高效的单碱基编辑系统OsSpCas9-eCDA及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体的，本发明涉及一种高效的单碱基编辑系统osspcas9-ecda，含有该单碱基编辑系统osspcas9-ecda的表达盒、表达载体、打靶载体、转基因细胞以及它们的应用。

背景技术：

目前的基因编辑技术(zfn，talen，crispr/cas9)依赖于在靶位点诱导双链断裂，进而激活dna修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生dna片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现有效地克服了这一问题。

单碱基基因编辑技术(baseeditors，bes)，指能在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(apobec)或腺苷脱氨酶与现存cas9n(d10a)融合而形成，依赖于crispr原理使得靶点远离pam端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是cbes(cytidinebaseeditors)——嘧啶碱基转换技术(c/g到t/a)，另一种是abes(adeninebaseeditors)——嘌呤碱基转换技术(a/t到g/c)。

基于crispr/cas9基因编辑系统，2016年4月，哈佛大学生物化学家davidliu组率先在《自然》杂志上报告了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。同年，日本神户大学akihikokondo组和我国上海交通大学的常兴组先后发表了类似的研究报告。单碱基编辑系统主要由sgrna和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而常兴组的融合蛋白仅包含cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgrna通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的胞嘧啶c经脱氨基作用转变为尿嘧啶u，而dna复制进一步使得u被t代替，而互补链上原来与c的互补碱基鸟嘌呤g将会变成腺嘌呤a，而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制u的切除，最终实现非互补链上的c替换为t和互补链上g替换为a的精确编辑。

转基因技术在改良作物性状方面已经做了大量的工作，但由于外源基因的导入和公众科普的缺乏，使得转基因作物的推广和应用存在较大的难度。作物在漫长的人工选育过程中，人类通过人工选择的方式定向选育具有优良性状的基因突变株，但该过程耗时、耗力且不可控。利用同源重组技术，可以获得定点修饰的优良植物株，但由于同源重组的效率太低，因此可行性不高。单碱基编辑技术在人细胞中高效编辑单个碱基的结果，提示可以通过该系统在农作物中的行定点可控的基因编辑，进而快速、高效地获得优良性状的植株。在植物中，共有三种由c/g到t/a的编辑器已被测试，一种是使用小鼠的胞嘧啶脱氨酶(apobec)的be3系统、一种是使用海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶(targetedactivation-inducedcytidinedeaminase(pmcda)的定向激活诱导的aid系统，一种是使用了人aid系统变体的rbe5系统。这三种系统与spcas9或sacas9系统融合，已在水稻、玉米、小麦、拟南芥、番茄和西瓜中成功实现了单碱基编辑。但目前使用的单碱基编辑系统仍然存在一定的缺陷，如在植物中的编辑效率较低；非理想位置的碱基突变较多。为了提高单碱基编辑效率及理想位置的碱基突变频率，有必要对现在的单编辑系统进行优化和改造。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高效的单碱基编辑系统osspcas9-ecda及其在植物基因组编辑中的应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种高效的单碱基编辑系统osspcas9-ecda，所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda能够对植物基因组进行剪切且具有：

(a)seqidno：1所示的核苷酸序列；或者

(b)seqidno：1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且仍能够进行植物基因组剪切的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种表达盒，所述表达盒含有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda。

本发明第三方面提供一种表达载体，所述表达载体插入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda或如上所述的表达盒。

本发明第四方面提供一种打靶载体，该打靶载体插入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda或如上所述的表达盒以及靶位点序列。

本发明第五方面提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体或如上所述的打靶载体。

本发明第六方面提供如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体、如上所述的打靶载体或如上所述的转基因细胞在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，以对植物基因组实现由c/g到t/a的单碱基编辑，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

本发明提供的单碱基编辑系统osspcas9-ecda能够在植物特别是水稻中高效地进行由c/g到t/a的单碱基编辑。

附图说明

图1是本发明提供的一种具体的表达载体phun411-ecda载体的示意图。

图2是采用本发明提供的表达载体phun411-ecda对水稻进行基因组编辑后产生的突变形式。

图3是采用对比的表达载体phun411-cda对水稻进行基因组编辑后产生的突变形式。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种单碱基编辑系统osspcas9-ecda，所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda能够对植物基因组进行剪切且具有：

(a)seqidno：1所示的核苷酸序列；或者

(b)seqidno：1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且仍能够进行植物基因组剪切的核苷酸序列。

其中，术语“仍能够进行植物基因组剪切的核苷酸序列”是指与seqidno：1所示的核苷酸序列对植物基因组的剪切效率相比，seqidno：1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸后所获得的核苷酸序列的剪切效率不低于seqidno：1的65％，例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。

本发明还需要说明的是，本发明所述的“具有”而并非是指任意的含有除seqidno：1所示的核苷酸序列或其突变体以外的核苷酸或核苷酸序列，而是指根据本领域技术人员的常规手段，为了便于或有利于对seqidno：1所示的核苷酸序列或其突变体进行操作或实现seqidno：1所示的核苷酸序列或其突变体的复制等而含有的不影响其功能发挥的核苷酸或核苷酸序列，例如，酶切位点、标记基因、筛选基因等。因此，本发明所述的“具有”是指具有seqidno：1所示的核苷酸序列或其突变体，但仍然能够实现seqidno：1所示的核苷酸序列或其突变体功能的序列。

根据本发明一种具体的实施方式，所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda的核苷酸序列如seqidno：1所示。

第二方面，本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体插入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda或如上所述的表达盒。

根据本发明，所述表达载体的构建方法可以按照本领域常规的方法进行，例如，使用相同的限制性内切酶对所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda和待插入的载体进行酶切，然后再使用连接酶将所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda连接到载体中，得到本发明的表达载体。

其中，所述限制性内切酶可以根据引入到所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda中的酶切位点进行具体的选择，例如，可以为noti/saci限制性内切酶。

其中，所述连接酶可以本领域常规使用的各种能够将两种核酸片段进行连接的连接酶，例如，可以为t4连接酶。

其中，所述载体可以为本领域常规使用的各种载体，优选的，所述载体可以为puc57-amp、phun400或phun900，这些载体均可以通过商购获得。根据本发明一种优选的实施方式，所述载体为phun900，进一步的，可以利用noti/saci酶切位点，用noti/saci酶切phun900载体和所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda并回收，之后利用t4连接酶将所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda连接到phun900载体，得到植物表达载体phun-osspcas9-ecda，命名为phun411-ecda。

第四方面，本发明提供一种打靶载体，该打靶载体插入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda或如上所述的表达盒以及靶位点序列。

根据本发明，所述靶位点序列可以根据实际需要进行基因组编辑的序列而定，但是所述靶位点序列需要包括ngg特征的pam序列。根据本发明一种具体的实施方式，所述靶位点序列为seqidno：2所示的核苷酸序列(水稻pi-d2基因(os06g0494100)中第1366-1386位的核苷酸序列ccattattattgtcattatgctc，(下划线部分为5’-ngg-3’结构的pam序列反向互补序列，其中，n为t、a、g或c)。

根据本发明，所述打靶载体在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得。

第五方面，本发明还提供了一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体或如上所述的打靶载体。

根据本发明，所述细胞的选择可以根据基因打靶所处的阶段来定，具体的，例如，当进行打靶载体构建之前，需要实现单碱基编辑系统osspcas9-ecda的扩增时，可以采用大肠杆菌作为宿主细胞，当需要将打靶载体转化到植物细胞中时，可以采用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)作为宿主细胞，此外，所述转基因细胞还包括转入有所述打靶载体的植物细胞，所述植物细胞，例如可以为植物的愈伤组织细胞。

第六方面，本发明还提供了如上所述的单碱基编辑系统osspcas9-ecda、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体、如上所述的打靶载体或如上所述的转基因细胞在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，以对植物基因组实现由c/g到t/a的单碱基编辑，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

根据本发明，所述植物优选为单子叶植物，更优选为水稻，进一步优选为粳稻，再进一步优选为粳稻日本晴。

根据本发明，利用所述单碱基编辑系统osspcas9-ecda识别带有ngg特征的pam序列，完成水稻体内dna双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有由c/g到t/a的单碱基突变突变位点的转基因植物或植物部分。

根据本发明，将打靶载体导入到植物细胞中的方法可以按照本领域常规的方法进行。

根据本发明一种具体的实施方式，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；其中，所述种子可以为成熟种子；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带osspcas9-ecda的打靶载体的农杆菌接触15分钟，具体的是将愈伤组织浸泡在农杆菌的悬浮液中；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5ml农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；其中，前筛选培养基可以为表1中所列的前筛选培养基；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根；其中，生根培养基可以为表1中所列的生根培养基。

根据本发明，如上所使用的各种培养基均可以为本领域常规使用的培养基，优选的，可以使用表1中所列出的培养基，其中，所用到的培养基的配置可以参考文献：yongboduan,chenguangzhai,haoli,juanli,wenqianmeietal.anefficientandhigh-throughputprotocolforagrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninjaponicarice(oryzasatival.).plantcellreports,2012,31:1611-1624进行。

表1

注：“n6大量元素”指的是，该n6大量元素中[no3^-]/[nh4⁺]＝40mm/10mm。

实施例

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书sambrookanddavidrussell，molecμlarcloning:alaboratorymanual,3rded.,vols1,2；charlesnealstewart,alishertouraev,vitalycitovskyandtzvitzfira,planttransformationtechnologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1

本实施例用于说明osspcas9-ecda基因的拼接

(1)将现有的海七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶(cytidinedeaminase，pmcda)进行水稻密码子优化，得到密码子优化的胞嘧啶脱氨酶氨基酸序列，命名为os-pmcda。将os-pmcda基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于puc57-amp载体上，形成puc57-amp-pmcda载体，并装载入大肠杆菌xl-blue菌株中。

(2)人工合成3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(uracildnaglycosylase(udg)inhibitor，ugi)，命名为eugi，连接于puc57-amp载体上，形成puc57-amp-eugi载体，并装载入大肠杆菌xl-blue菌株中。

(3)spcas9基因是本实验室进行水稻密码子优化后的，来自于phun4c16载体。该载体已由本实验室申请了国家发明专利(一种用于基因工程的骨干质粒载体，专利申请号：201410225911.4)。

(4)根据gibson拼接原理，将spcas9基因，密码子优化后的pmcda基因os-pmcda，3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(eugi)连接在一起，并连接于puc57-amp载体上。具体操作如下：

根据os-pmcda基因、spcas9基因和eugi基因的拼接顺序及puc57-amp载体序列，分别合成引物，引物具体如表2所示：

表2

以spcas9基因为模板，用引物spcas9hrfp(seqidno：2)及spcas9hrrp(seqidno：3)进行pcr扩增，将pcr组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃45秒、58℃45秒、72℃4分钟，最后在72℃延伸10分钟，回收pcr产物。

以ospmcda基因为模板，用引物pmcda-spcas9hrfp(seqidno：4)及pmcda-spcas9hrrp(seqidno：5)进行pcr扩增，将pcr组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃45秒、58℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟，回收pcr产物。

以eugi基因为模板，用引物sp-eugihrfp(seqidno：6)及eugihrrp(seqidno：7)进行pcr扩增，将pcr组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃45秒、58℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟，回收pcr产物。

将上述的三个回收片段，及经ecori酶切之后的puc57-amp载体片段，根据gibson拼接原理，按照nebgoldengateassemblykit说明书，构成spcas9基因，ospmcda，eugi基因融合在一起的基因，命名为osspcas9-ecda基因，序列如seqidno：1所示，连接于puc57-amp载体上，并装载入大肠杆菌xl-blue菌株中。

同理，构建spcas9基因，ospmcda，一个ugi基因融合在一起的基因，命名为spcas9-cda基因。

实施例2

本实施例用于说明含有osspcas9-ecda基因植物打靶载体的构建

从上面含有osspcas9-ecda载体的大肠杆菌xl-blue，用axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用noti/saci酶切，回收osspcas9-ecda片段。同时利用noti/saci酶对phun900进行线性化处理，回收phun900，将上述的osspcas9-ecda片段和phun900片段用t4连接酶(购于takara公司)进行连接，得到植物表达载体phunspcas9-ecda(图1)，命名为phun411-ecda。

选择水稻pi-d2基因(os06g0494100)中第1366-1386位的核苷酸序列ccattattattgtcattatgctc，(下划线部分为所述5’ngg-3’结构的pam序列反向互补序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与phun411-ecda融合形成phun411-ecda-pi-d2。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

同理，构建phun41-cda-pi-d2表达载体，转入根癌农杆菌eha105菌株中，用于遗传转化。

实施例3

本实施例用于说明以phun411-ecda-pi-d2为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50ml的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有phun411-ecda-pi-d2载体的农杆菌菌株eha105在含有50mg/l卡那霉素的lb固体培养基上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/l卡那霉素的lb平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50ml的无菌离心管中加入20-30ml农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整od660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min，其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5ml农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用ctab法进行dna小提。将所得到的基因组dna样品用于pcr分析。设计pcr引物5’-actaacttcttccctcctgcgg-3’(seqidno：8)及5’-agatccaaaccctccctgacca-3’(seqidno：9)，用于扩增pi-d2靶标附近的150bp左右的序列。将pcr组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将pcr产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图2和图3)。

结果显示：在phun411-ecda-pi-d2获得的植株中，在检测的28株植株中出现24株突变，都是在靶标序列中不同位置的g突变成a，单碱基变异效率达到85.7％，而且没有不想要的突变，如g突变成c(图2)。同样的，在phun411-cda-pi-d2获得的植株中，在检测的40株植株中有22株靶标序列出现单碱基变异，突变率达到55％。但是g突变成a这样“干净”的突变植株只有5株，突变率只有8％，其余的突变形式为g突变成c，或是插入了不必要的碱基(图3)。由此可见，phun411-ecda不仅能获得更高的单碱基突变率，而且理想的“干净”的单碱基变异率更高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>高效的单碱基编辑系统osspcas9-ecda及其应用

<130>hfi00863-nysd

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<170>patentinversion3.3

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<213>单碱基编辑系统osspcas9-ecda

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<213>分子鉴定正向引物

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<210>9

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<213>分子鉴定反向引物

<400>9

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