。

图3a为b7-h3在结直肠癌发生发展不同阶段异常表达示意图（1）。

图3b为b7-h3在结直肠癌发生发展不同阶段异常表达示意图（2）。

图4a为b7-h3单抗对浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变和胃癌组织进行组化染色的结果示意图（1）。

图4b为b7-h3单抗对浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变和胃癌组织进行组化染色的结果示意图（2）。

图5为对160例临床胃癌组织进行了b7-h3分子的免疫组化检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。

图1-5的解释如下：

图1a\1b为流式细胞术分析抗人b7-h3单抗4h12对l929/b7-h3表面b7-h3分子的识别，其中灰色峰为阴性对照。

a为阳性对照(positivecontrol)，一抗为商品化pe标记的抗人b7-h3单抗。

b为实验组，一抗为抗人b7-h3抗体4h12，二抗为荧光素pe标记的羊抗人igg。

control:商品化b7-h3抗体阳性对照；

4h12:本发明抗人b7-h3单克隆抗体；

count为细胞数，como-fl2为pe荧光强度。

图2为b7-h3抗体用于免疫组化检测结直肠癌组织。

图3a为b7-h3在结直肠癌发生发展不同阶段异常表达。

a上:b7-h3在正常肠上皮未见表达；

a下,b,c:在上皮内瘤变，炎症，结直肠癌的发展过程中，b7-h3表达逐渐上调。

图3b为b7-h3在结直肠癌演变过程中的表达水平,其在正常结直肠组织基本不表达，在结直肠腺瘤阶段表达上调，从息肉、腺瘤、高级别瘤变到癌变过程中，提示b7-h3分子在结直肠癌发生、发展不同阶段的表达可能参与调节不同时相的肿瘤免疫应答。

图4a\4b为b7-h3单抗对浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变和胃癌组织(从左往右)进行组化染色，结果显示b7-h3在炎症组织基本不表达，在瘤变阶段表达上调，胃癌组织异常高表达b7-h3。

图5为对160例临床胃癌组织进行了b7-h3分子的免疫组化检测，负性共刺激分子b7-h3联合浸润的cd8阳性细胞分析病人的预后结果显示，b7-h3/cd8对于胃癌病人的临床用药指导和预后评估是有一定意义，在cd8低浸润b7-h3高表达的组织中，病人预后较差，而cd8高表达，病人预后较好。

实施例中所用生物材料来源如下：

实施例1产生b7-h3单克隆抗体的杂交瘤的获得

（一）免疫小鼠

用融合蛋白或转基因细胞免疫小鼠，免疫四次，每次间隔21天，第四次免疫7-10后测小鼠眼眶血效价，效价测定好则加强免疫。

（二）细胞培养

1.于融合前1d，取6~7周龄balb/c小鼠1只，置于75%乙醇溶液中2min。

2.无菌取出小鼠脾脏，置于200目的不锈钢筛网中，研磨获得单个细胞悬液。用1640基础培养基洗涤两遍（1400rpm，5min）备用。用15%fbs的1640培养基，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，滴加入96孔培养板中，每孔100μl，37℃、5%co2培养箱中培养。

3.过夜培养，第二天在低倍显微镜下观察。并铺亚克隆细胞150ul。

（三）融合与筛选

准备：

1.器材：泡老鼠杯；简易解剖台；杂交瘤包；保温水浴杯；温度计；96孔培养板。

2.试剂：75%乙醇溶液；37℃预热1640基础培养基；37℃预热peg1ml；37℃预热1640基础培养基14ml（peg终止液）；37℃预热1640选择培养基（含15%fbs，并计算加入hat的量，使得最终96孔培养板中培养基的hat终浓度为1%）。

步骤：

1.将免疫小鼠，用流水冲洗，置于75%乙醇溶液中2min。

2.无菌取出小鼠脾脏，置于200目的不锈钢筛网中，研磨获得单个细胞悬液。用预热1640基础培养基洗涤两遍（1400rpm，5min）备用。

3.收集生长良好、处于对数生长期的sp2/0细胞,用预热1640基础培养基洗涤两遍（1400rpm，5min）备用。

4.将sp2/0细胞或ag8细胞与脾脏细胞混合于50ml透明塑料离心管中，一般脾细胞:骨髓瘤细胞比例为5:1，预热1640基础培养基洗涤一遍（1400rpm，5min），弃尽上清（以避免对peg产生不必要的稀释）并用掌心搓管底（或手指轻轻弹击管底），使两种细胞充分混匀成悬浮细胞状。

5.将离心管置于37℃保温水浴杯中预热，吸取1ml经37℃预温的50%的peg溶液，在1min内匀速加完，且边加边轻轻震荡离心管，加完后在37℃水浴中轻晃60s。（3秒滴一滴）

6.沿管壁轻柔加入14ml37℃预温的1640基础培养基终止（第1min加1ml，3min加3ml，最后缓慢加入10ml）。（匀速滴加）

7.37℃静止5min后离心（800rpm，5min），弃去上清（将离心管倾斜，吸去上清）。

8.将沉淀细胞轻轻用37℃预热的1640选择培养基重悬(不可吹打)，加入到事先准备好的预热培养基中后，混匀后滴加在上述含有滋养细胞的96孔培养板中，100µl/孔，置于37℃、5%co2培养箱中培养，3-4d后半量换液，10d后改用ht培养基培养，2周后转用含10%fbs的1640培养基培养。

9.期间每天观察96孔板中克隆生长情况，一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。对于有特异性分泌抗体的细胞应及时克隆培养并冻存。通常需3-5次亚克隆才能获得稳定基因型和稳定分泌表型的细胞，且培养一段时间后需再次亚克隆。

实施例2b7-h3抗体重轻链可变区的测序

1.提取杂交瘤细胞的cdna：从该杂交瘤细胞株中提取rna，并使用rt-pcr技术，将获得的rna反转录为cdna；利用特定设计的上下游引物pcr克隆该杂交瘤细胞重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)；

2.mvh和mvl分别与克隆载体(pjetcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌dh5a，由于pjet载体带有氨苄(amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在amp抗性的lb固体培养基上，37°过夜培养；

3.待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；

4.根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，再次pcr扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将pcr产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌dh5a，由于表达载体带有卡那霉素(kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在kana抗性的lb固体培养基上，37°过夜培养；

5.测序方法参照4.对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；

6.连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293。293细胞为悬浮培养，sfm4transfx-293withoutl-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用gibco®freestyle™293expressionmedium无血清培养基替换。通过7天连续培养后收获上清，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45um滤器过滤除菌；

7.收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与乳腺癌细胞m435结合良好。

通过上述方法获得的b7-h3抗体重链可变区：

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三个高变区：gftfsrya、isddgrnt、vrhraittarfdy。

抗体轻链可变区：

dilmtqspssmsvslgdtvsitchasqdissnigwlqqgpgnsfkgliyhgtnledgvpsrfsgsgsgadysltisglesedfadyytlqsvqfpytfgggtkleik

三个高变区：qdissn、hgt、lqsvqfpyt。

本发明从分泌抗人b7-h3单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mvh)和轻链可变区(mvl)，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，pcr扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将pcr产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌dh5a。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，培养收获的上清含有目的抗体，证明得到的重链和轻链可变区序列正确；

实施例3免疫组织化学技术

1.石蜡切片

取新鲜组织，修剪为1cm×1cm×0.3cm大小组织块，中性福尔马林液中固定24h，梯度酒精溶液脱水（70%酒精15min、80%酒精15min、90%酒精1h、95%酒精2h，无水乙醇2h），二甲苯透明（共两次，每次各30min），浸蜡（共两次，第一次1h，第二次2h），石蜡包埋后切5μm薄片，贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片。

2.免疫组化染色

0.03%h2o2-甲醇孵育30分钟，滴加10%bsa，室温孵育30分钟，勿洗，滴加一抗（抗人cd105抗体稀释度为1：100），以pbs代替一抗作为阴性对照，37℃孵育2h，pbs冲洗，滴加通用型二抗即用液，37℃孵育30min，pbs冲洗三遍，dab-h2o2显色，经苏木素复染，1%盐酸-酒精分化，梯度乙醇中脱水（75%乙醇3min，95%乙醇i3min，95%乙醇ii3min，100%无水乙醇i3min，100%无水乙醇ii3min）后，吹风机吹干无水乙醇，中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。

序列表

<110>苏州旭光科星生物技术有限公司

<120>一种抗人b7-h3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒

<130>20180107

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