一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用与流程

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用。

背景技术：

被子植物从双受精形成合子开始到胚胎发育成熟变成种子，这个发育过程先后经历了合子激活，细胞的分裂分化、极性的建立、模式的形成和器官的形成等，并且胚胎的发育是受到精确的遗传调控的。受精前的卵细胞在代谢上相对静止，只有在与精细胞融合之后，才能被激活从而启动胚胎发育的过程(蒋丽等，2007)。体细胞胚的起始却与此不同，植物体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)是指植物体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性的合子胚胎发生而发育形成一个新个体的形态发生过程，它不需要经过双受精的过程，可以由体细胞直接发育而来，但这个过程可能需要特定的培养条件、激素环境、或者是分子调控等因子作为起始信号。除胡萝卜体细胞胚的诱导外，很多植物的小孢子可以去分化并经胚胎发生途径形成单倍体植株，这一过程称为花粉胚胎发生。当小孢子受到饥饿或高温等外界环境胁迫时，配子体发育就会停滞，新的发育模式形成，此时将小孢子转移到正常环境，它会持续分裂，最终形成体细胞胚(touraevandheberle-bors,1999)。20世纪90年代起，拟南芥体细胞胚胎发生体系已经开始建立并随后逐步完善。拟南芥叶片原生质体能够诱导体细胞胚的产生，但是在球形胚早期体细胞胚的发育终止(luoandkoop,1997；o’neillandmathias,1993)。sangwan(1992)和wu(1992)等报道了以未成熟合子胚作为外植体首先诱导胚性愈伤组织的产生，进而诱导体细胞胚胎发生(sangwanetal.,1992；wuetal.,1992)。在这个系统中，从合子胚诱导获得的体细胞胚可以发育成为完整植株，而合子胚外植体的发育时期对于诱导愈伤组织的形成和体细胞胚胎发生至关重要(wuetal.,1992)。2002年，ikeda-iwai等人又修改了上述培养体系(ikeda-iwaietal.,2002)。在新体系中，合子胚外植体首先诱导产生初级体细胞胚，然后在液体培养基中悬浮培养产生胚性细胞团，进而诱导产生次级体细胞胚。这种液体培养系统不仅提高了胚性细胞的增殖速率，还增加了次级体细胞胚的数量。

一般而言，体细胞胚的产生需要激素的诱导，通常利用生长素或细胞分裂素来诱导。依此而论，体细胞胚的发生需要经过两个过程：首先，是在生长素的作用下获得形成体细胞胚的能力；其次，是去除生长素后体细胞胚的形成。当然，还存在另一条诱导体细胞胚的途径，就是通过异位表达特定的拟南芥基因来诱导体细胞胚的发生。在拟南芥中，leafycotyledon(lec)基因家族的lec1、lec2、fusca3(fus3)在胚胎的发生过程中具有重要的作用，它们突变体的表型均为子叶具有真叶的特征。lec1特异的在胚胎中表达，过表达lec1致使幼苗仍保持胚胎特性，如：子叶无法张开，根也无法伸长，在茎端分生组织处形成类似胚胎的结构等(lotanetal.,1998)。lec2和fus3是viviparous1/abscisicacidinsensitive3-likeb3(vp1/abi3-likeb3)家族的转录因子(luerssenetal.,1998；stoneetal.,2001)，通过蛋白序列比对可知，lec2和fus3具有43％的同源性。异位表达lec2基因可以促进体细胞胚的发生，致使体细胞向胚性细胞发生转变(stoneetal.,2001)。植物通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极其普遍的现象。

早在60年前，体细胞胚胎发生技术在胡萝卜上就取得了重大进展，使其达到商业化水平。体细胞胚发生技术是一种无性繁殖技术，能使少量的优质种子得以扩繁。现在，人们正致力于运用此项技术大规模繁殖珍稀植物物种，体细胞胚发生不再仅仅被看作是研究植物全能性和形态发生基本过程的实验室技术，而被看作是用于植物优良基因型大规模繁殖的一种方法。体细胞胚发生途径也是林木树种转基因的一个有效的再生体系，未来体细胞胚发生技术有可能使许多林木和园艺植物的优良基因型达到商业化繁殖水平。另外，体细胞胚发生途径还是木本植物基因工程的一种重要转化体系。体细胞胚的诱导和发生也是制备人工种子的基础。体细胞胚的干化及用海藻酸钠等材料包裹体细胞胚制成人工种子，为选择基因型的廉价无性繁殖及无病毒无性系的贮存和生产提供了可能。还可以利用体细胞胚的特点，采用超低温保存及干化处理方法保存优质种质资源。总而言之，这一发育途径为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等提供了良好的实验体系，在理论上和应用中都具重大意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够促进植物体细胞胚发生的功能基因rid3(at3g49180)和yuc10(at1g48910)。通过异位表达上述功能基因，不经过愈伤组织，能够直接在拟南芥子叶上诱导形成体细胞胚。本发明的诱导体细胞胚直接发生的方法，具有培养简易、诱导周期短、诱导频率高等优势，可用于植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等方面的研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供促进植物体细胞胚发生的功能基因，是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如seqidno.1所示；

2)其核苷酸序列如seqidno.3所示；

3)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因；

4)由seqidno.4所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

本发明的第二方面，提供携带上述功能基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

携带上述功能基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进植物体细胞胚发生中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供如下a)-f)中任一项所述的dna片段在促进植物体细胞胚发生中的应用；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)seqidno.3所示的dna片段；

e)编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna片段；

f)dna片段，与d)或e)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.4所示的蛋白等价。

上述应用中，通过上调a)-f)中任一项所述的dna片段的表达，以促进植物体细胞胚的直接发生。

本发明的第四方面，提供如下1)-6)中任一项所述的蛋白在促进植物体细胞胚发生中的应用；

1)氨基酸序列是seqidno.2所示的蛋白；

2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在seqidno.2所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；

4)氨基酸序列是seqidno.4所示的蛋白；

5)将seqidno.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

6)在seqidno.4所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白。

上述应用中，通过上调1)-6)中任一项所述的蛋白的表达量和/或活性，以促进植物体细胞胚的直接发生。

本发明的第五方面，提供一种诱导体细胞胚直接发生的方法，包括以下步骤：

将上述a)-f)中任一项所述的dna片段导入到出发植株中，筛选出转基因阳性植株后进行体细胞胚的诱导培养，直接生成体细胞胚。

作为优选，所述诱导培养的方法为：将转基因阳性植株的种子置于含有雌二醇的1/2ms培养基上，春化处理打破休眠，春化结束后进行光照培养；种子萌发后4-6天，将幼苗移至新的含有雌二醇的1/2ms培养基上，继续培养至在幼苗的子叶上生成体细胞胚。

更优选的，所述1/2ms培养基中含有雌二醇的浓度为10μmol/ml。

更优选的，所述春化处理的条件为：4℃春化处理3天。

本发明的第六方面，提供一种人工种子的生产方法，将上述a)-f)中任一项所述的dna片段导入到植物细胞、组织、器官或植株中，获得体细胞胚，利用获得的体细胞胚生产人工种子。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种在拟南芥子叶上不经过愈伤组织直接诱导产生体细胞胚的培养体系：分别异位表达rid3和yuc10，无需添加外源的植物激素，只需要在基本的培养基上培养，就能够在转基因植株的子叶上诱导形成体细胞胚。该体系具有操作简单，培养程序简易，培养周期短，发生频率高的优势，由于体细胞胚发生体系较为稳定，可以在分子水平上研究其胚胎发生的机制。且对于与生产结合进行规模化种苗生产也具有指导意义。

附图说明

图1为植物表达载体per8::rid3载体结构图。

图2为诱导培养per8::rid3转基因植株，体细胞胚起始发育示意图，pserk1::gfp在体胚中的表达模式及prid3::gus在合子胚中表达模式。

图a第一张图为诱导培养的per8::rid3转基因幼苗，红色虚线所圈为子叶叶尖凹陷的致密细胞；第二张图为诱导培养10天左右的幼苗，红色区域所示为多细胞球形体细胞胚；第三张图为诱导培养14天的幼苗，红色区域所示为成熟的体细胞胚。

图b为pserk1::gfp在体胚中的表达模式。

图c为prid3::gus在合子胚中表达模式。

图3为扫描电镜观察per8::rid3转基因植株体细胞胚的单细胞起始及发育过程。

图4植物表达载体per8::yuc10载体结构图。

图5为诱导培养per8::yuc10转基因植株，体细胞胚起始发育示意图，pserk1::gfp在体胚中的表达模式及pyuc10::gfp在合子胚中表达模式。

图a第一张图为诱导培养的per8::yuc10转基因幼苗；第二张图为诱导培养10天左右的幼苗，红色区域所示为多细胞球形体细胞胚；第三张图为诱导培养14天的幼苗，红色区域所示为成熟的体细胞胚。

图b为pserk1::gfp在体胚中的表达模式。

图c为pyuc10::gfp在合子胚中表达模式。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，体细胞胚的发生技术具有广泛的应用。植物体细胞胚的发生是一个复杂而有序的过程，很多基因特异的在体细胞胚中表达，发现调控体细胞胚发生的关键基因并进行遗传操作，是促进体细胞胚发生的一条行之有效的途径。但技术的难点在于如何从众多的基因中找到与体细胞胚发生相关的关键基因。

本发明人通过大量的工作，发现了能促进植物体细胞胚发生的功能基因rid3(at3g49180)和yuc10(at1g48910)，其中，基因rid3编码wd40重复类亚家族蛋白，其核酸序列如sedidno.1所示，该基因编码区全长为1317bp，氨基酸序列如sedidno.2所示，编码438个氨基酸。基因yuc10编码一个生长素合成关键酶，其核酸序列如sedidno.3所示，该基因全长为2124bp，氨基酸序列如sedidno.4所示，编码383个氨基酸。本发明研究发现，rid3和yuc10两个基因分别过量表达可以较高效率的诱导体细胞胚的直接发生。

基于发现的上述rid3和yuc10两个功能基因，本发明的保护内容还包括与上述两个功能基因同源的dna片段，只要它们编码的蛋白与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白功能等价。本文所指的“与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白功能等价”意味着目标dna片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白相同或相近。seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白典型的生物学功能是促进植物体细胞胚的发生。通过上调seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白的表达量和/或活性，可以高效率的诱导体细胞胚的直接发生。

这些与rid3和yuc10两个功能基因同源的dna片段包括本发明核苷酸序列(seqidno.1和seqidno.3)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的rid3和yuc10两个功能基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明rid3和yuc10两个功能基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明seqidno.1和seqidno.3所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用blast算法测定(altschuletal.1990.journalofmolecularbiology215:403-410；karlinandaltschul.1993.proceedingsofthenationalacademyofsciences90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述rid3和yuc10两个功能基因是从拟南芥幼苗cdna中扩增获得，其具体步骤如下：

1.拟南芥幼苗rna的提取和纯化。

2.cdna第一链的合成。

3.rid3基因的克隆：

以反转录的cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-gggtcgacatggagattactgtaatcgcttc-3'，如seqidno.5所示；

下游引物:5'-gcactagttcaattggtaccaccgatttgttc-3'，如seqidno.6所示。

其中划横线部分依次为salⅰ，speⅰ酶切位点。

4.yuc10基因的克隆：

以反转录的cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggactagtcaagaaatggagaccgtagtggtga-3'，如seqidno.7所示；

下游引物:5'-gctctagatcttgcaggttaatgaatacagcttcaa-3'，如seqidno.8所示。

其中划横线部分依次为speⅰ，xbaⅰ酶切位点。

pcr扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μl)，2μl下游引物(5μmol/μl)，5μl10×pcrbuffer，2μldntp混合液(2.5mm)，0.25μltaqdna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μlpcr产物与peasy-blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养，进行序列测定。选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒dna。

获得上述的目标基因后，将目的片段转入由雌二醇(17-β-estradiol)诱导的诱导型表达载体per8中，获得诱导型的per8::rid3(载体图谱见图1)，per8::yuc10(载体图谱见图4)，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。

为了后期验证胚状体结构的遗传学属性及rid3和yuc10基因的功能，需要分析合子激活基因serk1在体细胞胚中的表达，以及rid3和yuc10基因各自在合子胚中的表达。发明人又分别构建了以serk1和yuc10启动子连接gfp报告基因的pserk1::gfp，pyuc10::gfp，rid3启动子连接gus报告基因的prid3::gus表达载体。serk1启动子序列如sedidno.9所示，该序列全长为5130bp。rid3启动子序列如sedidno.10所示，该序列全长为2634bp。yuc10启动子序列如sedidno.11所示，该序列全长为2667bp。

该类启动子序列从拟南芥幼苗基因组dna中扩增获得，其具体步骤如下：

1拟南芥幼苗dna的提取和纯化。

2serk1基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggaagcttgcttccaaaggatctatgtggcg-3'，如seqidno.12所示；

下游引物:5'-gcggatccccacataactcgactccatttc-3'，如seqidno.13所示。

其中划横线部分依次为hindiii，bamhi酶切位点。

3rid3基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggatcgatctccttctccgcctcatcattc-3'，如seqidno.14所示；

下游引物:5'-gctctagaatagctcagagaaagagggaagtaaa-3'，如seqidno.15所示。

其中划横线部分依次为clai，xbai酶切位点。

4yuc10基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggaagcttccgccactgagttgtgcttg-3'如seqidno.16所示；

下游引物:5'-gcctcgagcactacggtctccatttcttgtgtttag-3'如seqidno.17所示。

其中划横线部分依次为hindiii，xhoi酶切位点。

pcr扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μl)，2μl下游引物(5μmol/μl)，5μl10×pcrbuffer，2μldntp混合液(2.5mm)，0.25μltaqdna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μlpcr产物与peasy-blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养，进行序列测定。选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒dna。

获得上述的目标基因后，分别将serk1，yuc10的启动子片段转入表达载体prokii-gfp中，获得pserk1::gfp，pyuc10::gfp表达载体，将rid3的启动子片段转入表达载体pbi121-gus中，获得prid3::gus表达载体，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。最后利用农杆菌介导转化col生态型拟南芥花序，并最终筛选获得了具有抗性的植株。另外将分别含有per8::rid3和per8::yuc10侵染pserk1::gfp的转基因阳性植株，最后获取具有抗性的植株。将分别含有per8::rid3和per8::yuc10的转基因的种子置于含有10μmol/ml雌二醇的1/2ms萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠；春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16小时光照和8小时黑暗)；种子萌发后5天左右可以观察到子叶叶尖呈凹陷状，细胞致密且颜色较周围细胞浅；将幼苗移至新的含有10μmol/ml雌二醇的1/2ms培养基上继续培养，培养至14天左右，可以观察到在幼苗的子叶上长出了类似于胚状体的结构(图2，图5)。为了证明该结构为体细胞胚，将含有per8::rid3和per8::yuc10的pserk1::gfp的转基因阳性植株的种子置于含有10μmol/ml雌二醇的1/2ms萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠；春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16小时光照和8小时黑暗)；种子萌发后48小时左右可以观察serk1的表达模式，之后依次按培养时间顺序(72小时，96小时及120小时)进行观察。研究证明该结构为体细胞胚，并且为单细胞起始(图2，图5)。同时利用扫描电镜技术细致观察了per8::rid3培养材料上体细胞胚的起始与发育过程，也证实了体细胞胚的单细胞起始，具有完整的子叶，胚轴(图3)。rid3基因诱导体细胞胚发生的频率为48％(图2)，yuc10基因诱导体细胞胚发生的频率为27％(图5)。另外，发明人观察了prid3::gus及pyuc10::gfp在合子胚中的表达，结果显示，rid和yuc10能够特异的在合子胚中表达(图3，图5)，表明rid3和yuc10基因能够调控合子胚的发育。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1:rid3和yuc10基因克隆及植物表达载体构建

1.1拟南芥组织总rna的提取

利用trizol试剂盒提取植物材料的总rna，操作步骤如下：

(1)在离心管中加入1ml的trizol试剂；

(2)去除细胞壁残渣、蛋白、多糖、及脂肪：将约0.1g的植物材料于液氮中研磨，将粉末转至离心管中，振荡器混匀，室温下静置5min，随后12000rpm，4℃，离心10min；

(3)分相：将上清转入新的离心管中，加入200μl的氯仿，剧烈摇晃15s，随后室温静置2-3min，12000rpm，4℃，离心15min；

(4)沉淀、去多糖：将无色水相(约600μl)转入新的离心管中(切不要吸到中间层)，加入250μl异丙醇和250μl高盐溶液，上下颠倒混匀，15-30℃静置10min，12000rpm，4℃，离心10min；

高盐溶液的配方：0.8mol/l柠檬酸钠和1.2mol/l氯化钠等体积混合溶解，depc水处理后高温灭菌；

(5)清洗：用200μl的枪将多余上清吸除，随后加入1ml冰预冷的75％乙醇，震荡混匀，7500rpm，4℃，离心5min；

(6)用真空泵干燥，吸除乙醇，37℃，10min，不要干燥彻底，否则溶解困难；

(7)加适量的rnaase-free的水(一般20μl)，枪打溶解，也可置于55-60℃溶解10min，然后迅速冰浴5min，稍离心，-80℃保存即可。

为确保rna质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的rna样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：rna纯度为od260/280和od260/230均在1.8-2.0范围内，rna浓度在1.0-2.0μg/μl范围内。

1.2反转录cdna第一链的合成

在0.2mldepc处理的离心管中顺序加入1μl50μmoligodtprimer和15.5μl总rna，70℃变性6分钟，迅速冰浴10分钟。在上述离心管中顺序加入2μldntpmixture(10mm)，5μl5×primerscriptbuffer，0.5μlrnaseinhibitor(40u)，1μlprimerscriptrtase(200u)，加depc-h2o至25μl。在pcr仪上运行程序为25℃，10分钟；42℃，90分钟；95℃，5分钟。程序结束后，样品于-80℃冻存待用。

1.3rid3和yuc10基因的克隆

rid3基因的克隆：

以反转录的cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-gggtcgacatggagattactgtaatcgcttc-3'；(seqidno.5)

下游引物:5'-gcactagttcaattggtaccaccgatttgttc-3'；(seqidno.6)。

其中划横线部分依次为salⅰ，speⅰ酶切位点。

yuc10基因的克隆：

以反转录的cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggactagtcaagaaatggagaccgtagtggtga-3'，如seqidno.7所示；

下游引物:5'-gctctagatcttgcaggttaatgaatacagcttcaa-3'，如seqidno.8所示。

其中划横线部分依次为speⅰ，xbaⅰ酶切位点。

pcr扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μl)，2μl下游引物(5μmol/μl)，5μl10×pcrbuffer，2μldntp混合液(2.5mm)，0.25μltaqdna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μlpcr产物与peasy-blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养，然后进行序列测定，选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒dna。

1.4植物表达载体的构建

获得上述的目标基因后，将目的片段转入由雌二醇(17-β-estradiol)诱导的诱导型表达载体per8中，获得诱导型的per8::rid3，per8::yuc10，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施例2:serk1、rid3及yuc10启动子的克隆及植物表达载体的构建

2.1植物基因组dna的提取

采用小量法提取拟南芥的基因组dna。提取方法如下：

(1)取新鲜的植物叶片，于液氮中研磨成粉末；

(2)加入500μldna提取液，振荡混匀，置于60℃水浴中2min；

(3)取出后向离心管中加入500μl苯酚，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(4)取上清，转入新的1.5ml离心管中，加入500μl苯酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(5)取上清，转入新的离心管中，加入500μl氯仿，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(6)将上清转入新的离心管中，加入30μlnaac(ph＝5.4，3mol/l)和350μl异丙醇，颠倒混匀，12000rpm，离心5min(此步骤不可过分剧烈，以防基因组dna断裂)；

(7)弃上清，70％乙醇清洗沉淀，12000rpm，离心1min；

(8)重复步骤7的操作，然后用真空泵去除乙醇，不可过分干燥，否则沉淀极难溶解；

(9)30-50μlddh2o回溶沉淀(提前预热ddh2o帮助dna溶解)。取3μl电泳检测。若电泳条带清晰，则证明提取的基因组dna未降解。

2.2植物基因组dna的纯化

(1)用500μl的te回溶沉淀，并加入5μlrnasea，37℃处理1-2h；

(2)取少量dna跑电泳，检测rna是否除尽。如果已除尽，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀，室温8000-10000rpm离心5min；

(3)将上清转入新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿，混匀，8000-10000rpm离心5min；

(4)将上清液转入新的1.5ml离心管，加入1/10体积的naac(ph＝5.2，3mol/l)和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h；12000rpm离心10min；

(5)弃上清，70％乙醇漂洗沉淀；

(6)重复步骤5后，37℃烘干；

(7)用20-50μlddh2o溶解沉淀。

2.3serk1、rid3及yuc10启动子的克隆

serk1基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggaagcttgcttccaaaggatctatgtggcg-3'；(seqidno.12

下游引物:5'-gcggatccccacataactcgactccatttc-3'；(seqidno.13)。

其中划横线部分依次为hindiii，bamhi酶切位点。

rid3基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggatcgatctccttctccgcctcatcattc-3'；(seqidno.14)；

下游引物:5'-gctctagaatagctcagagaaagagggaagtaaa-3'；(seqidno.15)。

其中划横线部分依次为clai，xbai酶切位点。

yuc10基因启动子的克隆：

以dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-ggaagcttccgccactgagttgtgcttg-3'；(seqidno.16)；

下游引物:5'-gcctcgagcactacggtctccatttcttgtgtttag-3'；(seqidno.17)。

其中划横线部分依次为hindiii，xhoi酶切位点。

pcr扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μl)，2μl下游引物(5μmol/μl)，5μl10×pcrbuffer，2μldntp混合液(2.5mm)，0.25μltaqdna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μlpcr产物与peasy-blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养，然后进行序列测定，选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒dna。

2.4植物表达载体的构建

获得上述的目的片段后，分别将serk1、yuc10的启动子片段转入表达载体prokii-gfp中，获得pserk1::gfp、pyuc10::gfp表达载体，将rid3的启动子片段转入表达载体pbi121-gus中，获得prid3::gus表达载体，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施例3：农杆菌介导的拟南芥花序的转化及抗性植株的获得

拟南芥的转化步骤如下：

(1)农杆菌的准备应在转化前一天进行，用100ml加相应抗生素的培养液活化农杆菌。第二天上午即可转化拟南芥；

(2)配置浸染液：5％蔗糖溶于ddh2o中，加入0.03-0.05％silwetl-77；

(3)5000-6000rpm离心5-8min，弃上清液，收集菌体；

(4)用侵染液悬浮菌体；

(5)将拟南芥的花序浸泡至侵染液中轻轻震荡约30s；

(6)然后将拟南芥横置于纸箱子中，覆膜，黑暗放置一天；

(7)第二天放回光照条件下继续生长。

根据植株的长势，隔5-7天可浸染一次，浸染3次后的拟南芥植株正常生长，收种子。种子经消毒处理后，均匀铺在含筛选标记的潮霉素抗性培养基上，选取具有抗性的幼苗转入育苗盆中继续培养。

实施例4：阳性转基因植株的诱导培养

拟南芥的萌发与培养过程如下：

(1)将种子先用70％的酒精浸泡消毒5min后，再使用2.6％的naclo浸泡消毒10min，最后用灭菌的0.1‰tweenddh2o清洗6-8遍，均匀平铺于含有10μmol/ml雌二醇的1/2ms萌发培养基上；

(2)4℃春化处理3天打破休眠；

(3)春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16h光照和8h黑暗)；

(4)种子萌发后5天左右，将幼苗移至新的含有10μmol/ml雌二醇的1/2ms培养基上继续培养；

(5)培养至14天左右，可以观察到在幼苗的子叶上长出了类似于胚状体的结构，进行发生频率的统计。

(6)利用遗传分子标记pserk1::gfp对培养72小时，96小时及120小时的幼苗的子叶进行观察，证实该胚状体结构的遗传学属性。

实施例5：启动子连接gfp报告基因的共聚焦显微镜观察和图像处理

分别带有pserk1::gfp标记的诱导型的per8::rid3和per8::yuc10，以及pyuc10::gfp的转基因材料均在leicadm6000cs型共聚焦激光扫描显微镜中观察。发出gfp绿色荧光的材料用488nmargonion激光激发，叶绿素的自发荧光用大于bp650的滤光片检测信号，激发光同gfp的激发波长。图像先经lsm5imagebrowser(leica)处理，输出为jpeg图像后，用adobephotoshope6.0处理。

实施例6：启动子连接gus报告基因的染色分析

具体操作如下：将需要染色的带有prid3::gus标记的拟南芥不同发育阶段的角果沿腹缝线剖开，露出胚珠，然后在90％丙酮中冰浴固定15～20分钟；用不含x-gluc的缓冲液漂洗2～3遍，每遍5分钟；加入gus染色液，真空抽气两次，各10分钟。37℃反应，时间20分钟到10小时不等(根据实际组织着色情况而定)；染色结束后需停止反应。用70％乙醇脱色，制成临时装片，利用olympusbh-2荧光显微镜观察胚胎的染色情况。

实施例7：扫描电子显微镜观察

具体操作步骤如下：

(1)将诱导培养不同时间段的per8::rid3子叶胚性化的叶尖切下放入预冷的4％戊二醛固定液中，抽气，4℃放置过夜。

(2)在缓冲液中短暂清洗后,经10％、30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％系列乙醇脱水，每级1小时。

(3)用乙酸异戊酯置换材料中的乙醇，具体作法是：100％乙醇、75％乙醇-25％乙酸异戊酯、50％乙醇-50％乙酸异戊酯、25％乙醇-75％乙酸异戊酯、100％乙酸异戊酯、100％乙酸异戊酯，每级30分钟。

(4)用hitachihcp-2二氧化碳临界点干燥器进行干燥。

(5)干燥后的材料，用导电胶将其固定在金属台上喷金。

(6)最后将金属台置于扫描电镜的观察室中，用hitachi800扫描电镜观察并采集照片。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用

<130>2018

<160>17

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1317

<212>dna

<213>rid3基因

<400>1

atggagattactgtaatcgcttcttcctcaatcgatgaaggaattggaagttgggatctc60

aaaaccgggacagagcagcttcaattcaagccgtgtgcttctccggcgcatggtctcacc120

gccgtcggcgaaaaatttctcgcctcctctcagctctcggcgagaaatacttctggctcg180

attttttactggtcttggactaagcctcaagctgaagtgaagagctacccagtggaacca240

ataaaggctcttgcagcaaacaatgaaggaacttacttagttggtggtggaatctctgga300

gatatttacctttgggaggttgcgactgggaagttgcttaagaagtggcatggtcattat360

cgttcagtaacatgtttggtgttctctggagatgattctttgttggtttctggatctcaa420

gatgggtctattagagtttggtctcttataaggctatttgatgatttccagaggcagcaa480

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gtttggagcttgtcaagagggaaattgttgaaaaatatcatttttccttcagtcatcaat660

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tatatcggtgccattaatgccacaagtgaatacgggacacaagttcttggttcagtatct780

gaaaaaggcaaagctattacttgcttagcatattgtgcagacggaaaccttttgatatct840

ggatcagaagatggtgtggtttgtgtttgggatcccaaatcacttcgccatgttcgtact900

ctcatccatgcaaaaggttctagaaaaggtcctgtgaacaatattcaaattgttagaaaa960

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tatgagaatttgcttcaagtggttatggaagaagaacaaatcggtggtaccaattga1317

<210>2

<211>438

<212>prt

<213>rid3基因编码蛋白

<400>2

metgluilethrvalilealaserserserileaspgluglyilegly

151015

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202530

alaserproalahisglyleuthralavalglyglulyspheleuala

354045

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505560

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65707580

ilelysalaleualaalaasnasngluglythrtyrleuvalglygly

859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

tyrileglyalaileasnalathrserglutyrglythrglnvalleu

245250255

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275280285

valtrpaspprolysserleuarghisvalargthrleuilehisala

290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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435

<210>3

<211>2124

<212>dna

<213>yuc10基因

<400>3

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<210>4

<211>383

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<213>yuc10基因编码蛋白

<400>4

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<210>5

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<212>dna

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<212>dna

<213>serk1启动子

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