一种构建高效枯草芽孢杆菌启动子的方法与流程

本发明涉及一种构建高效枯草芽孢杆菌启动子的方法，属于基因工程
技术领域：
。
背景技术：
：枯草芽孢杆菌是广泛应用于表达外源蛋白的革兰氏阳性模式菌株，其因能够高效表达外源蛋白在工业酶制剂生产方面有广泛应用。但是，目前应用的枯草芽孢杆菌启动子，尤其是天然的内源枯草芽孢杆菌启动子(如p43启动子)活性较低、表达外源基因的稳定性较差，这一缺陷严重制约了枯草芽孢杆菌在高效表达外源蛋白领域的应用。为了克服这一缺陷，近些年人们一方面利用定向进化的思路对天然启动子进一步筛选和改造，另一方面利用基因工程方法和合成生物学思路构建人工合成启动子。其中改造天然启动子虽然能大幅度提升启动子活性，但仍无法规避天然启动子自身的一些缺陷，如表达不稳定、与其他表达调控元件兼容性不强等。因此，构建高效稳定的人工启动子对于突破天然启动子活性瓶颈、提升启动子元件稳定性和兼容性方面有巨大的应用前景。目前，构建人工启动子主要有两种策略，一种是利用天然启动子为基本骨架，筛选高活性天然启动子并进行精简、改造、重排、组合，进而构建出新的包含天然启动子骨架的高效人工启动子。另外一种策略是全人工合成随机的一定长度的dna序列，克隆到启动子筛选载体上，借助高通量筛选设备和高通量筛选方法，筛选出众多随机序列中具有启动子功能的全人工合成序列作为启动子元件使用。这两种策略各有明显劣势，前者依赖高活性的天然启动子，也需要人们对启动子的工作原理有较为深入的认识，并且对于串联启动子来讲，新启动子如果包含多个重复的序列片段，将会对启动子和表达载体的稳定性带来不利影响；后者虽然不需要深入理解启动子的工作机制，但是从全随机序列中筛选到目标启动子需要昂贵的高通量筛选仪器设备，筛选效率低。因此，提供一种构建高效稳定启动子的方法，对于高效表达外源蛋白具有重要意义。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种调控基因表达的元件，包括人工串联启动子和其下游的rbs，所述人工串联启动子是将启动子prpob、pspovg和psigw中的至少两个进行串联，所述启动子prpob、pspovg和psigw的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.7和seqidno.11所示。在本发明的一种实施方式中，所述人工串联启动子的核苷酸序列如seqidno.17-seqidno.27任一所示在本发明的一种实施方式中，所述人工串联启动子的核苷酸序列如seqidno.29-seqidno.59任一所示。在本发明的一种实施方式中，当在prpob和pspovg启动子的核心区之间分别了插入了60bp、75bp的间隔序列，分别获得如seqidno.32、seqidno.33所示的新启动子paw-d60、pah-d75。在本发明的一种实施方式中，当在psigw、prpob和pspovg的前两个启动子的核心区之间分别插入了45bp、75bp的间隔序列，分别获得如seqidno.43、seqidno.45所示的新启动子pwah-d45、pwah-d75。在本发明的一种实施方式中，当在prpob、psigw和pspovg的前两个启动子的核心区之间分别插入了30bp、90bp的间隔序列，分别获得如seqidno.54、seqidno.58所示的新启动子pawh-d30、pwah-d90。在本发明的一种实施方式中，所述rbs的核苷酸序列如seqidno.60-72任一所示。本发明的第二个目的是提供含有上述元件的载体。本发明的第三个目的是提供表达上述载体的基因工程菌。本发明的第四个目的是提供一种调控枯草芽孢杆菌中目的基因表达的方法，将上述的调控元件与目的基因共表达。在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括酶。在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括bacillussubtilis168、bacillussubtiliswb400、bacillussubtiliswb600或bacillussubtiliswb800。本发明的第五个目的是提供上述的调控元件或基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。本发明的第六个目的是提供上述的调控元件或基因工程菌在食品、制药或化工领域的应用。本发明的有益效果：本发明首先筛选和表征了不同sigma亚基识别启动子，从中选择被siga、sigh和sigw亚基识别的活性最高(将含不同调控元件的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌中，以重组菌培养后培养液的荧光强度表征目的基因表达量和调控元件的活性)的启动子，通过核心区的双串联和三串联、核心区间隔序列优化、rbs重设计等方式，获得了活性进一步提高的调控元件。paw-d60、pah-d75荧光强度比改造前的paw(荧光强度为20262a.u/od600)分别提高了0.94倍、1.03倍；pwah-d45、pwah-d75荧光强度(18245a.u./od600)比改造前的pwah(荧光强度为10261a.u/od600)分别提高了0.87倍、0.96倍；pawh-d30、pwah-d90荧光强度比改造前的pawh(荧光强度为16879a.u/od600)分别提高了0.78倍、0.78倍。将pah-d75与rbs11(seqidno.70)组合时，荧光强度可达76216a.u/od600，比pah-d75提高了0.85倍；将pwah-d75与rbs13(seqidno.72)组合时，荧光强度可达77751a.u/od600，比pwah-d75提高了1.17倍；将pawh-d30与rbs13(seqidno.72)组合时，荧光强度可达73781a.u/od600，比pawh-d30提高了1.45倍.。通过本发明提供的方法，我们可以用简便的启动子设计和改造方法获得活性更高、设计性和兼容性更强的启动子。该方法简单、易于实现，在构建外源蛋白高效表达系统和合成生物学研究中具有广阔的应用前景。附图说明图1：不同sigma亚基识别的天然内源启动子核心区筛选和表征。图2：串联启动子构建和活性表征。图3：串联启动子核心区间隔序列优化a：间隔序列优化示意图；b：pah间隔序列优化；c：pwah间隔序列优化；d：pawh间隔序列优化。图4：启动子与rbs兼容性检测，a：prpob启动子rbs设计；b：pspovg启动子rbs设计；c：psigw启动子rbs设计；d：pah-d75启动子rbs设计；e：pwah-d75启动子rbs设计；f：pawh-d30启动子rbs设计。具体实施方式1、启动子克隆方法：设计包含启动子序列的引物，以带有sfgfp报告基因(genbankid：avr55189.1)的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pb-sfgfp(即pbsg03，构建方法见guanc,cuiw,chengj,etal.constructionanddevelopmentofanauto-regulatorygeneexpressionsysteminbacillussubtilis[j].microbialcellfactories,2015,14(1):150)为模板，用primestarmaxdna聚合酶(购自takara，货号：r045q)进行全质粒pcr，pcr程序为：预变性98℃1min，循环为变性98℃30s，退火50℃30s，延伸72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。之后用限制性内切酶dpni消化去除质粒模板，将pcr产物纯化。之后用infusion重组方法将片段环化，转化大肠杆菌jm109感受态细胞。2、sfgfp荧光强度的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，pbs缓冲液洗3次，用pbs稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μl至96孔酶标板，放入synergytmh4荧光酶标仪检测荧光。激发光485nm，吸收光528nm，检测荧光。3、培养基：lb培养基(g.l-1)：胰蛋白胨10，nacl10，酵母提取物5，ph7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20。4、枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落枯草芽孢杆菌168接种至2ml的spi培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μl，接种至5mlspi培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测od600。当od600约为1.0时，移取200μl菌液转接至2ml的spii培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μll00×egta溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后，每l.5ml离心管分装500μl；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μl均匀涂相应的选择性平板，37℃培养12-14h。实施例1：不同sigma亚基识别单启动子的克隆和表征选择prpob、psuca、pmtnk、pylbp、pylxm和pyyde六个siga亚基识别的启动子，pspovg、ppspovs、pspo0m和pminc四个sigh亚基识别的启动子和psigw、pydbs、pyobj、pyqez、pythp和pyuaf六个sigw识别的启动子(单启动子序列信息见表1)进行试验。克隆的启动子核心区包括以上启动子的-10区、-35区和转录起始位点(tss)共70bp。待筛选和鉴定的启动子序列被设计在引物上(见表2)，通过全质粒pcr的方法将启动子序列引入载体骨架pb-sfgfp，之后通过dpni消化、纯化和组装、转化构建出克隆的带有含单启动子sfgfp表达质粒。将表达单启动子的质粒转化至枯草芽孢杆菌168菌株中，获得的重组枯草芽孢杆菌在lb培养基中，37℃，200rpm下培养24h以检测sfgfp的表达水平，通过sfgfp的荧光信号高低判断启动子活性的高低。结果如图1和表3所示，在siga识别的启动子中，prpob启动子活性最高，sigh识别的启动子中，pspovg活性最高；sigw识别的启动子中，psigw活性最高(图1)。表1单启动子序列信息注：划单线处为启动子-35区，划双线处为启动子-10区。表2单启动子克隆引物表3带有含单启动子sfgfp表达质粒的重组菌培养24h后的总荧光强度启动子荧光强度(a.u.)prpob83184psuca49832pmtnk3840pylbp39028pylxm2090pyyde13844pspovg58281pspovs53313pspo0m1188pminc40567psigw17181pydbs11706pyobj12667pyqez13120pythp4734pyuaf12260实施例2：串联启动子的构建和表征将prpob、pspovg和psigw进行串联设计，用表5中的引物以实施例1中构建的带有启动子prpob、pspovg和psigw的三种质粒作为模板做全质粒pcr构建含串联启动子并表达sfgfp的质粒，将串联启动子按照串联核心区的类型和顺序命名，得到双串联启动子pah、paw、pha、phw、paw和pwa，三串联启动子pahw、pawh、phaw、phwa、pwah和pwha(双串联和三串联启动子序列信息见表4，构建引物见表5)。将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，获得的重组枯草芽孢杆菌在lb培养基中，37℃，200rpm下培养，6h、12h、24h后检测荧光信号，通过sfgfp的荧光信号高低判断启动子活性的高低。表4双串联和三串联启动子序列信息表5串联启动子构建引物表6带有含双串联和三串联启动子sfgfp表达质粒的重组菌培养后的总荧光强度带有含双串联和三串联启动子sfgfp表达质粒的重组菌培养6、12、24h后的荧光强度见图2和表6，双串联启动子和三串联启动子的活性较单启动子大部分都体现出了不同程度的提高，并且三串联启动子大部分活性高于双串联启动子，其中pwha启动子质粒转化枯草芽孢杆菌不成功。选择双串联启动子中活性较高的pah、三串联启动子中活性较高的的pwah和pawh作为下一步改造材料。实施例3：串联启动子间隔序列优化在启动子核心区之间插入不同长度的间隔序列(图3a)，将间隔序列长度设定为15bp、30bp、45b、60bp、75bp和90bp(插入间隔序列的启动子序列见表7)。将seqidno.29-seqidno.59所示的启动子序列分别克隆在pb-sfgfp载体上，之后将重组质粒转化枯草芽孢杆菌168进行检测，获得的重组枯草芽孢杆菌在lb培养基中，37℃，200rpm下培养24h后检测荧光信号，通过sfgfp的荧光信号高低判断启动子活性的高低。结果显示，如paw-d60、pah-d75荧光强度比改造前的paw(荧光强度为20262a.u/od600)分别提高了0.94倍、1.03倍；pwah-d45、pwah-d75荧光强度(18245a.u./od600)比改造前的pwah(荧光强度为10261a.u/od600)分别提高了0.87倍、0.96倍；pawh-d30、pwah-d90荧光强度比改造前的pawh(荧光强度为16879a.u/od600)分别提高了0.78倍、0.78倍。(图3b、3c和3d；表8)。结果说明，在串联的核心区之间插入合适长度的间隔序列可以有效进一步提升串联启动子的活性。表7插入间隔序列的启动子序列表8含插入间隔序列的双串联和三串联启动子的重组质粒的重组菌培养24h后的荧光强度启动子荧光强度(a.u./od600)pah20262pah-d1532865pah-d3033033pah-d4534869pah-d6039476pah-d7541154pah-d9028592pwah18245pwah-u1518278pwah-u3018553pwah-u4517198pwah-u6018161pwah-u7519295pwah-u9018419pwah-d1524711pwah-d3025307pwah-d4534100pwah-d6032029pwah-d7535819pwah-d9024355pawh16879pawh-u1516707pawh-u3015762pawh-u4516157pawh-u6015852pawh-u7516770pawh-u9018045pawh-d1527627pawh-d3030084pawh-d4528409pawh-d6025195pawh-d7526580pawh-d9029999pawh-du3024562实施例4：启动子和rbs兼容性研究将实施例1和实施例3中的启动子prpob、pspovg、psigw、pah-d75、pwah-d75和pawh-d30与13个rbs分别进行组合。将13种rbs序列(见表9)分别克隆在含有串联启动子的载体上，之后将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌168，获得的重组枯草芽孢杆菌在lb培养基中，37℃，200rpm下培养24h后检测荧光信号，通过sfgfp的荧光信号高低判断调控元件活性的高低。之后对不同组合的rbs理论强度和实际测定的荧光值进行相关性分析，以r值评价相关性。结果如图4所示，单启动子propb和rbs组合设计的相关性不高，而串联启动子和rbs组合之后的相关性均高于单启动子propb和rbs的组合。说明串联启动子设计rbs可以提高启动子和rbs元件组合使用的兼容性，即增强了表达外源蛋白时的可设计性和可预测性。如表10所示，将pah-d75与rbs11(seqidno.70)组合时，荧光强度可达76216a.u/od600，比pah-d75提高了0.85倍；将pwah-d75与rbs13(seqidno.72)组合时，荧光强度可达77751a.u/od600，比pwah-d75提高了1.17倍；将pawh-d30与rbs13(seqidno.72)组合时，荧光强度可达73781a.u/od600，比pawh-d30提高了1.45倍.。说明串联启动子设计rbs还可以增强目的基因的表达。表9rbs1-13序列名称序列rbs1(seqidno.60)tcgaacatcatatttaaagtgccgctacaccacatrbs2(seqidno.61)tcgaacatcatatttaaagtcggagtactccacatrbs3(seqidno.62)tcgaacatcatatttaaagtaggttcgttccacatrbs4(seqidno.63)tcgaacatcatatttaaagtaaaggttacccacatrbs5(seqidno.64)tcgaacatcatatttaaagtacgaggagtccacatrbs6(seqidno.65)tcgaacatcatatttaaagtaataggagtccacatrbs7(seqidno.66)tcgaacatcatatttaaagtcgaggtaaaccacatrbs8(seqidno.67)tcgaacatcatatttaaagtaaaggagtcccacatrbs9(seqidno.68)tcgaacatcatatttaaagtagaggagggccacatrbs10(seqidno.69)tcgaacatcatatttaaagtaaggaggttccacatrbs11(seqidno.70)tcgaacatcatatttaaagtacaggaggtccacatrbs12(seqidno.71)tcgaacatcatatttaaagtcaaggaggtccacatrbs13(seqidno.72)tcgaacatcatatttaaagtaaaggaggtccacat注：划线处为rbs核心区。表10启动子分别组合rbs1-13后的翻译起始效率和荧光强度虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种构建高效枯草芽孢杆菌启动子的方法<160>110<170>patentinversion3.3<210>1<211>60<212>dna<213>人工合成<400>1aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60<210>2<211>60<212>dna<213>人工合成<400>2gttttttactattttgtgaacaatcaaggtagaatcaaattgcaaacagtggtaaaatat60<210>3<211>60<212>dna<213>人工合成<400>3ttaaaaaatatattgacaactaactaaattacctgttaccatgttcatcaactgataaat60<210>4<211>60<212>dna<213>人工合成<400>4taaagtttaaatatttggattttttaaataaagcgtttacaatatatgtagaaacaacaa60<210>5<211>60<212>dna<213>人工合成<400>5acaagataaaaacttgacagtgtcattaaaaccgtgtaaactaagttatcgtaaagggat60<210>6<211>60<212>dna<213>人工合成<400>6ctcgttttaattgtctctaaaagcagttatgcggtactatcatataaaggtccaatgttt60<210>7<211>60<212>dna<213>人工合成<400>7attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat60<210>8<211>60<212>dna<213>人工合成<400>8atattaaaaagaaaagcaggaatatagcaactccttagtgaatatagtaaaaatggaagg60<210>9<211>60<212>dna<213>人工合成<400>9aggccgagacgaataataggaaaaaagtatgaatcaaacgaatcttttttcctccttctt60<210>10<211>60<212>dna<213>人工合成<400>10ttgagagatgagtaaaaaggattttatctttttttgacgaaatgagtatgttgttgaggt60<210>11<211>60<212>dna<213>人工合成<400>11attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60<210>12<211>60<212>dna<213>人工合成<400>12ctgtatgcttaagaatgaaacctttctgtaaaagagacgtataaataacgacgaaaaaaa60<210>13<211>60<212>dna<213>人工合成<400>13tagtcccgttttatatgaaaccttttttattttagcccgtattaaaagtaaattcagaga60<210>14<211>60<212>dna<213>人工合成<400>14tttatacataaaaaaatgaaacctttgatacatttgttacgtatgaagagaaggcactta60<210>15<211>60<212>dna<213>人工合成<400>15aatattattatggttaaagaaactttttttattctatttcgtagtaaattttggaggtga60<210>16<211>60<212>dna<213>人工合成<400>16tttgtcttaaaattttgaaacttttcccgaggtgtctcgtataaatggtaacggcagccg60<210>17<211>120<212>dna<213>人工合成<400>17aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat120<210>18<211>120<212>dna<213>人工合成<400>18aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120<210>19<211>120<212>dna<213>人工合成<400>19attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120<210>20<211>120<212>dna<213>人工合成<400>20attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120<210>21<211>120<212>dna<213>人工合成<400>21attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120<210>22<211>120<212>dna<213>人工合成<400>22attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat120<210>23<211>180<212>dna<213>人工合成<400>23aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat120attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag180<210>24<211>180<212>dna<213>人工合成<400>24aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat180<210>25<211>180<212>dna<213>人工合成<400>25attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag180<210>26<211>180<212>dna<213>人工合成<400>26attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat180<210>27<211>180<212>dna<213>人工合成<400>27attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat180<210>28<211>180<212>dna<213>人工合成<400>28attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat180<210>29<211>135<212>dna<213>人工合成<400>29aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata120cactaatgcttttat135<210>30<211>150<212>dna<213>人工合成<400>30aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa120atcgtggaattgatacactaatgcttttat150<210>31<211>165<212>dna<213>人工合成<400>31aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60ctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagc120aggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat165<210>32<211>180<212>dna<213>人工合成<400>32aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60tgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaat120attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat180<210>33<211>195<212>dna<213>人工合成<400>33aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60tttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcct120attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata180cactaatgcttttat195<210>34<211>210<212>dna<213>人工合成<400>34aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60agagccgggatcacttttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaatt120gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>35<211>195<212>dna<213>人工合成<400>35attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60gctattatatcataaaagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgt120aaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata180cactaatgcttttat195<210>36<211>210<212>dna<213>人工合成<400>36attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60ttcaaaaaaagaaaggctattatatcataaaagcaaaaaaagtttgactcggtattttaa120ctatgttaatattgtaaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>37<211>225<212>dna<213>人工合成<400>37attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60atgaagtttccgtcgttcaaaaaaagaaaggctattatatcataaaagcaaaaaaagttt120gactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtatattttaaaaacgagc180aggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat225<210>38<211>240<212>dna<213>人工合成<400>38attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60tcgaggaactgttcgatgaagtttccgtcgttcaaaaaaagaaaggctattatatcataa120aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat180attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat240<210>39<211>255<212>dna<213>人工合成<400>39attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60ctgccattgaaaagctcgaggaactgttcgatgaagtttccgtcgttcaaaaaaagaaag120gctattatatcataaaagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgt180aaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata240cactaatgcttttat255<210>40<211>270<212>dna<213>人工合成<400>40attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60agcaaggcgcgccttctgccattgaaaagctcgaggaactgttcgatgaagtttccgtcg120ttcaaaaaaagaaaggctattatatcataaaagcaaaaaaagtttgactcggtattttaa180ctatgttaatattgtaaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa240atcgtggaattgatacactaatgcttttat270<210>41<211>195<212>dna<213>人工合成<400>41attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata180cactaatgcttttat195<210>42<211>210<212>dna<213>人工合成<400>42attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>43<211>225<212>dna<213>人工合成<400>43attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120ctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagc180aggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat225<210>44<211>240<212>dna<213>人工合成<400>44attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120tgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaat180attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat240<210>45<211>255<212>dna<213>人工合成<400>45attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120tttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcct180attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata240cactaatgcttttat255<210>46<211>270<212>dna<213>人工合成<400>46attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag60aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat120agagccgggatcacttttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaatt180gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa240atcgtggaattgatacactaatgcttttat270<210>47<211>195<212>dna<213>人工合成<400>47aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60aaatttgataaacttattttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtataca120tacagaccggtgaagattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata180cactaatgcttttat195<210>48<211>210<212>dna<213>人工合成<400>48aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60tctacaccctgccaaaaatttgataaacttattttataaaaaaattgaaaccttttgaaa120cgaagctcgtatacatacagaccggtgaagattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>49<211>225<212>dna<213>人工合成<400>49aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attcacgaattaccatctacaccctgccaaaaatttgataaacttattttataaaaaaat120tgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaagattttaaaaacgagc180aggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat225<210>50<211>240<212>dna<213>人工合成<400>50aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60atgttaaggtagtttattcacgaattaccatctacaccctgccaaaaatttgataaactt120attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag180attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat240<210>51<211>255<212>dna<213>人工合成<400>51aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60aataattttaaaaatatgttaaggtagtttattcacgaattaccatctacaccctgccaa120aaatttgataaacttattttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtataca180tacagaccggtgaagattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata240cactaatgcttttat255<210>52<211>270<212>dna<213>人工合成<400>52aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60ctgttcagtctgtataataattttaaaaatatgttaaggtagtttattcacgaattacca120tctacaccctgccaaaaatttgataaacttattttataaaaaaattgaaaccttttgaaa180cgaagctcgtatacatacagaccggtgaagattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa240atcgtggaattgatacactaatgcttttat270<210>53<211>195<212>dna<213>人工合成<400>53aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata180cactaatgcttttat195<210>54<211>210<212>dna<213>人工合成<400>54aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>55<211>225<212>dna<213>人工合成<400>55aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120ctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagc180aggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat225<210>56<211>240<212>dna<213>人工合成<400>56aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120tgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcctattttttcaaaaaat180attttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttat240<210>57<211>255<212>dna<213>人工合成<400>57aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120tttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaattgtgtaactatatcct180attttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaaatcgtggaattgata240cactaatgcttttat255<210>58<211>270<212>dna<213>人工合成<400>58aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120agagccgggatcacttttttatttaccttatgcccgaaatgaaagctttatgacctaatt180gtgtaactatatcctattttttcaaaaaatattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa240atcgtggaattgatacactaatgcttttat270<210>59<211>210<212>dna<213>人工合成<400>59aagcaaaaaaagtttgactcggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtat60attttataaaaaaattgaaaccttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaag120tctacaccctgccaaaaatttgataaacttattttaaaaacgagcaggatttcagaaaaa180atcgtggaattgatacactaatgcttttat210<210>60<211>35<212>dna<213>人工合成<400>60tcgaacatcatatttaaagtgccgctacaccacat35<210>61<211>35<212>dna<213>人工合成<400>61tcgaacatcatatttaaagtcggagtactccacat35<210>62<211>35<212>dna<213>人工合成<400>62tcgaacatcatatttaaagtaggttcgttccacat35<210>63<211>35<212>dna<213>人工合成<400>63tcgaacatcatatttaaagtaaaggttacccacat35<210>64<211>35<212>dna<213>人工合成<400>64tcgaacatcatatttaaagtacgaggagtccacat35<210>65<211>35<212>dna<213>人工合成<400>65tcgaacatcatatttaaagtaataggagtccacat35<210>66<211>35<212>dna<213>人工合成<400>66tcgaacatcatatttaaagtaataggagtccacat35<210>67<211>35<212>dna<213>人工合成<400>67tcgaacatcatatttaaagtaaaggagtcccacat35<210>68<211>35<212>dna<213>人工合成<400>68tcgaacatcatatttaaagtagaggagggccacat35<210>69<211>35<212>dna<213>人工合成<400>69tcgaacatcatatttaaagtaaggaggttccacat35<210>70<211>35<212>dna<213>人工合成<400>70tcgaacatcatatttaaagtacaggaggtccacat35<210>71<211>35<212>dna<213>人工合成<400>71tcgaacatcatatttaaagtacaggaggtccacat35<210>72<211>35<212>dna<213>人工合成<400>72tcgaacatcatatttaaagtaaaggaggtccacat35<210>73<211>69<212>dna<213>人工合成<400>73cggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtattcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>74<211>62<212>dna<213>人工合成<400>74acaatattaacatagttaaaataccgagtcaaactttttttgcttacctgccctctgcca60cc62<210>75<211>69<212>dna<213>人工合成<400>75acaatcaaggtagaatcaaattgcaaacagtggtaaaatattcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>76<211>62<212>dna<213>人工合成<400>76ttgcaatttgattctaccttgattgttcacaaaatagtaaaaaacacctgccctctgcca60cc62<210>77<211>69<212>dna<213>人工合成<400>77ttttttaaataaagcgtttacaatatatgtagaaacaacaatcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>78<211>62<212>dna<213>人工合成<400>78atattgtaaacgctttatttaaaaaatccaaatatttaaactttaacctgccctctgcca60cc62<210>79<211>69<212>dna<213>人工合成<400>79gtgtcattaaaaccgtgtaaactaagttatcgtaaagggattcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>80<211>62<212>dna<213>人工合成<400>80cttagtttacacggttttaatgacactgtcaagtttttatcttgtacctgccctctgcca60cc62<210>81<211>69<212>dna<213>人工合成<400>81aaagcagttatgcggtactatcatataaaggtccaatgttttcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>82<211>62<212>dna<213>人工合成<400>82atatgatagtaccgcataactgcttttagagacaattaaaacgagacctgccctctgcca60cc62<210>83<211>69<212>dna<213>人工合成<400>83ctaactaaattacctgttaccatgttcatcaactgataaattcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>84<211>62<212>dna<213>人工合成<400>84aacatggtaacaggtaatttagttagttgtcaatatattttttaaacctgccctctgcca60cc62<210>85<211>69<212>dna<213>人工合成<400>85gattttatctttttttgacgaaatgagtatgttgttgaggttcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>86<211>62<212>dna<213>人工合成<400>86tcatttcgtcaaaaaaagataaaatcctttttactcatctctcaaacctgccctctgcca60cc62<210>87<211>69<212>dna<213>人工合成<400>87tttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttattcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>88<211>62<212>dna<213>人工合成<400>88tatcaattccacgattttttctgaaatcctgctcgtttttaaaatacctgccctctgcca60cc62<210>89<211>69<212>dna<213>人工合成<400>89gaatatagcaactccttagtgaatatagtaaaaatggaaggtcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>90<211>62<212>dna<213>人工合成<400>90atattcactaaggagttgctatattcctgcttttctttttaatatacctgccctctgcca60cc62<210>91<211>69<212>dna<213>人工合成<400>91gaaaaaagtatgaatcaaacgaatcttttttcctccttctttcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>92<211>62<212>dna<213>人工合成<400>92agattcgtttgattcatacttttttcctattattcgtctcggcctacctgccctctgcca60cc62<210>93<211>69<212>dna<213>人工合成<400>93accttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaagtcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>94<211>62<212>dna<213>人工合成<400>94tgtatacgagcttcgtttcaaaaggtttcaatttttttataaaatacctgccctctgcca60cc62<210>95<211>69<212>dna<213>人工合成<400>95acctttctgtaaaagagacgtataaataacgacgaaaaaaatcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>96<211>62<212>dna<213>人工合成<400>96tttatacgtctcttttacagaaaggtttcattcttaagcatacagacctgccctctgcca60cc62<210>97<211>62<212>dna<213>人工合成<400>97tttatacgtctcttttacagaaaggtttcattcttaagcatacagacctgccctctgcca60cc62<210>98<211>62<212>dna<213>人工合成<400>98ttaatacgggctaaaataaaaaaggtttcatataaaacgggactaacctgccctctgcca60cc62<210>99<211>69<212>dna<213>人工合成<400>99aacctttgatacatttgttacgtatgaagagaaggcacttatcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>100<211>62<212>dna<213>人工合成<400>100catacgtaacaaatgtatcaaaggtttcatttttttatgtataaaacctgccctctgcca60cc62<210>101<211>69<212>dna<213>人工合成<400>101aaactttttttattctatttcgtagtaaattttggaggtgatcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>102<211>62<212>dna<213>人工合成<400>102actacgaaatagaataaaaaaagtttctttaaccataataatattacctgccctctgcca60cc62<210>103<211>69<212>dna<213>人工合成<400>103acttttcccgaggtgtctcgtataaatggtaacggcagccgtcgaacatcatatttaaag60tacgaggag69<210>104<211>62<212>dna<213>人工合成<400>104tttatacgagacacctcgggaaaagtttcaaaattttaagacaaaacctgccctctgcca60cc62<210>105<211>66<212>dna<213>人工合成<400>105cggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcagga60tttcag66<210>106<211>66<212>dna<213>人工合成<400>106cggtattttaactatgttaatattgtaaaatgccaatgtatattttaaaaacgagcagga60tttcag66<210>107<211>62<212>dna<213>人工合成<400>107tttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttataagcaaaaaaagtttgact60cg62<210>108<211>73<212>dna<213>人工合成<400>108tttcagaaaaaatcgtggaattgatacactaatgcttttatattttataaaaaaattgaa60accttttgaaacg73<210>109<211>62<212>dna<213>人工合成<400>109accttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaagaagcaaaaaaagtttgact60cg62<210>110<211>66<212>dna<213>人工合成<400>110accttttgaaacgaagctcgtatacatacagaccggtgaagattttaaaaacgagcagga60tttcag66当前第1页12