玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用与流程

本发明属于玉米抗性基因技术领域，具体涉及一种玉米zm-apx基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用。

背景技术：

玉米是世界上最为广泛栽培的粮食作物之一。一方面，玉米为人类和动物提供了大量的食物来源，但另一方面，玉米病害的发生可导致巨大的经济损失。尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性，同时，造成的药物残留对人类的生命安全也有潜在的威胁。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。

玉米弯孢叶斑病又称拟眼斑病、黑霉病，该病害在我国主要是由新月弯孢(curvularialunata)引起。玉米弯孢叶斑病是典型的叶部病害，致病菌通过在病残体、秸秆上过冬，病原菌借助风、水、机械及昆虫等进行传播，引起植株发病。自上世纪80年代，随着我国栽培制度和气候的变化，该病害在我国个玉米主产区逐步流行，并引起过严重的产量损失。尽管近年来由于推广抗性品种，该病害得到一定控制，但由于该病原菌存在着明显的致病力分化现象，且我国玉米种质资源遗传基础狭窄，抗性资源趋同性严重，因此再次爆发该病害的风险性较大。

特定基因是鉴定植物抗性的有效手段，但是目前尚未发现可以有效鉴定玉米弯孢叶斑病的抗性基因，限制了玉米品种的改良。因此，挖掘新的玉米弯孢叶斑病抗性基因，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种玉米zm-apx基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用，提供了一种有效鉴定玉米弯孢叶斑病的抗性基因。

本发明的第一个目的是提供一种能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记，所述分子标记为如seqidno.1或seqidno.10所示的zm-apx基因。

本发明的第二个目的是提供一种所述的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记的获得方法，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米的总rna备用；

步骤2，将玉米总rna反转录成cdna第一链；

步骤3，分子标记的克隆

合成引物：zm-apxf2:5'-tccttgcaaccctccgccctttc-3'；zm-apxr2:5'-ttgccgaaccaacggaaactag-3'；

用步骤2反转录的cdna第一链作为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：10×pcrbuffer4μl、10mmdntp1μl、zm-apxf20.5μl、zm-apxr20.5μl、cdna模板1.5μl、taq酶0.5μl、灭菌h2o17μl；

pcr结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1186bp的条带，即获得能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记。

本发明的第三个目的是提供一种所述的分子标记在玉米弯孢叶斑病防治中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种zm-apx基因在玉米弯孢叶斑病防治中的应用至少具有以下有益效果：

本发明通过检测zm-apx转基因材料并鉴定其弯孢叶斑病抗病性，结果显示在转基因阳性株系中zm-apx的表达量显著高于阴性株系。人工接种弯孢叶斑病后，在zm-apx转基因阳性株系中病斑的显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qrt-pcr结果我们可以发现zm-apx基因可提高玉米对弯孢叶斑病的抗性，实验结果为进一步探究zm-apx的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米弯孢叶斑病的抗病性育种提供了基因资源。

利用本发明提供的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记zm-apx基因可有效鉴定玉米品种是否抗病，也可构建转基因植株，以增加原玉米品种的弯孢叶斑病抗性，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。

附图说明

图1是本发明玉米总rna和玉米18scdna第一链的电泳图；

图1a是玉米总rna，1、2泳道均是玉米总rna；图1b是玉米18scdna第一链，m泳道为dl2000，1-4泳道均是玉米18scdna第一链；

图2是zm-apxf2、zm-apxr2引物扩增和5个阳性克隆子的检测结果；

图2a是zm-apxf2、zm-apxr2引物扩增结果，其中m号泳道是dl2000，1号泳道是扩增产物；图2b是5个阳性克隆子的检测结果，其中m号泳道是dl2000，1-5号泳道是阳性克隆子；

图3是zm-apxr5、zm-apxf5引物pcr产物电泳结果；

其中m号泳道是bm5000，1-2号泳道是pcr产物；

图4是pmd-zm-apx和质粒载体pcambia3301的双酶切电泳结果；

图4a是pmd-zm-apx双酶切电泳结果,m号泳道是dl2000，1-2号泳道是pmd-zm-apx双酶切产物；图4b是质粒载体pcambia3301的双酶切电泳结果，m号泳道是dl150000，1-3号泳道是pcambia3301的双酶切产物；

图5是t2代转基因玉米植株pcr检测结果；

m号泳道是dl50000，243、241号泳道是阴性株系，其余泳道是阳性株系；

图6是转基因株系的实时荧光定量pcr检测结果；

图7是转基因株系的表型鉴定结果；

图7a、图7b、图7c、图7d分别是235、236、243、241转基因株系；

图8是玉米弯孢叶斑病病斑的差异性进行数据统计分析。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用的材料若无特殊说明均为市售。玉米自交系b73为河南农业大学农学院保存。大肠杆菌dh5α购自上海北诺生物科技有限公司，rna提取试剂trizolreagent，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，t载体、pmd18-t载体，taq酶，质粒提取试剂盒，限制性内切酶，t4连接酶，depc水均购自宝生物工程有限公司，测序和引物合成分别在华大和上海生工进行。玉米自交系b73取样方式如下：玉米自交系b73种植后，待四叶一心时取玉米叶片-80℃保存备用。

实施例1一种所述zm-apx基因的克隆方法，具体步骤如下：

步骤1，采用rna提取试剂trizolreagent提取玉米自交系b73叶片的总rna，获得玉米总rna备用。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1a所示，图1a中1、2泳道均是玉米总rna，均包括28s、18s为核糖体的大、小两个亚基，最下面那条条带为5.8s和5s(因为长度差距不大，故5.8s和5s很难在电泳中区分出来)，说明rna完整性良好，可以用作后续试验。

步骤2，提取玉米基因组dna

用植物基因组dna提取试剂盒(天根)提取玉米基因组dna，备用。

步骤3，cdna第一链的合成和检测

(1)cdna第一链的合成

按照反转录试剂盒的说明，将玉米总rna反转录成cdna第一链。cdna第一链的合成体系为：步骤1的玉米总rna6μl、oligo(dt)1μl、depc水4μl。65℃温浴5min，然后冰上放置2min，再加入如下试剂：rnase抑制剂1μl、m-mlvbuffer4μl、dntp(25nml)3μl、m-mlv反转录酶1μl；其中，oligo(dt)的核苷酸序列如下：5’-d(tttttttttttttttttt)-3’。设置反转录pcr程序如下：42℃1h，72℃10min，4℃forever；结束后保存于-20℃。

(2)cdna第一链的检测

设计玉米18s基因引物如下：18sr1：5'-cctgcggcttaattgactc-3'，如seqidno.2所示；18sf1：5'-gttagcaggctgaggtctcg-3'，如seqidno.3所示；目的产物片段174bp。配置18scdna第一链的pcr检测体系如下：premixtaq12.5μl、18sf11μl、18sr11μl、cdna第一链1μl、ddh2o9.5μl。设置pcr扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。pcr结束后取10μl进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。18scdna第一链的检测电泳如图1b所示，从图中可以看出18s目的条带清晰，说明反转录的cdna质量良好，可以用作后续试验。

步骤4，zm-apx基因的克隆

设计引物：zm-apxf2:5'-tccttgcaaccctccgccctttc-3'，如seqidno.4所示；zm-apxr2:5'-ttgccgaaccaacggaaactag-3'，如seqidno.5所示；目标片段长度1186bp。

用步骤3(1)的cdna第一链作为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：10×pcrbuffer4μl、dntp(10mm)1μl、zm-apxf20.5μl、zm-apxr20.5μl、cdna模板1.5μl、taq酶0.5μl、灭菌h2o17μl；

pcr反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。pcr结束后样品加入5μlloadingbuffer混匀后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。扩增结果如图2a所示，检测得到一条1186bp的条带，和目的片段大小一致。

此外，设计合成zm-apx基因扩增引物如下:

zm-apxf3:5'-cgagtacagcgaggctgtgga-3'，如seqidno.6所示；zm-apxr3：5'-tagctttagacaacatgcag-3'，如seqidno.7所示；目的片段：1417bp。

zm-apxf4:5'-ctgcatgttgtctaaagcta-3'，如seqidno.8所示；zm-apxr4:5'-agttcggagagcttgaggtgggc-3'，如seqidno.9所示；目的片段：1084bp。

步骤5，zm-apx基因pcr扩增产物的回收、连接与转化

①无抗性lb液体培养基配方：分别称取tryptone10g、yeastextract5g、nacl10g于三角瓶中；加入800ml蒸馏水，充分搅拌；用naoh将ph调整为ph＝7；加蒸馏水定容至1l；封口，灭菌后4℃保存。②抗性lb液体培养基配方：无抗性lb液体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml氨苄霉素，制成氨苄霉素液体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml卡那霉素制成卡那霉素液体抗性培养基。③无抗性lb固体培养基：每升无抗性lb液体培养基中加入15g琼脂。④抗性lb固体培养基配方：lb固体培养基灭菌后按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的氨苄霉素，倒入培养皿中制成氨苄霉素固体抗性培养基；或者按100μl/100ml的浓度加入50mg/ml的卡那霉素，倒入培养皿中制成卡那霉素固体抗性培养基。

(1)zm-apx基因pcr扩增产物的回收：利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收步骤4zm-apxf2/zm-apxr2引物扩增的目的片段，-20℃保存备用。

(2)目的片段的链接反应：连接体系如下：pmd18-t载体1μl、无菌去离子水6μl、步骤5(1)目的片段8μl；16℃反应过夜，得连接产物，备用。

(3)大肠杆菌感受态细胞的制备：按照宝生物公司的感受态制备试剂盒制备大肠杆菌dh5α感受态细胞，液氮速冷后放入-80℃冰箱中保存。

(4)转化：大肠杆菌感受态细胞从-80℃取出冰上融化，将步骤5(2)的连接产物全部加入步骤5(3)大肠杆菌dh5α感受态细胞中，混匀，冰上放置30min后，42℃热击90s，快速移至冰上放置5min，加入1ml无抗性lb液体培养基，37℃、180rpm震荡培养2h，5000rpm/min离心3min，吸出多余的上清液，留100μl将沉淀的菌体混匀，用灭菌后的涂布器将混匀后的菌体均匀的布在所述氨苄霉素固体抗性培养基平板上，封口，倒置，于37℃培养过夜。

第二天从lb固体培养基平板上分别挑取5个单菌落于500μl所述氨苄霉素液体抗性培养基中，分别编号1-5，37℃，180rpm/min震荡培养4h，pcr检测，pcr体系和反应程序同步骤4。5个阳性克隆子的检测结果如图2b所示。挑选2号菌液送华大测序公司测序，测序结果经bioxm2.6处理得到zm-apx的orf序列，其中atg为起始密码子(seqidno.10前三个碱基)，终止子为taa(seqidno.10最后三个碱基)，编码区全长753bp，共编码199个氨基酸，结果如seqidno.10所示。

为了获得zm-apx的完整dna序列，我们设计了zm-apxf3/zm-apxr3、zm-apxf4/zm-apxr4其他引物对步骤2提取的玉米基因组dna进行扩增，扩增产物经连接、转化、测序、拼接，获得了2598bp的zm-apx的dna序列，通过和其cdna序列比对，发现zm-apx基因dna序列含有9个外显子(seqidno.1下划线部分)和8个内含子(seqidno.1非下滑下部分)，结果如seqidno.1所示：

atggcgaagaactacccgaccgtgagcgccgagtacagcgaggctgtggacaaggccaggcgcaagctccgagccctcatcgccgagaagagctgcgccccgctcatgctccgcctcgcgtaagcctcttctcccccacctacctcccctgcgctgcgcgcggatttccagatcttcgtgggcgagttttttcggttgcatgatttgggtttccgtttggtcgcgcaggtggcactccgcggggacgttcgacgtgtcgtcgaggaccggcggtccattcggcacgatgaagcatcagtcggaattggctcacggcgctaacgcggggctggacatcgcggtgcggctgctcgagcccatcaaggaggagttcccaatcctctcttacgccgatttctaccaggtctgtccctgaccccgcatcgatctggttgaatgattcgatctgcctgaacggatgtgcgttttgaccacgtacctttctgtctctgctcctgttgcagctcgcgggagttgtggccgtggaggtcaccggtgggcctgagattcccttccaccccggtagggaggtgagattttcgtccttttttttgtcgtccatctttatctgcctttgggtttagccagggcttaaccttttgtttcgaaatctccgaagaggttggtgtgaagatcgtttggttagatcgtggttgcttagtacgacctatctatttgccttttaccatttgcttggtagatacctcttacagttagcgataaccatttcttcatgacacgtgattttatcgctgcaggtaacctttgttttcctgtaagctttgtctctgatgtttgtgtccactagttcaggtttcgattattttatagatatcatattgaacattgtgctgtgaaagttaatttacccatttagtgtaatcttcctcaatatatgagatacagctgtcagtatgtgtatagttagtactccgtatttcattgtttgtttgcattccttgtctcttgtagatgtggtagggtagtcctattactaactctaatgatttttttttcatacttacagctctccagggtgtttgaggaaaaacatcaaaaaatttgttgcttttagaagctgtttctaacatcaatggttccttggcaattagaaaatgttcatatagccttcgttttgtgaagtactgttgaaatgcttgatttctcatggacaaataatcagccgttttgtcatttcatattggtgttctccatccaactttttagtgctttgaatgattatatatacttattcacagtacctgttttgtgccgtctagatagttctggttgccttacccagatgatgttgtgcattatgcagaccacgcacacgtatgatcccagttgatacgttgtcatattatacacatagaccataaattttctgcatgttgtctaaagctatctattttcccgtgatttgtcattatgatgttgggtgacaattagttaacatttggtgataaagttgtttgcttatacccccctttttctcttgaaattcttataagtatagagattgctcttgaaattcttacaagtatagagattggcatgactgactgatagtattttttgttccaccccttttttgtcaccaatgtttgtcaatgtaaacacctaagtatttacatcttttattgtctctttcaggacaagcctcagcccccacctgagggccgccttcctgatgccactaagggtagatctctcgtcttcactatgattgtcttgaatgatgaattgattggttatatttaccacatgttcttcatttgccaattttcttggctaggatatactatactgtcattgatttcttgctgccccttttttaaccaggttctgaccacctgaggcaagtttttggcaagcagatgggcttgagcgatcaggacattgttgccctctctggtggccacaccttggtttgttactgtcactcatgtttgtttcaggtatgtaatatgtatgcttgcacttatttaattttcttgaggtttatttagggaaggtgccacaaagagcggtctggtttcgagggggcctggactacaaaccctttggtctttgacaactcttacttcaagtgagtcttagtctcgtttactattgaaaagcaactgcatttagttaggaaatacttaaaatttgtttaccttgttatgtcattcctggccagctgactgctacactagaaatcaatctattccatttctcccaaactattttcgtagggaacttctgagtggtgataaggagggccttcttcagctcccaagtgacaaagccctgctgagtgaccctgtcttccgccctcttgtcgagaaatatgctgcggtatgtctttcggtattgttataggttattatggagatctgtaacccactgattatttggtgtgccttgtaggatgagaaggctttctttgatgactacaaagaggcccacctcaagctctccgaactggggtaaccattgattgcacaaattgtgcttggtcaattttaacaaatttgatcgtttactcttgtggaatgcaggtttgctgatgct

为了验证zm-apx基因是能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记，我们进行了如下实验：

实施例2制备zm-apx转基因株系

利用所述分子标记zm-apx基因构建能够稳定表达zm-apx的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米弯孢叶斑病抗性的阳性转基因株系。

具体步骤如下：

s1，制备农杆菌感受态细胞、zm-apx基因溶液

取农杆菌gv3101(市售)单菌落于3ml的yeb液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液2ml接种于100mlyeb液体培养基中，28℃振荡培养至od600为0.5-0.8(约3-4h)；4℃，5000rpm/min离心10min，收集菌体；加40ml预冷的50mmcacl2溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加40ml预冷的50mmcacl2溶液，轻轻悬浮农杆菌细胞，4℃，5000rpm/min,离心10min收集沉淀；加入5ml预冷的含50mmcacl2悬浮细胞，加体积分数7％dmso(350μl)，得到农杆菌感受态细胞；每管200μl分装农杆菌感受态细胞，液氮速冻后于-80℃保存备用。

s2，zm-apx过表达载体的构建

根据实施例1中zm-apx基因的orf序列(seqidno.10)设计过表达载体引物，如下：zm-apxr5：5'-acccatggatggcgaagaactac-3'，如seqidno.11所示；zm-apxf5：5'-acagatctttaagcatcagcaaa-3'，如seqidno.12所示。

zm-apxr5引物中ccatgg为ncoi酶切位点，agatct为bglⅱ，ac为保护碱基。zm-apxf5引物中下划线的是spei的酶切位点。以实施例1步骤5(4)阳性克隆子为模板进行pcr扩增，pcr反应体系如下：阳性克隆子1μl、premixtaq12.5μl、zm-apxf51μl、zm-apxr51μl、ddh2o9.5μl；

pcr反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

pcr结束后，1.5％琼脂糖凝胶检测，回收目的dna条带，pcr产物电泳结果如图3所示，扩增出大约为750bp左右的目的条带，并将回收的目的dna条带与t载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞、测序，测序正确的菌液提取质粒，得到重组质粒pmd-zm-apx；将重组质粒pmd-zm-apx和质粒载体pcambia3301分别用ncoi和bglⅱ双酶切；酶切体系如下：质粒20μl、kbuffer6μl、ncoi2μl、bglⅱ2μl、bsa(牛血清蛋白)1μl、ddh2o19μl；37℃酶切6小时后，1.5％琼脂糖凝胶检测，分别回收750bp左右的pmd-zm-apx目的片段和13000bp左右线性的质粒载体pcambia3301目的片段。图4a是pmd-zm-apx双酶切电泳结果，图4b是质粒载体pcambia3301的双酶切电泳结果。用dnat4连接酶连接，连接体系如下：质粒载体pcambia3301目的片段3μl、pmd-zm-apx目的片段10μl、t4-ligasebuffer4μl、bsa1μl、t4dnaligase2μl；16℃连接过夜(≥12h)，然后转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，双酶切检测，测序。将检测、测序正确的质粒，构建成zm-apx过表达载体，命名为pcambia3301-zm-apx保存备用。

s3，用pcambia3301-zm-apx转化s1的农杆菌感受态细胞，得转化菌。

s4，转化菌转化玉米植株

用常规农杆菌侵染的方法将s3的转化菌导入到hiⅱ玉米幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生，获得t0代转基因材料，种植t0代转基因材料，在玉米5叶时，进行报告基因bar基因pcr、除草剂筛选(ppt：200mg/l)结合bar基因试纸条的方法进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有bar基因的阳性植株，阳性植株自交获得t0代种子；种植获得的t0代转基因玉米株系，在玉米5叶时，按上述方法进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有bar基因的t0代阳性植株，阳性和阴性植株分别自交得到t1代种子。t1代种子按上述方法种植和阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有bar基因的t1代阳性植株，t1代阳性植株自交得到t2代种子，种植t2代种子，按上述方法对t2代植株进行阳性鉴定，筛选出抗除草剂和具有bar基因的t2代阳性植株，t2代阳性植株为稳定性高的抗玉米弯孢叶斑病植株。

阳性鉴定时，将经过除草剂筛选(ppt：200mg/l)后的转基因株系生长至第4叶时，提取玉米dna，进行bar基因pcr检测，bar基因pcr所用引物如下：barf6:5'-tgacgcacaatcccactatccttc-3'，如seqidno.13所示；barr6:5'-ccagaaacccacgtcatgccagt-3'，如seqidno.14所示。

bar基因pcr体系如下：玉米dna2μl、premixtaq12.5μl、barf61μl、barr61μl、ddh2o8.5μl。pcr反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。

t2代转基因玉米植株pcr检测结果如图5所示，前两个泳道未检测出bar基因，后十个泳道均检测出了bar基因，说明243、241株系为转基因阴性株系，其他株系均为阳性。

实施例3zm-apx转基因株系的实时荧光定量pcr检测

取实施例2所得243、241阴性株系及235、236阳性株系，参照实施例1步骤1的方法提取玉米总rna，然后参照实施例1步骤3的方法分别合成243、241阴性株系及235、236阳性株系的cdna第一链，然后利用这些cdna第一链进行荧光定量pcr。

荧光定量pcr目的基因引物：

zm-apxf7：5'-catcgccgagaagagct-3'，如seqidno.15所示，zm-apxr75'-gggaactcctccttgat-3'，如seqidno.16所示；pcr扩增片断183bp；

荧光定量pcr内参基因18s引物：

18sr8：5'-cctgcggcttaattgactc-3'，如seqidno.17所示，

18sf8：5'-gttagcaggctgaggtctcg-3'，如seqidno.18所示；pcr扩增片段174bp。

荧光定量pcr体系如下：premixtaq12.5μl、20×sybr染料1μl、zm-apxf50.6μl、zm-apxr50.6μl、模板cdna第一链1μl、ddh2o9.3μl，总体积25.0μl。real-timepcr体系如下：2×taqmastermix12.5μl、sybrgreen染料1μl、zm-apxf70.6μl、zm-apxr70.6μl、模板cdna第一链1μl、ddh2o9.3μl，total25μl。

荧光定量pcr体系在lightcycler480ii上进行扩增，程序如下：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸20s，45个循环；72℃延伸20s；plateread95℃1min，60℃1min，10℃forever。

对zm-prx基因的定量结果用相对定量的分析方法进行分析，相对定量是用来确定经过不同处理的样本目标转录之间的表达差异，其计算方法如下：(1)△ct校准样品＝样品-内参；(2)△ct待测样品＝样品-内参；(3)△△ct＝△ct待测样品-△ct校准样品；(4)计算2^-△△ct值。

检测所取每份样品中zm-prx和18s基因的表达量，并进行3次pcr重复，取3次ct值的平均值，由校准品计算2^-△△ct。我们分别对转基因阳性株系(235、236)和阴性株系(241、243)进行了实时荧光定量pcr分析，实验结果如图6所示，图6中a，b代表0.05水平上的差异分析；243和241代表阴性株系；235和236代表阳性株系。从图6中可以看出，zm-apx在转基因阳性株系中的表达量比阴性株系显著增加，约为550倍，说明zm-apx已经成功整合到玉米基因组中，zm-apx在转基因株系内稳定、大量表达。

实施例4zm-apx基因能够防治玉米弯孢叶斑病的验证

步骤1，抗性鉴定所用的菌株为新月弯孢菌(curvularialunata)(thc6protein,isolatedfromtrichodermaharzianum,caninducemaizedefenseresponseagainstcurvularialunata.(2015may；55(5):591-600.)，菌株由河南农业大学植物保护学院分离纯化保存。利用pda培养基活化新月弯孢菌菌种，并制备1～9×10⁶个/ml浓度的菌株稀释液，备用；分别种植实施例2获得的转基因株系236、235、241、243于大田中，待玉米10叶期时，准备接种。

步骤2，接种：玉米10叶期，采用喷雾法进行接种，喷雾法操作如下：将菌株稀释液喷洒至玉米叶面；在接种后15天后病斑调查。测量穗位叶上部、中部和下部各50cm²的病斑大小，计算面积，然后求平均值，每行测6株(6个平行试验)。

结果如图7所示，图7是转基因株系的表型鉴定结果，图7a-d分别是235、、236、243、241转基因株系。从图7中可以看出，转基因阳性株系235、236的叶片上几乎没有出现病斑，而阴性对照株系的叶片上出现了大量的病斑。说明zm-apx基因可用于防治玉米弯孢叶斑病，也可作为具有玉米弯孢叶斑病抗性品种的分子筛选标记。

对玉米弯孢叶斑病病斑的差异性进行数据统计分析，结果如图8所示，转基因阴性株系和阳性株系间的差异达到了显著水平。图8中，a、b代表0.01水平上的差异分析。

综上，我们得出如下结论：通过检测zm-apx转基因材料并鉴定其抗病性，结果显示在转基因阳性株系中zm-apx的表达量显著高于阴性株系。人工接种玉米弯孢叶斑病后，在转基因阳性株系中病斑的数量显著少于阴性株系。对病斑大小的统计数据进行差异性分析，结果表明，转基因阳性株系中病斑的大小在接种后显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qrt-pcr结果我们可以发现,zm-apx基因可提高玉米对弯孢叶斑病的抗性，实验结果为进一步探究zm-apx的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米弯孢叶斑病的抗病性育种提供了基因资源。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>河南农业大学

<120>玉米zm-apx基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2598

<212>dna

<213>玉米

<400>1

atggcgaagaactacccgaccgtgagcgccgagtacagcgaggctgtggacaaggccagg60

cgcaagctccgagccctcatcgccgagaagagctgcgccccgctcatgctccgcctcgcg120

taagcctcttctcccccacctacctcccctgcgctgcgcgcggatttccagatcttcgtg180

ggcgagttttttcggttgcatgatttgggtttccgtttggtcgcgcaggtggcactccgc240

ggggacgttcgacgtgtcgtcgaggaccggcggtccattcggcacgatgaagcatcagtc300

ggaattggctcacggcgctaacgcggggctggacatcgcggtgcggctgctcgagcccat360

caaggaggagttcccaatcctctcttacgccgatttctaccaggtctgtccctgaccccg420

catcgatctggttgaatgattcgatctgcctgaacggatgtgcgttttgaccacgtacct480

ttctgtctctgctcctgttgcagctcgcgggagttgtggccgtggaggtcaccggtgggc540

ctgagattcccttccaccccggtagggaggtgagattttcgtccttttttttgtcgtcca600

tctttatctgcctttgggtttagccagggcttaaccttttgtttcgaaatctccgaagag660

gttggtgtgaagatcgtttggttagatcgtggttgcttagtacgacctatctatttgcct720

tttaccatttgcttggtagatacctcttacagttagcgataaccatttcttcatgacacg780

tgattttatcgctgcaggtaacctttgttttcctgtaagctttgtctctgatgtttgtgt840

ccactagttcaggtttcgattattttatagatatcatattgaacattgtgctgtgaaagt900

taatttacccatttagtgtaatcttcctcaatatatgagatacagctgtcagtatgtgta960

tagttagtactccgtatttcattgtttgtttgcattccttgtctcttgtagatgtggtag1020

ggtagtcctattactaactctaatgatttttttttcatacttacagctctccagggtgtt1080

tgaggaaaaacatcaaaaaatttgttgcttttagaagctgtttctaacatcaatggttcc1140

ttggcaattagaaaatgttcatatagccttcgttttgtgaagtactgttgaaatgcttga1200

tttctcatggacaaataatcagccgttttgtcatttcatattggtgttctccatccaact1260

ttttagtgctttgaatgattatatatacttattcacagtacctgttttgtgccgtctaga1320

tagttctggttgccttacccagatgatgttgtgcattatgcagaccacgcacacgtatga1380

tcccagttgatacgttgtcatattatacacatagaccataaattttctgcatgttgtcta1440

aagctatctattttcccgtgatttgtcattatgatgttgggtgacaattagttaacattt1500

ggtgataaagttgtttgcttatacccccctttttctcttgaaattcttataagtatagag1560

attgctcttgaaattcttacaagtatagagattggcatgactgactgatagtattttttg1620

ttccaccccttttttgtcaccaatgtttgtcaatgtaaacacctaagtatttacatcttt1680

tattgtctctttcaggacaagcctcagcccccacctgagggccgccttcctgatgccact1740

aagggtagatctctcgtcttcactatgattgtcttgaatgatgaattgattggttatatt1800

taccacatgttcttcatttgccaattttcttggctaggatatactatactgtcattgatt1860

tcttgctgccccttttttaaccaggttctgaccacctgaggcaagtttttggcaagcaga1920

tgggcttgagcgatcaggacattgttgccctctctggtggccacaccttggtttgttact1980

gtcactcatgtttgtttcaggtatgtaatatgtatgcttgcacttatttaattttcttga2040

ggtttatttagggaaggtgccacaaagagcggtctggtttcgagggggcctggactacaa2100

accctttggtctttgacaactcttacttcaagtgagtcttagtctcgtttactattgaaa2160

agcaactgcatttagttaggaaatacttaaaatttgtttaccttgttatgtcattcctgg2220

ccagctgactgctacactagaaatcaatctattccatttctcccaaactattttcgtagg2280

gaacttctgagtggtgataaggagggccttcttcagctcccaagtgacaaagccctgctg2340

agtgaccctgtcttccgccctcttgtcgagaaatatgctgcggtatgtctttcggtattg2400

ttataggttattatggagatctgtaacccactgattatttggtgtgccttgtaggatgag2460

aaggctttctttgatgactacaaagaggcccacctcaagctctccgaactggggtaacca2520

ttgattgcacaaattgtgcttggtcaattttaacaaatttgatcgtttactcttgtggaa2580

tgcaggtttgctgatgct2598

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cctgcggcttaattgactc19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gttagcaggctgaggtctcg20

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tccttgcaaccctccgccctttc23

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ttgccgaaccaacggaaactag22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cgagtacagcgaggctgtgga21

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tagctttagacaacatgcag20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ctgcatgttgtctaaagcta20

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

agttcggagagcttgaggtgggc23

<210>10

<211>753

<212>dna

<213>玉米

<400>10

atggcgaagaactacccgaccgtgagcgccgagtacagcgaggctgtggacaaggccagg60

cgcaagctccgagccctcatcgccgagaagagctgcgccccgctcatgctccgcctcgcg120

tggcactccgcggggacgttcgacgtgtcgtcgaggaccggcggtccattcggcacgatg180

aagcatcagtcggaattggctcacggcgctaacgcggggctggacatcgcggtgcggctg240

ctcgagcccatcaaggaggagttcccaatcctctcttacgccgatttctaccagctcgcg300

ggagttgtggccgtggaagtcaccggtgggcctgagattcccttccaccccggtagggag360

gacaagcctcagcccccacctgagggccgccttcctgatgccactaagggttctgaccac420

ctgaggcaagtttttggcaagcagatgggcttgagcgatcaggacattgttgccctctct480

ggtggccacaccttgggaaggtgccacaaagagcggtctggtttcgagggggcctggact540

acaaaccctttggtctttgacaactcttacttcaaggaacttctgagtggtgataaggag600

ggccttcttcagctcccaagtgacaaagccctgctgagcgaccctgttttccgccctctt660

gtcgagaaatatgctgcggatgagaaggctttctttgatgactacaaagaggcccacctc720

aagctctccgaactggggtttgctgatgcttaa753

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

acccatggatggcgaagaactac23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

acagatctttaagcatcagcaaa23

<210>13

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tgacgcacaatcccactatccttc24

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ccagaaacccacgtcatgccagt23

<210>15

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

catcgccgagaagagct17

<210>16

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

gggaactcctccttgat17

<210>17

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cctgcggcttaattgactc19

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gttagcaggctgaggtctcg20