一种草莓FaABCC1转运蛋白基因及其应用的制作方法

本发明涉及植物分子基因工程技术领域，具体涉及一种草莓faabcc1转运蛋白基因及其应用。

背景技术：

花青素属于类黄酮化合物，是构成草莓果实颜色的主要色素，对于形成果实外观品质至关重要。同时，花青素不仅具有重要的生物学功能，还能够保护植物本身抵抗紫外线、低温和病虫害等，还具有重要的医疗和保健功能。因此，开展花青素在果实内的代谢和累积等相关研究，具有十分重要的意义。

花青素在草莓果实内是先在细胞质内合成，而后被转运到液泡中贮存。其中，花青素生物合成是由一系列结构基因的催化以及受myb、bhlh和wd40等转录因子的协同调控。花青素的生物合成途径已非常清楚，但是花青素从细胞质被转运至液泡的过程仍不清楚。

研究发现，abc转运蛋白(atp-bindingcassetteproteins)与花青素转运密切相关。abc转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(atp-bindingcassettetransporters)，核心单元包括两个高度保守的atp结合结构域(nucleotide-bindingfold，nbf)和两个跨膜结构域(transmembranedomains，tmds)，大多数abc转运蛋白都能利用水解atp释放的能量直接转运底物，主要包括肽、糖、脂、重金属螯合物和多种植物次生代谢产物等。abc转运蛋白是作为一种膜结合蛋白来行使其转运功能的。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种草莓faabcc1转运蛋白基因及应用，能够调控草莓果实着色。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

一种草莓faabcc1转运蛋白基因，所述faabcc1转运蛋白基因具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述faabcc1转运蛋白基因的编码区具有如seqidno：2所示的核苷酸序列。

优选的，所述faabcc1转运蛋白基因编码的氨基酸序列如seqidno：3所示。

本发明还提供含有所述faabcc1转运蛋白基因的表达载体。

优选的，所述表达载体为phellsgate2-faabcc1。

本发明还提供含有所述faabcc1转运蛋白基因的宿主菌。

本发明还提供所述faabcc1转运蛋白基因在调控草莓果实花青素积累中的应用。

优选的，将所述faabcc1转运蛋白基因注射入草莓果实中。

本发明还提供所述faabcc1转运蛋白基因在表达基因chi、dfr、ans、ufgt中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明克隆出的草莓faabcc1转运蛋白基因，与草莓果实花青素积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，chi、dfr、ans、ufgt等花青素合成主要基因表达量受到抑制；

(2)本发明利用生物化学与分子生物学以及基因技术手段探讨草莓果实花青素的分子调控机制，为草莓品种的选育和改良提供新的技术途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中faabcc1转运蛋白基因克隆pcr凝胶电泳图；其中m为marker；

图2为phellsgate2-faabcc1表达载体的图谱；

图3为本发明实施例2中anti::faabcc1干扰载体构建单酶切检测结果图；其中m为marker；1号泳道为faabcc1干扰目的片段(长度为505bp)；2号泳道为anti::faabcc1-1号质粒xho1的单酶切；3号泳道为anti::faabcc1-1号质粒xba1的单酶切；4号泳道为anti::faabcc1-2号质粒xho1的单酶切；5号泳道为anti::faabcc1-2号质粒xba1的单酶切；6号泳道为phellsgate2空载体质粒xho1的单酶切；7号泳道为phellsgate2空载体质粒xba1的单酶切；8号泳道为phellsgate2空载体质粒；

图4为本发明实施例3中草莓果实注射处理后的果实着色图；其中a为注射处理前的草莓果实；b为注射处理后的草莓果实；

图5为本发明实施例3中实时定量pcr检测草莓果实注射后faabcc1表达结果图；

图6为本发明实施例3中实时定量pcr检测草莓果实注射后花青素合成关键基因chi表达图；

图7为本发明实施例3中实时定量pcr检测草莓果实注射后花青素合成关键基因dfr表达图；

图8为本发明实施例3中实时定量pcr检测草莓果实注射后花青素合成关键基因ans表达图；

图9为本发明实施例3中实时定量pcr检测草莓果实注射后花青素合成关键基因ufgt表达图；其中col为侵染液注射的草莓果实；anti1、anti2、anti3为anti::faabcc1干扰重组质粒农杆菌介导注射的草莓果实，三次重复。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

草莓faabcc1转运蛋白基因的克隆

(1)以ncbi中登录号xm_011465641.1基因为参照，用dnaman软件依据xm_011465641.1基因序列设计faabcc1-f上游引物和faabcc1-r下游引物，以“红颜”草莓转色期果实的cdna为模版，进行pcr反应，克隆得到faabcc1基因，连接pmd-18t载体，转化dh5α，阳性单克隆检测，提取正确的重组质粒备用。

所用基因克隆扩增引物序列为：

(2)pcr体系如下：

pcr反应程序为：94℃变性1min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环；72℃10min，4℃保温。

(3)转化步骤如下：

①连接产物转化大肠杆菌感受态：重组dna粘附在细菌细胞表面，42℃热击处理90sec，促进dna吸收；然后，在37℃非选择lb液体(不添加抗生素)培养基中，震荡培养1h，均匀涂布在添加100mg/l氨苄青霉素(amp)的lb固体培养基中，37℃培养过夜；

②挑取单克隆，重新进行活化，即在添加100mg/l抗生素amp的lb固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃培养过夜；

③挑取菌落，按照上述pcr反应体系进行菌落pcr反应检测；

④根据菌落pcr结果，挑取菌落，置于添加抗生素amp的液体lb培养基中震荡培养10h，送上海生工生物工程有限公司测序；

⑤选取测序正确的单菌落，转入20ml的lb液体培养基(含20μlamp)中，37℃摇床振摇12-16h，提取质粒。

(4)提质粒步骤如下：

①取1-4ml在lb培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃上清。

②加250μlbuffers1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；确认buffers1中已加入rnasea；

③加入250μlbuffers2，温和并充分地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

④加入350μlbuffers3，温和并充分地上下翻转4-6次，12000×g离心10min；

⑤吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液；

⑥将制备管置回离心管，加500μlbufferw1，12000×g离心1min，弃滤液；

⑦将制备管置回离心管，加700μlbufferw2，12000×g离心1min，弃滤液；

⑧将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min；

⑨将制备管移入新的1.5ml中，在制备管膜中央加60-80μleluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。

图1为faabcc1转运蛋白基因克隆pcr凝胶电泳图，faabcc1转运蛋白基因序列全长4872bp，faabcc1转运蛋白基因的碱基序列如seqidno：1所示；faabcc1转运蛋白基因的编码区序列长度为3846bp，其碱基序列如seqidno：2所示；faabcc1转运蛋白基因编码1282个氨基酸，其编码的氨基酸序列如seqidno：3所示。

实施例2

构建phellsgate2-faabcc1表达载体

本实验采用phellsgate2干涉载体(华中农业大学刘继红教授所赠)进行重组构建。

将实施例1得到的faabcc1转运蛋白基因，连接pmd-18t载体，提取质粒；以antif和antir为扩增引物，以pmd-18t-faabcc1重组质粒为模板进行pcr反应，回收目的基因产物。将目的基因与phellsgate2载体进行连接。25℃连接12h后，加入1μl反应终止酶。

具体步骤为：

热击法转化dh5α大肠杆菌感受态(上海唯地生物有限公司)。phellsgate2干涉载体进行重组构建表达载体。在faabcc1的5’端选取500bp左右的片段设计引物(见下表)，以草莓cdna为模板扩增得到目标片段，pcr产物经回收后，经bp反应重组连接至phellsgate2载体，构建成干扰重组质粒。选取菌落pcr反应后正确的单克隆菌株，提取质粒并进行带有phellsgate2-faabcc1基因的质粒进行xho1和xba1单酶切验证。选取酶切验证正确的带有phellsgate2-faabcc1基因的质粒，冻融法转化农杆菌gv3101(上海唯地生物有限公司)。菌落pcr鉴定。

(1)anti::faabcc1构建干扰重组质粒扩增引物：

在faabcc1的5’端选取500bp左右的片段设计引物，并在特异引物前加入attb位点通用引物(下划线标记为attb位点，见下表)，作为目标片段扩增引物。

酶切体系如下：

(2)pcr反应程序为：94℃变性2min；94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃10min，4℃保温。

(3)农杆菌转化步骤为：

①从-80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

②每100μl感受态加1μg质粒dna混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

③加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；

④5000rpm离心三分钟收集菌，留取50μl左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天；

⑤挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每300μl加入50％甘油700μl置于-80℃保存。

实验结果：图2为phellsgate2-faabcc1表达载体的图谱，利用长度为505bp的faabcc1干扰目的片段构建anti::faabcc1干扰载体，阳性单克隆菌株提取质粒分别用xho1和xba1单酶切，如图3所示，切下来的片段比靶基因505bp长200bp左右，即为构建正确的干扰重组质粒。

实施例3

faabcc1转运蛋白基因草莓的获得及该基因在草莓果实的表达模式

(1)挑选实施例2鉴定正确的单菌落进行草莓果实侵染；选择大绿果时期的八倍体果实为试材，采用注射法进行果实侵染，具体方法如下：

①挑取含phellsgate2-faabcc1质粒的阳性克隆，接种至15mllb培养基中(含有50mg·l^-1的卡那和50mg·l^-1利福平)，28℃、200rpm(转/分钟)摇菌至od600≈2.0；

②取20ml新鲜的lb液体培养基(含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l利福平)，接入1ml步骤1的农杆菌，28℃、200rpm摇至od600≈0.6；

③收集菌液，室温、6000rpm离心3min。

④用侵染液重新悬浮菌液，室温条件下，6000r/s离心3min。侵染液配置：分别配置浓度为1.0mol/l的mes、1.0mol/l的mgcl2以及浓度为1.0mol/l的乙酰丁香酮，取200μl的mes、200μlmgcl2、20μl乙酰丁香酮，灭菌水定容至20ml，即为侵染液，备用；

⑤重复步骤④一次；

⑥最后用20ml侵染液重新悬浮菌株，室温静止2h，注射法侵染草莓果实；

数据测定：将phellsgate2-faabcc1载体注射草莓样品提取rna，荧光定量qrt-pcr方法检测基因表达变化，使用toyobo公司荧光定量酶(thunderbird^tmqpcrmixwithoutroxcode：qps-201)，使用方法参照此试剂说明书进行，分析该基因在草莓果实的表达模式。

(2)faabcc1基因克隆扩增引物如下表所示：

(3)pcr程序为：

(4)pcr反应程序为：95℃，2min；95℃，15sec；60℃，1min(50个循环)；溶解曲线。

实验结果：

图4为草莓果实注射后的果实着色图，其中a为注射前的草莓果实颜色，b为注射后的草莓果实颜色，可以看出，注射区域的草莓果实着色明显受到抑制；

图5为实时定量pcr检测草莓果实注射后faabcc1表达结果图，其中col为侵染液注射草莓果实；anti1、anti2、anti3为anti::faabcc1干扰重组质粒农杆菌介导注射草莓果实，三次重复；可以看出，注射农杆菌后faabcc1基因表达显著降低；

图6、图7、图8、图9分别为实时定量pcr检测草莓果实注射后花青素合成关键基因chalconeisomerase(chi)、dihydroflavonol4-reductase(dfr)、anthocyanidinsynthase(ans)、udp-glucoside:flavonoidglucosyltransferase(ufgt)的表达图，可以看出，基因faabcc1过量后，花青素合成主要基因chi、dfr、ans、ufgt表达量显著下降，因此，faabcc1基因与草莓果实花青素积累相关。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>一种草莓faabcc1转运蛋白基因及其应用

<130>100

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4872

<212>dna

<213>atp-bindingcassetteproteins

<400>1

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