一种能直接反应i型干扰素应答的慢病毒载体及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明提供了一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，通过克隆技术将pDonor?IRF3全长的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表达载体由高斯荧光素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC，形成慢病毒表达载体IRF3?BiLC。本发明的有益效果：第一：与目前是用的I型干扰素应答报告系统相比，IRF3?BiLC的报告系统具有特异的反应I型干扰素的应答。第二：IRF3?BiLC的报告系统能够直接且快速的反应瞬时的或者是持续性的I型干扰素的应答。
【专利说明】
-种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体及其制备方法 与应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体及其制备方法与应用， 属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 人体在遭受病毒如流感病毒、丙肝病毒和瘤疹病毒等W及细菌感染会引起天然免 疫（innate immunity)和获得性免疫反应(adaptive immunity) (1)。其中，天然免疫反应主 要是通过诱导干扰素（InterferonJFN)的产生，激活下游的干扰素诱导基因（ISGs),从而 发挥抗病毒作用（2,3)。对于RNA病毒，如流感病毒和丙肝病毒，病毒侵染进入细胞，释放出 来的RNA能被细胞内的RNA识别受体如RIG-I、MDA5等，然后招募线粒体上的IPS-I蛋白W及 憐酸化TBKl蛋白，被憐酸化的TBKl蛋白能够引起IRF3蛋白的憐酸化和二聚体的形成，从而 进入细胞核引起干扰素的产生(4)。对于DNA病毒，如瘤疹病毒和腺病毒，其进入体内后释放 出来的DNA能被孤X41、CGAS W及IF116等DNA识别受体识别，并诱导STING的多聚，从而引起 TBKl的憐酸化W及IRF3二聚的活化，进而使干扰素转录翻译(5-7)。对于细菌侵染，主要是 通过细胞膜上的化R4识别受体识别细菌的LPS物质，从而引起下游TRIF、TRAF6、TBKl W及 IRF3的二聚体的激活，从而使干扰素应答反应。产生的干扰素能够通过诱导ISGs的表达，从 而使细胞能够清除侵染进入的RNA病毒或者DNA病毒。因此，干扰素应答在病毒和细菌侵染 过程中异常重要。为了更好和有效地抵抗病毒W及细菌的侵染W及清除，对干扰素应答的 调节机制的研究尤为重要。
[0003] 目前，干扰素激活反应元件的巧光素酶报告（ISRE-Luc)做为研究干扰素产生机制 研究的主要报告系统。ISRE-Luc是一个模拟细胞基因组的反应过程，其拥有一个与基因组 一样序列的ISRE启动子，启动子后接有一个全长的人源化的蛋火虫巧光素酶的表达基因。 当细胞遭受病毒或者细菌感染时，其能引起细胞内的干扰素应答反应，从而是ISRE启动子 转录活化，从而引起巧光素酶基因的转录翻译和表达。因此，通过检测蛋火虫巧光素酶的活 性，可W反应细胞内干扰素应答反应的强度。目前，其主要用于一些蛋白分子或者是药物对 干扰素应答调节机制的研究和筛选。然后，ISRE的转录激活能被IRF3二聚体、IRF7二聚体识 别并发生转录（8);同时转录翻译产生的干扰素能够二次激活放大通过干扰素识别受体 (IFNAR1等），引起STAT1/STAT2/IRF3(ISGF3)S聚体的形成，并能识别ISRE并引起转录(9， 10)。因此，ISRE-Luc不能特异及精确地反应细胞内干扰素调节机制；其次，由ISRE的二次放 大需要依赖细胞的干扰素识别受体（IFNAR1等），因此，其不适合用于敲除IFNARl或者是 STATl等活性收到影响等体系的条件下检测细胞的干扰素调节机制;m^，ISRE-Luc需要转 录和翻译水平，其不能很好地反应对于一些分子或者药物在转录水平或者是翻译水平对干 扰素应答的调节。
[0004] 综上所述，一个特异、灵敏、直接且被能广泛应用的干扰素应答反应的报告系统具 有广阔的应用前景。
[0005] W上【背景技术】中提及的文献具体分别参考于W下：
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【发明内容】
[0019] 本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种灵敏特异直接反应I型干扰素 应答的IRF3-B i IX报告系统。
[0020] 本发明的目的通过W下技术方案来实现：
[0021] -种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，通过克隆技术将pDonor-IRF3全长 的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表达载体由高斯巧光 素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC,形成慢病毒表达载体IRF3-BiLCo
[0022] 优选地，所述慢病毒载体可W构建能直接反应I型干扰素应答的细胞系。
[0023] 优选地，所述细胞系为THP-I (IRF3-BiLC)细胞系或THP-I-Dual细胞系。
[0024] 优选地，所述细胞系构建方法包括如下步骤：
[0025] S1、质粒的构建:构建祀nt巧-IRF3质粒;通过特异性引物将IRF3基因进行扩增，并 对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pEntry-IRF3全长的穿梭质 粒；
[00%] S2、慢病毒表达载体构建:采用GlucN和GlucC部分，分别克隆到慢病毒载体上；
[0027] S3、慢病毒载体构建:通过克隆技术，将构建好的祀ntry-IRF3全长的穿梭质粒同 源到可诱导型的慢病毒表达载体，形成pBiLC-IRF3-GlucN和pBiLC-IRF3-GlucC分别表达 IRF3-G1UCN融合蛋白、及IRF3-GlucC融合蛋白；
[0028] S4、稳定表达IRF3-BiLC的细胞的构建:表达IRF3-G1UCN融合蛋白载体、表达IRF3-GlucC融合蛋白载体通过pMDLg/pRRE/，pRSV-Rev，pMD2. GS质粒系统整合于相对应的细胞 内；
[0029] 用于IRF3基因用于扩增的特异性引物，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO: 1、 沈Q ID NO:2。
[0030] 优选地，所述Sl中IRF3基因的扩增条件为95°C预变性2min;再进行30个循环，循环 所遵循条件为95°C变性20s，56°C退火30s，72°C延伸Imin;最后采用72°C延伸5min。
[0031] 优选地，所述的IRF3-BilX报告系统的IRF3-GlucN和IRF3-GlucC是基于慢病毒载 体系统，既能作为稳转使用，也可作为瞬转系统使用。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] 第一:与目前是用的I型干扰素应答报告系统相比，IRF3-BiLC的报告系统具有特 异的反应I型干扰素的应答。
[0034] 第二：IRF3-BiLC的报告系统能够直接且快速的反应瞬时的或者是持续性的I型干 扰素的应答。
【附图说明】
[00巧]图1是构建IRF3-BiLC质粒结构示意图。
[0036] 图2是检测THP-l(IRF3-BiLC)在不同的刺激条件下诱导的IRF3二聚体信号值。
[0037] 图3是检测不同IFN刺激对IRF3-BiLC的影响。
[003引图4是检测不同IFN刺激对ISRE-Luc的影响。
[0039] 图5是检测CHX对IRF3-BiLC的影响。
[0040] 图6是检测C册对ISRE-Luc的影响。
【具体实施方式】
[0041] 本发明具体掲示了一种灵敏特异直接反应I型干扰素应答的IRF3-BilX报告细胞 系W及构建方法。其具体包括
[0042] l、IRF3-BiLC慢病毒表达载体的构建
[0043] BiLC的原理为：将高斯巧光素酶(Gaussia Iuciferase)在某些特定的位点切开， 形成没有巧光素酶活性的N和C端两个多肤，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-打agment) (Remy and Michnick,2006;(^issonnet et al.,2011;Tannous et al.,2005)。运两个片段 在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成具有活性的巧光素酶蛋白。但是，当运两 个巧光素酶蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外 混合运两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，巧光素酶蛋白的两个片段在空间上 互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的巧光素酶蛋白分子，在底物腔肠素(CTZ)的条 件下，WCTZ为底物发光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则会有巧光素酶WCTZ 为底物产生的光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不有巧光素酶的活性。
[0044] 将Gaussialucif erase从109位氨基酸的位置分为N端和C端，并将N端的16个氨基 酸去掉，记为GlucN和GlucC。在上海捷锐公司合成人源化的GlucC和GlcuN基因片段，分别通 过AscI and RsrII (购自肥B)酶切位点，通过T4链接酶(购自肥B)进入慢病毒慢病毒载体上 (US20120201794A1)，标记为地化C1-2。
[0045] IRF3(NM_001197122.1)基因则是通过设计特异的引物已人源细胞的CDNA作为模 板扩增，所诉扩增条件95 °C预变性2min;再进行30个循环，循环所遵循条件为95 °C变性20s， 56°C退火30s，72°C延伸Imin;最后采用72°C延伸SmiriDW上所述引物序列见表1。
[0046] 表1:引物序列表 「OfUTl
[004引用NotI、AscI (购自肥B公司）双酶切PCR产物和pEnt巧载体（购自Invitrogen公 司），用T4连接酶(购自肥B公司）连接片段到祀nt巧载体上，测序鉴定正确后提质粒保存记 为祀nt;ry-IRF3。通过Gateway cloning技术，将祀nt;ry-IRF3克隆到慢病毒BiLC表达载体即 pBiLC-IRF3-GlucN 和 pBiLC-IRF3-GlucC，分别表达 IRF3-GlucN 和 IRF3-GlucC 的融合蛋白。 构建的质粒如图1所示。
[0049] 检测IRF3-BiLC对于不同刺激的应答
[0050] 构建具有稳定表达IRF3-BiLC的THP-I细胞系。具体操作步骤如下：
[0化1] a，慢病毒包装：转染的前一天铺皿K293T细胞(ATCC: CRkl 1268)于24孔板（购自 Iliermo公司），500ULDMEM(购自Invi化Ogen)全培养基（10 %FBS，购自Gibco);待细胞长至 50 % -60 %密度时转染；每孔转染的质粒共约Iug，其中pMDLg/pRRE : pRSV-Rev : pMD2 . G: IRF3-GlucN/IRF3-GlucC = 4: 2:1:2。转染化后，去除培养基，补充ImL新鲜的培养基。4化后 收取上清放入EP管中，250化pm离屯、4min。取上清转移到新的EP管中W用于病毒侵染。
[00对 b，病毒侵染：在收取病毒前18h，用IOOuL的DMEM铺10，OOO个THP-I细胞 (Invivogen)于96孔板(购自Thermo公司）中。在侵染前，移去约50uL的RMPI 1640。在收取的 上清病毒液中加入6ug/mL的polybrene(购自sigma)，混匀，每个96孔中加入约IOOuL的病毒 液。待侵染6-化后，移去50化96孔中的部分培养基，加入IOOuL新鲜的培养基。7化后即可从 96孔板中将细胞传出筛选并扩大培养，即得至ljTHP-l(IRF3-BiLC)细胞系。
[0053] 得到的THP-l(IRF3-BiLC)细胞系用于测试对于不同刺激下IRF3的二聚化形成的 巧光素酶活性。分别用TNF、化-18、1?5、9〇171:(：、9〇17(^:肌^及￥5￥-66。?刺激。用80祉海肾 巧光素酶裂解液(购自Promega，E2820)，冰上裂解IOmin，用移液器吹匀，转移50uL细胞裂解 液到巧光素酶检测板(购自PE)，每孔加入20uL海肾巧光素酶底物(购自Promega,E2820)，用 酶标仪来检测（购自Bio-Tek，Syne巧yHl)巧光素酶活性。结果如图2所示，TNFa、化-IB不能 引起IRF3二聚信号的形成，而1口5、口〇171:0、口〇17(^:扣^及￥5￥-66尸口能不同程度的引起 IRF3二聚信号。
[0054] 检测IRF3-BiLC反应干扰素应答反应的特异性
[005日]铺THP-I-Dual(具有稳定表达的ISRE-Luc报告系统，购于Invitogen公司）或THP-I (IRF3-BiLC)细胞，^1000,000个细胞每1111的浓度铺到24孔板中。14小时后，转染。分为8组。 其中Dual的四组中，一组记为NT组，其他S组分别加入IFNa (终浓度lOng/mL)、IF她(终浓度 lOng/mL)、IFN 丫（终浓度20ng/mL);IRF3-BiLC的四组中做与ISRE-Luc的四组同样的处理。 24小时，分别检测蛋火虫巧光素酶（W海肾巧光素酶作为内参)和高斯巧光素酶(异蛋火虫 巧光素酶作为内参）。
[0化6] 结果如图3-图4所示，IRF3-BiLC组不受干扰素二次放大激活的影响，而ISRE-Luc 组能被很强的影响，且不能特异的反应I型干扰素的诱导。
[0化7] 检测IRF3-BiLC应用的广泛性
[0化引为了验证IRF3-BiLC广泛性应用，设置了如下实验：
[0059] 1.转录抑制剂存在的条件下应用
[0060] T册-I-Dual (Invivogen)具有稳定表达的 ISRE-Luc报告系统。将raP-1-Dual和 THP-I(IRF3-BiLC)细胞，W1000，000个细胞每mL的浓度铺到24孔板中，分别设置4个小组， 共8组。12小时后，对于THP-I-Dual细胞用Lipo2000转染5mg/mL的polydA:dT刺激其中2组细 胞，另外两组不做处理。对于THP-I (IRF3-BiLC)也同样的处理。转染4小时候后，对于THP-I-Dual细胞转染了 polydA:dT刺激的2组，一组加入终浓度为l(K)ng/mL的CHX，对于不做处理的 两组中的一组加入终浓度为l(K)ng/mL的CHX，其他两组则不做处理。对于THP-l(IRF3-BiLC) 也同样的处理。加入CHX处理IOh后，对于THP-I-Dual细胞则分别取40化上清检测巧光素酶 活性（购自Promega，E2820)，对于raP-l(IRF3-BiLC)用SOuL海肾巧光素酶裂解液（购自 Promega，E2820)，冰上裂解lOmin，用移液器吹匀，转移50uL细胞裂解液到巧光素酶检测板 (购自PE)，每孔加入20化海肾巧光素酶底物(购自Promega，E2820)，用酶标仪来检测（购自 Bio-Tek, Synergy化）巧光素酶活性。将检测的巧光素酶的值W未处理组做归一化处理。 [0061 ]结果如图5-图6所示，IRF3-BiLC能在存在CHX的情况下，其能反应细胞内I型干扰 素的应答反应。ISRE-Luc则受到了明显的影响。
【主权项】
1. 一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体，其特征在于：通过克隆技术将 pDonor-IRF3全长的穿梭质粒同源重组克隆到慢病毒BiLC表达载体中；所述慢病毒BiLC表 达载体由高斯荧光素酶从109位氨基酸的位置分为N端和C端，记为GlucN和GlucC，形成慢病 毒表达载体IRF3-BiLC。2. 如权利要求1所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在 于:所述慢病毒载体可以构建能直接反应I型干扰素应答的细胞系。3. 如权利要求1所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在 于:所述细胞系为THP-1 (IRF3-BiLC)细胞系或THP-1-Dual细胞系。4. 如权利要求2所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在 于:所述细胞系构建方法包括如下步骤： 51、 质粒的构建:构建pEntry-IRF3质粒;通过特异性引物将IRF3基因进行扩增，并对扩 增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pEntry-IRF3全长的穿梭质粒； 52、 慢病毒表达载体构建:采用GlucN和GlucC部分，分别克隆到慢病毒载体上； 53、 慢病毒载体构建:通过克隆技术，将构建好的pEntry-IRF3全长的穿梭质粒同源到 可诱导型的慢病毒表达载体，形成pBiLC-IRF3-GlucN和pBiLC-IRF3-GlucC分别表达IRF3-GlucN融合蛋白、及IRF3-GlucC融合蛋白； 54、 稳定表达IRF3-BiLC的细胞的构建：表达IRF3-GlucN融合蛋白载体、表达IRF3-GlucC融合蛋白载体通过pMDLg/pRRE/，pRSV-Rev，pMD2.G三质粒系统整合于相对应的细 胞内； 用于IRF3基因用于扩增的特异性引物，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2〇5. 如权利要求4所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在 于:所述S1中IRF3基因的扩增条件为95°C预变性2min;再进行30个循环，循环所遵循条件 为95°C变性20s，56°C退火30s，72°C延伸lmin;最后采用72°C延伸5min。6. 如权利要求4所述的一种能直接反应I型干扰素应答的慢病毒载体的应用，其特征在 于:所述的IRF3-BiLC报告系统的IRF3-GlucN和IRF3-GlucC是基于慢病毒载体系统，既能作 为稳转使用，也可作为瞬转系统使用。
【文档编号】C12N15/65GK105861559SQ201610220345
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】秦晓峰, 王子宁, 纪静芸
【申请人】苏州奥特铭医药科技有限公司