丙肝病毒基因6a型中国毒株全长感染性克隆及其应用的制作方法

文档序号：18461038发布日期：2019-08-17 02:01阅读：95来源：国知局

本专利涉及丙型肝炎病毒细胞培养体系的构建，主要内容为丙肝病毒6a型中国毒株全长感染性克隆的建立与应用。

背景技术：

全世界大约有7100万人感染丙型肝炎病毒(hcv)，慢性hcv感染会导致肝硬化甚至肝癌。目前，还没有研发出针对hcv的疫苗。hcv是单股正链rna病毒，全长大约有9.6kb。hcv基因组由一个大的开放阅读框(orf)和两端的非编码序列(utr)组成。orf被病毒和宿主的蛋白酶切割成10个病毒蛋白，分别为结构蛋白：核心蛋白，包膜蛋白1，包膜蛋白2和非结构蛋白(ns)：p7,ns2,ns3,ns4a,ns4b,ns5a和ns5b。

hcv基因组是多样性的，根据基因组内部的碱基差异可以将其分为个不同的基因型和不少于67个基因亚型。最近有报道发现基因8型病毒。hcv的细胞培养体系的构建能够帮助进行hcv的基础研究以及药物测试和疫苗的研发。基因6型在华南地区比较流行，目前还没有基因6型中国毒株的全长细胞培养体系，即6型的全长感染性克隆。

技术实现要素：

我们通过从hcv感染的病人血清里提取病毒的rna，反转得到病毒的cdna并通过pcr的方法得到病毒整个毒株序列，命名为ch6a。ch6a全长克隆不能在huh7.5系列细胞上复制，将ch6a的ns5b换成jfh1序列之后的嵌合体同样不能在细胞当中培养，但是增加hk6a/jfh1嵌合体病毒和文献中的7个突变点之后，该嵌合体病毒能在huh7.5细胞上复制，但是不能得到高峰的病毒。加入gd3ac-ns2的4个适应性突变后在huh7.5细胞上复制可以达到高峰。

ch6a病毒序列名称如下：

ch6a^fl-wt

ch6a^c-ns2/jfh1-gfp

ch6a^c-ns2_4m/jfh1-gfp

ch6a^c-5a_7m/jfh1

ch6a^c-5a_11m/jfh1

ch6a^c-5a_15m/jfh1

ch6a^c-5a_18m/jfh1

ch6aorf_22m

ch6aorf_24m

ch6aorf_25m

ch6aorf_26m

ch6afl_26m

这个6a型的细胞培养模型可以用于药物和疫苗的研发，以及hcv相关的基础性研究。

附图说明

图1为ch6ac-ns2/jfh1和ch6ac-ns2m4/jfh1转肝癌细胞后的传播图。将ch6ac-ns2重组体(野生型或具有所示突变)的rna转录本转染到huh7.5.1细胞中，分别通过免疫染色或在荧光显微镜下直接观察hcv核心或ns5a-egfp抗原。得出hcv阳性细胞的百分比(左y轴对应线条图)。通过焦点形成单位(ffu)测定感染高峰时(≥80％hcv阳性细胞)上清液中的hcv感染性滴度[3个平行感染的平均值±标准偏差(sd)，右y轴对应条形图]。(a)野生型ch6ac-ns2重组体的转染。将从第25天和第27天收集的c-ns2病毒的上清液接种到幼稚细胞以产生传代病毒，并且连续地产生第五代病毒用于序列分析(表1)。(b)ch6ac-ns2_4m的转染，其含有在第五代的c-ns2病毒中鉴定的四个突变(4m，i355m/n416s/i831v/l881f)(表1)。

图2为不同突变组合使ch6acore-ns5a重组病毒在肝癌细胞里高效复制。(a)具有不同突变(7m，11m，15m和18m)的ch6a重组体的示意图。7m是来自hk6a5-5a病毒的f1469l/a1677s(ls)(li等，2012，pnas-3月份)，v1555l/i1720f/l1795m(li等，2014，gastroenterology)和来自共有6a亚基因组复制子的k1303r/k1696r的组合(yu等，2014，aac)。从core-ns2重组体中鉴定出4m(i355m/n416s/i831v/l881f；绿色)(表1)。从传代的c-5a_11m病毒中鉴定出红色突变(表2)。(b)将具有指定突变的c-5a重组体的rna转录本转染到huh7.5.1-visi-mcherry细胞中(zhao等，2017jvirol)，并估计mcherry阳性细胞的百分比(左侧y轴对应线条)和测定感染峰值时培养物上清液中的hcv感染性滴度(3次感染的平均值±sd，右侧y轴对应条柱形)。(c)将从第33,35和37天收集的c-5a_11m病毒连续传代至未感染的新细胞。第1代，第3代，第5代和第8代的病毒扩散感染和峰值感染性滴度为平行进行的两个实验感染中的一个代表数据。从峰值感染收集的传代病毒的orf序列分析见表2。

图3为带不同突变的ch6aorf和全长感染性克隆在转染细胞里高效复制。a)ch6aorf和具有22,24,25和26个突变(22m，24m，25m和26m)的全长重组病毒示意图。22m是18m(图2a)加i833t/r932g(来自c-5a_11m病毒)(表2)和d2987g/y2989f(gf突变)(li等，2012，pnas–3月份)的组合。将从ch6aorf_22m鉴定的突变q1120k/k1648q，q1120k/k1648q/a2941v和i413t/q1120k/k1648q/a2941v(在图b和表3中)克隆到ch6aorf_22m中分别构建ch6aorf_24m，ch6aorf_25m和ch6aorf_26m。突变由不同颜色表示[黑色，以前鉴定的突变；绿色，来自c-ns2病毒的4m(详见表1)；红色，来自c-5a_22m病毒(表2)；蓝色，来自ch6aorf_22m(详见表3)]。病毒对药物的敏感性见图4。(b-d)ch6aorf和具有如图所示不同突变的全长重组体的转染。实验估测mcherry阳性细胞的百分比(左侧y轴对应线条)和测定峰值感染时的hcv感染性滴度(3次感染的平均值±sd，右侧y轴对应条柱形)。j6/jfh1-ns5aδ40-egfp用作阳性对照(gottwein等，2011,jvirol)。(e)huh7.5细胞中ch6aorf_26m和ch6afl_26m的转染。通过core免疫染色(左侧y轴对应线)显现hcv阳性细胞，通过ffu测定(三次感染的平均值±sd，右侧y轴对应条柱形)hcv感染性滴度。

图4为ch6a病毒被simeprevir和sofosbuvir剂量依赖性地抑制。与之前建立的全长感染性hcv克隆1a(tncc)，2a(j6cc)和2b(j8cc-ht)比较对药物的敏感性。病毒感染96孔板中的huh7.5细胞后后24小时加入不同浓度的daa，并再放置48小时，固定细胞，免疫染色计数hcv阳性细胞。实验中加入2a嵌合体j65'utr-ns2/jfh1(li等，2011pnas)作为阳性对照。图中所示值为实验中一式3个重复的平均值±sem(平均值的标准误差)。

具体实施方式

1.从血清当中提取出病毒ch6a的rna，反转得到病毒的cdna。

pcr扩增得到病毒的全部序列,并构建到质粒载体中,全长序列为9641bp(附序列ch6a^fl-wt)。

2.构建嵌合体病毒质粒并加入突变(见各附图附表显示的突变)。

3.体外转录的方法从质粒上转录出病毒的rna，然后转染huh7.5及系列细胞。

4.检测了病毒滴度及感染获得的适应性突变。

5.检测了病毒对当前临床药物的敏感性。

表1.序列分析ch6ac-ns2重组病毒鉴定出突变。将来自ch6acore-ns2(c-ns2)转染的huh7.5.1细胞的培养上清液(第11天和第13天，图1b)接种到细胞中，当病毒扩散感染大多数细胞后收集上清液(定义为第1代病毒)。连续传播病毒并得到第9代病毒。第5代和第9代病毒的c-ns2区域的序列分析鉴定出了突变。表中给出重组病毒的核苷酸和氨基酸位置以及h77参考序列(af009606)的相应位置。用斜线分隔的两个大写字母表示测序读数中的核苷酸准种(50/50)。点(·)表示与原始核苷酸相同，原始氨基酸以单个字母显示。将四个突变(4m，i355m/n416s/i831v/l881f)克隆到c-ns2中构建c-ns2_4m(图1)。

表2.经历多次传代后的ch6ac-5a_11m病毒的序列分析。将ch6acore-ns5a(c-5a)转染后的huh7.5.1-visi-mcherry细胞(第33,35和37天；图2b)的培养上清液分别进行两个独立的感染实验(实验1和2)，进行病毒传代，经过连续传代，最后获得第8代病毒。第1代，第3代，第6代和第8代病毒的orf序列分析发现两个实验的传代病毒中的有许多突变(见感染实验1-表的第i部分；感染实验2–表的第ii部分)。用斜线分隔的一个大写字母和一个小写字母表示测序读数中主要峰/次要峰的核苷酸准种。有关核苷酸注释，请参见表1注解。

^a11m是指突变i355m/n416s/i831v/l881f/k1303r/f1469l/v1555l/a1677s/k1696r/i1720f/l1795m的组合。

第i部分(parti,ch6ac-5a_11m^a,independentinfectionexperiment1)

第ii部分(partii,ch6ac-5a_11m^a,independentinfectionexperiment2)

表3.第一和第二代ch6a_22m病毒的序列分析结果。将来自ch6aorf_22m(图3a)的培养上清液感染huh7.5.1-visi-mcherry细胞，在新细胞上传代。对第一代和第二代病毒进行orf测序，发现病毒获得了新的突变。用斜线分隔的两个大写字母表示测序读峰中的核苷酸准种为50/50。点(·)表示与原始核苷酸一样，没有突变。阴影表示该核苷酸被克隆到重组质粒中。ch6aorf_26m(ch6acc)的序列分析没有鉴定出其他突变。将四个突变组合(i413t/q1120k/k1648q/a2941v)克隆到ch6aorf_22m中，构建ch6aorf_26m(图3)。

序列表

<110>中山大学

<120>丙肝病毒基因6a型中国毒株全长感染性克隆及其应用

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<212>dna

<213>丙型肝炎病毒ch6afl-wt(hepatitiscvirus)

<400>1

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