龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法与流程

本发明涉及分子生物工程技术领域，具体涉及一种龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法。

背景技术：

龙葵是我国传统中药材，历史悠久。近年来由于其药用成分具有显著的抗肿瘤功效，龙葵逐渐引起国内外专家学者的高度重视。随着相关品的不断研发与生产，龙葵作为一种新兴经济作物，逐渐实行人工种植。加工型龙葵作为东北、山东等地的新兴产业，产品品质优良，效益显著、市场前景广阔，在区域经济发展、农业产业结构调整、农业增效和农民增收中的作用日益显著。

近期发现一种龙葵病害普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲、果实萎缩的症状，严重影响龙葵采收，防治形势不容乐观。龙葵在我国分布广泛，如果任由该病害进一步传播蔓延，将会对我国龙葵产业带来很大影响。此外龙葵属茄科，同科很多重要经济作物(如番茄、马铃薯、茄子)，该病害有可能在茄科经济作物上传播引发新病害。然而，目前暂无龙葵病毒病害报道，缺少对龙葵病害的有效检测手段，导致对该病害无针对性防治方法，造成严重的经济损失。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何确定引起龙葵曲顶症状的病毒病原及如何有效地检测该病毒。

为解决上述问题，一方面，本发明提供引起龙葵曲顶症状的龙葵曲顶病毒全基因组序列，具体序列如序列表seqno：1所示，龙葵曲顶病毒全基因组序列长2867bp。

进一步的，龙葵曲顶病毒全基因组序列包含v1、v2、v3、c1、c2、c3和c47个orf(开放阅读框)，所述v1、v2、v3、c1、c2、c3和c4序列如序列表seqno：2-8所示。

进一步的，所述v1、v2、v3、c1、c2、c3和c4编码的氨基酸序列如seqno：9-15所示，各氨基酸序列长度分别为95aa、242aa、82aa、347aa、158aa、134aa、85aa。

另一方面，发明还提供了一种用于扩增所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的扩增引物，引物序列如下：

nctv-f：gcgtttatagtgaaatgtttaggcat

nctv-r：caagaatatcttcctcacatatcccag。

另一方面，本发明还提供了上述扩增引物的获取方法，包括如下步骤：

(1)样品采集与rna提取：将田间发现有病毒症状的龙葵的发病部位剪下，提取植物总rna；

(2)sirna深度测序：将提取的样品总rna进行sirna建库与测序；

(3)sirna深度测序数据处理与分析：利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤、序列拼接，得到若干contigs；

(4)根据病毒来源的上述contigs使用引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，获得扩增引物序列。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述扩增引物获取所述龙葵曲顶病毒全基因组序列的方法，包括如下步骤：

(1)提取病毒侵染的龙葵组织总dna；

(2)采用所述扩增引物，以所述龙葵组织总dna为模板，进行pcr扩增；

(3)回收pcr扩增得到的dna产物，并将其连接到plb平末端载体，进行dna测序，得到龙葵曲顶病毒全基因组序列。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测所述龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，两对所述检测引物序列如下：

另一方面，本发明还提供了一种检测所述龙葵曲顶病毒的方法，使用上述特异性检测引物进行pcr检测。

进一步的，检测方法包括如下步骤：

(1)采集疑似感病植物材料，提取疑似感病的植物总dna；

(2)将步骤(1)终产物植物总dna稀释到100ng/μl，用所述检测引物进行普通定性pcr扩增；

(3)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带，用1kbdnamarker作为片段大小对照标准，根据电泳图确定检测结果。

进一步的，pcr体系如下：

pcr反应循环的设置如下：

本发明有益效果如下：

1)本发明鉴定了引起龙葵曲顶症状的病毒病原为一种新的双生病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，orf序列及编码氨基酸序列，为后期该病毒的研究及病害的防治打下基础。

2)本发明提供了用于龙葵曲顶病毒基因序列扩增的扩增引物及其获取方法，采用sirna深度测序，测序数据经处理分析，获得若干contigs，采用病毒来源的contigs设计特异性病毒全长基因组扩增引物，该引物特异性强，扩增效率高，能可靠获得长度为2867bp的dna产物。

3)本发明设计的龙葵曲顶病毒检测引物具有特异性强、检测结果可靠的优点，使用该检测引物通过pcr能够准确可靠地检测该病毒。

附图说明

图1为感染龙葵曲顶病毒的龙葵叶片；`

图2为龙葵曲顶病毒环状dna结构示意图；

图3为利用检测引物对疑似感染病毒的植物材料进行龙葵病毒pcr检测电泳图(注：m代表dnamarker；数字1和2分别代表引物nctv-1和nctv-2；sample1-3代表三个检测样品；ck代表阴性对照)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

实施例一基于sirna深度测序的植物病毒鉴定

(1)样品采集

将田间发现有病毒症状(如花叶、卷叶、黄化、皱缩等)的龙葵发病部位剪下，放入采集袋中，做好标记；回到实验室后，立即用液氮研磨，提取植物总rna，或者用液氮速冻后，立即保存于-80度冰箱备用。

(2)植物总rna提取

1)取0.1g植物叶片，液氮中快速研磨至粉末；

2)粉末转移至1.5ml离心管中，加入1mltrizol，振荡混匀，室温静置5min；

3)向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈摇晃15sec后室温静置3min；

4)4℃12,000rpm离心15min，小心吸取上清转移至新的1.5ml离心管中，重复步骤3到4一到两遍；

5)将上清转移到新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇后颠倒数次混匀，室温放置20～30min；

6)4℃12,000rpm离心10min，弃上清，用1ml70％酒精洗涤沉淀两次；

7)4℃12,000rpm离心5min，弃上清，室温干燥沉淀；

8)用50μldepc处理水溶解沉淀；

9)取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳检测提取rna的质量；

10)将样品置于-80℃冰箱保存。

(2)sirna深度测序

将提取的样品总rna送至测序公司进行sirna建库与测序。

(3)sirna深度测序数据处理与分析

利用生物信息学软件对测序数据进行原始数据过滤，去除原始数据中包含的接头信息、低质量序列。然后根据病毒来源的sirna之间具有overlap的特点，用velvet软件对上述小rna进行序列拼接，得到若干contigs。将上述contigs在ncbi数据库中进行blastn和blastx比对，得到这些contigs在病毒基因组上的位置。

实施例二龙葵曲顶病毒的全基因组序列测定

(1)植物dna提取

采用ctab法抽提病毒侵染龙葵组织的总dna，具体方法为：取0.2g植物组织叶片，在液氮中磨成粉末，将粉末转移至1.5ml离心管中，加入600μl65℃预热的ctab提取液，快速混匀，65℃条件下保温30min，不时颠倒混匀；待冷至室温后加入500μl氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；取上清液，加入600μl预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm，离心5min；弃去上清液，沉淀用800μl70％的乙醇洗涤沉淀两次；稍干燥，将dna沉淀溶解于30μl灭菌的双蒸水，4℃保存。

(2)扩增引物设计

根据上述病毒来源的contigs序列，通过引物设计软件设计特异性病毒全长基因组扩增引物，扩增引物序列如下：

nctv-f：gcgtttatagtgaaatgtttaggcat

nctv-r：caagaatatcttcctcacatatcccag

(3)病毒序列扩增

pcr反应体系如下：采用上述扩增引物，以步骤(1)提取的龙葵组织总dna作为模板，选择kod-plus-neo高保真dna聚合酶进行目的片段的扩增，反应体系如下：

pcr反应循环的设置如下：

pcr反应结束后获得病毒序列扩增产物。

(4)回收测序

回收长度为2867bp的dna产物，并将其连接到plb平末端载体，plb平末端连接反应体系如下：

轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5sec，将混合反应液放置室温(22℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应，终载体送测序公司进行dna测序，测序结果如序列表seqno：1所示。

实施例三病毒基因组生物信息学分析

(1)病毒基因组结构分析：利用ncbiorffinder软件以及snapgene软件预测病毒编码orf及编码蛋白，结果如图1及序列表seqno：2-8和seqno：9-15所示，该病毒全基因组序列包含7个orf，该病毒的病毒链编码v1(运动蛋白，mp)、v2(外壳蛋白，cp)、以及未知功能蛋白v3，互补链编码c1(复制相关蛋白rep)、c2(复制增强蛋白ren)、c3、c4四个蛋白。

(2)病毒分子变异进化分析：病毒基因组序列之间的变异进化利用mega6分析软件进行分析，病毒基因组核苷酸序列分析显示该病毒与番茄伪曲顶病毒(tomatopseudo-curlytopvirus，tpctv)基因组序列具有72％的相似性。

氨基酸同源性比对发现病毒编码的v1、v2、c1、c2、c3核苷酸序列与tpctv编码核苷酸序列相似性在63％～89％之间；而c4、v4以及c2中的87bp片段与tpctv基因组序列无显著相似性。进一步比对发现nctv编码的c4与巴豆黄脉花叶病毒(crotonyellowveinmosaicvirus，cyvmv)编码的c4具有89.9％的相似性。以上结果说明nctv可能是由两种不同属的双生病毒通过病毒基因组重组获得的。

实施例四病毒检测方法

(1)采集疑似感病植物材料，提取疑似感病的植物总dna，方法同实施例二步骤(1)；

(2)根据龙葵曲顶病毒全基因组序列设计龙葵曲顶病毒的特异性检测引物，两对所

述检测引物序列如下：

其中，引物nctv-1的扩增产物长139bp；引物nctv-2的扩增产物长276bp；

(3)将步骤(1)终产物稀释到100ng/μl，用步骤(2)所述检测引物进行普通定性pcr扩增，以2×taqpcrmix含燃料产品为例(南京喏维赞greentaqmix)普通pcr体系如下：

pcr反应循环的设置：

(4)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带，用1kbdnamarker(thermofishergeneruler1kbdnaladder)作为片段大小对照标准，凝胶电泳检测结果如图3所示，可以看出两对引物均能扩增出三个样品中该病毒的基因片段，说明两对检测引物特异性强、检测结果准确可靠。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

序列表

<110>中国计量大学

<120>龙葵曲顶病毒全基因组序列及其检测方法

<130>19-100233-00012707

<141>2019-05-10

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2867

<212>dna

<213>龙葵曲顶病毒(solanumnigrumcurlytopvirus)

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