一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：小麦是我国的主要粮食作物，籽粒产量的2/3来自于灌浆期光合作用合成的同化物。叶绿素的降解与光合作用密切相关。植物叶绿素a的降解存在两条途径：一是在叶绿素酶的催化下脱植基，生成脱植基叶绿素a，再在脱镁螯合物作用下去除镁离子，生成脱镁叶绿酸a；二是先在脱镁螯合物作用下脱去镁离子生成脱镁叶绿素a，再在脱镁叶绿素酶(pheophytinase，pph)作用下脱去植基，生成脱镁叶绿酸a。研究表明，脱镁叶绿素酶(pph)在叶绿素的降解过程中扮演重要角色，因此，研究和利用脱镁叶绿素酶基因对于延缓花后小麦叶绿素降解、延长光合作用时间，进一步提高产量具有重要意义。常规育种通常是通过表型筛选，尽管取得了很大的成就，但耗时费力，育种进程缓慢。随着分子生物技术的快速发展，重要基因的功能不断被揭示，在作物遗传改良中高效利用这些功能基因已成为基因发掘的重要目标。分子标记辅助选择技术为提高目标性状选择效率，改良作物提供了一条新的有效途径。基于基因序列开发功能标记，能够高效选择目标基因，准确用于辅助选择，因此，受到相关研究者的高度关注。迄今为止，小麦脱镁叶绿素酶(pph)基因的分子标记尚未开发，与产量性状的关系也未揭示。caps标记又称为pcr-rflp(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)，是一类以pcr为基础的共显性分子标记，揭示的是特异pcr片段的限制性长度变异信息，其基本原理是用pcr扩增目的dna，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的dna片段条带。优点是避免了rflp分析中繁琐的转移、杂交步骤，又能保持rflp分析的精确度。然而，snp恰好位于限制性酶切位点的情况比较少，因此，提出了dcaps标记，即在caps标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，结合snp位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和caps标记类似的多态性。技术实现要素：本发明的目的为如何筛选不同千粒重小麦。本发明首先保护筛选不同千粒重小麦的方法。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii，基因型i小麦的千粒重>基因型ii小麦的千粒重；所述基因型i的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型的小麦；所述基因型ii的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型的小麦；所述“a1299gsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1299位核苷酸。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法g，可包括如下步骤：检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii；所述基因型i的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型、基于g1038asnp位点的基因型为gg纯合型、基于c1468tsnp位点的基因型为cc纯合型、基于a3790csnp位点的基因型为aa纯合型和基于indel位点的核苷酸序列为aa的小麦；所述基因型ii的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型、基于g1038asnp位点的基因型为aa纯合型、基于c1468tsnp位点的基因型为tt纯合型、基于a3790csnp位点的基因型为cc纯合型和基于indel位点的两个核苷酸缺失的小麦；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法h，可包括如下步骤：检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii；所述基因型i的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于g1038asnp位点的基因型为gg纯合型和/或基于c1468tsnp位点的基因型为cc纯合型和/或基于a3790csnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于indel位点的核苷酸序列为aa的小麦；所述基因型ii的小麦为基于a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型和/或基于g1038asnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于c1468tsnp位点的基因型为tt纯合型和/或基于a3790csnp位点的基因型为cc纯合型和/或基于indel位点的两个核苷酸缺失的小麦；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。上述任一所述“a1299gsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1299位核苷酸。上述任一所述“g1038asnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1038位核苷酸。上述任一所述“c1468tsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1468位核苷酸。上述任一所述“a3790csnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第3790位核苷酸。上述任一所述“indel位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1902-1903位核苷酸。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法a，可依次包括如下步骤：(a1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用引物tapph-7a-primer-f和引物tapph-7a-primer-r组成的引物对乙进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p1；(a2)以所述pcr扩增产物p1为模板，采用引物tapph-ecori-f和引物tapph-ecori-r组成的引物对甲进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p2；(a3)将所述pcr扩增产物p2用限制性内切酶ecori进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果所述酶切产物为一条dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法b，可依次包括如下步骤：(b1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述引物tapph-ecori-f和所述引物tapph-ecori-r组成的引物对甲进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p3；(b2)将所述pcr扩增产物p3用限制性内切酶ecori进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果所述酶切产物为一条dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。上述任一所述引物tapph-7a-primer-f可为如下a1)或a2)：a1)序列表的序列3所示的单链dna分子；a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子。上述任一所述引物tapph-7a-primer-r可为如下a3)或a4)：a3)序列表的序列4所示的单链dna分子；a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子。上述任一所述引物tapph-ecori-f可为如下a5)或a6)：a5)序列表的序列5所示的单链dna分子；a6)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子。上述任一所述引物tapph-ecori-r可为如下a7)或a8)：a7)序列表的序列6所示的单链dna分子；a8)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的dna分子。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法c，可依次包括如下步骤：(c1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物tapph-7a-primer-f和上述任一所述引物tapph-7a-primer-r组成的引物对乙进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p1；(c2)以所述pcr扩增产物p1为模板，采用上述任一所述引物tapph-ecori-f和上述任一所述引物tapph-ecori-r组成的引物对甲进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p2；(c3)将所述pcr扩增产物p2用限制性内切酶ecori进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有174bp的dna片段和28bp的dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果酶切产物中具有202bp的dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法d，可依次包括如下步骤：(d1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物tapph-ecori-f和上述任一所述引物tapph-ecori-r组成的引物对甲进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p3；(d2)将所述pcr扩增产物p3用限制性内切酶ecori进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有174bp的dna片段和28bp的dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果酶切产物中具有202bp的dna片段，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。本发明所保护的筛选不同千粒重小麦的方法，具体可为方法二，可依次包括如下步骤：(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物tapph-7a-primer-f和上述任一所述引物tapph-7a-primer-r组成的引物对乙进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p1；(2)将所述pcr扩增产物p1进行测序，然后进行如下评判：如果所述pcr扩增产物p1的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第355-4479位所示，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果所述pcr扩增产物p1的核苷酸序列如序列表中序列2自5’末端起第355-4477位所示，则待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。上述任一所述方法中，所述>具体可为统计学上的>。本发明还保护鉴定小麦千粒重的试剂盒。本发明所保护的鉴定小麦千粒重的试剂盒，具体可为试剂盒甲，试剂盒甲可包括检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii的物质；所述基因型i为基于a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型的tapph-7a基因；所述基因型ii为基于a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型的tapph-7a基因；所述“a1299gsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1299位核苷酸。上述试剂盒甲中，所述“检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii的物质”可为上述任一所述引物tapph-ecori-f和上述任一所述引物tapph-ecori-r组成的引物对甲和/或上述任一所述引物tapph-7a-primer-f和上述任一所述引物tapph-7a-primer-r组成的引物对乙。上述任一所述试剂盒甲还可包括限制性内切酶ecori。本发明所保护的鉴定小麦千粒重的试剂盒，具体可为试剂盒乙，试剂盒乙可包括检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i还是基因型ii的物质；所述基因型i为基于a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于g1038asnp位点的基因型为gg纯合型和/或基于c1468tsnp位点的基因型为cc纯合型和/或基于a3790csnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于indel位点的核苷酸序列为aa的tapph-7a基因；所述基因型ii为基于a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型和/或基于g1038asnp位点的基因型为aa纯合型和/或基于c1468tsnp位点的基因型为tt纯合型和/或基于a3790csnp位点的基因型为cc纯合型和/或基于indel位点的两个核苷酸缺失的tapph-7a基因；所述“a1299gsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1299位核苷酸；所述“g1038asnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1038位核苷酸；所述“c1468tsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1468位核苷酸；所述“a3790csnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第3790位核苷酸；所述“indel位点”为小麦基因组中序列表中的序列1自5’末端起第1902-1903位核苷酸。本发明还保护如序列表的序列7所示的分子标记。(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)也属于本发明的保护范围。(z1)上述任一所述试剂盒或所述分子标记在筛选不同千粒重小麦中的应用。(z2)上述任一所述试剂盒或所述分子标记在制备筛选不同千粒重小麦的产品中的应用。(z3)上述任一所述试剂盒或所述分子标记在鉴定小麦tapph-7a基因的基因型中的应用。(z4)上述任一所述试剂盒或所述分子标记在制备鉴定小麦tapph-7a基因的基因型的产品中的应用。(z5)上述任一所述试剂盒或所述分子标记在小麦育种中的应用。上述任一所述的应用中，当分子标记的a1299gsnp位点的基因型为aa纯合型，则判定为基因型i的小麦；当分子标记的a1299gsnp位点的基因型为gg纯合型，则判定为基因型ii的小麦；所述“a1299gsnp位点”为小麦基因组中序列表中的序列7自5’末端起第175位核苷酸；基因型i的小麦的千粒重>基因型ii的小麦的千粒重。上述应用中，所述>具体可为统计学上的>。实验证明，采用本发明所提供的方法检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型，可以筛选小麦千粒重性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。附图说明图1为小麦tapph-7a基因、4个snp位点、1个indel位点和dcaps标记的位置示意图及dcaps标记的电泳检测结果。a为小麦tapph-7a基因的结构示意图；b为小麦tapph-7a基因中4个snp位点和1个indel位点的位置示意图；c为根据a1299gsnp开发的dcaps标记的示意图，原序列碱基g替换为c后形成ecori酶切位点；d为pcr扩增产物p2用限制性内切酶ecori酶切后的电泳检测结果。图2为不同种植条件下自然群体1中两种基因型小麦平均千粒重的统计结果。图3为不同种植条件下自然群体2中两种基因型小麦平均千粒重的统计结果。图4为不同种植条件下自然群体3中两种基因型小麦平均千粒重的统计结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(网址为：http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网(网址为：http://icgr.caas.net.cn)。由于小麦材料均为栽培种，因此通常被默认为是高度纯合的植物材料，基因型均为纯合型。实施例1、小麦tapph-7a基因中4个snp位点和1个indel位点的发现及基因型的分类1、根据小麦tapph-7a基因的核苷酸序列设计并合成a基因组特异引物tapph-7a-primer-f和引物tapph-7a-primer-r。引物tapph-7a-primer-f：5′-ggcaccaagaatagcaaggc-3′(序列表中序列3)。引物tapph-7a-primer-r：5′-tcatctggatactacccgtatgctggagg-3′(序列表中序列4)。2、分别提取表1所示的36个小麦品种的基因组dna并以其作为模板，采用引物tapph-7a-primer-f和引物tapph-7a-primer-r组成的引物对进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物p1。反应体系为20μl，由12.2μlddh2o、4μl5×fastpfubuffer、0.4μl引物tapph-7a-primer-f水溶液(浓度为10μm)、0.4μl引物tapph-7a-primer-r水溶液(浓度为10μm)、1.6μldntp(浓度为2.5mm)、0.4μlfastpfudnapolymerase和1μl小麦基因组dna(浓度为50ng/μl)组成。fastpfudnapolymerase为北京全式金生物技术有限公司的产品。5×fastpfubuffer为fastpfudnapolymerase中的组件。反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃2.5min，36个循环；72℃15min；4℃保存。表1编号小麦品种编号小麦品种1pandas19昌乐5号2安85中124-120红和尚3偃展1号21北京86864霸王鞭2204-0445北京10号2304-0306北京14号24春229th-257沧州小麦25紫杆白芒先8长武13126京品10号9长687827春049th-5-110大荔1号28春459th-50-111单r809339内乡18812丰抗1330京41113冀麦4131中国春14冀麦6号32白糙麦15晋2148-733旱选10号16京核892234鲁麦1417临抗510835opata18白齐麦36w79843、将各个pcr扩增产物p1与-bluntcloningvector(北京全式金生物技术有限公司的产品)连接，然后转化trans1-t1phageresistant化学感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司的产品)，涂布于含卡那霉素、x-gal和iptg的lb固体培养基上，37℃倒置培养12h；挑取阳性单克隆于含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm培养8h，提取质粒，测序；对测序结果进行序列比对分析。结果表明，在小麦的tapph-7a基因上含有4个snp位点和1个indel位点(见图1中a和b)，且4个snp位点和1个indel位点是紧密连锁的。4个snp位点分别命名为g1038asnp(位于序列表中序列1自5’末端起的第1038位，基因型为gg纯合型和aa纯合型)、a1299gsnp(位于序列表中序列1自5’末端起的第1299位，基因型为aa纯合型和gg纯合型)、c1468tsnp(位于序列表中序列1自5’末端起的第1468位，基因型为cc纯合型和tt纯合型)和a3790csnp(位于序列表中序列1自5’末端起的第3790位，基因型为aa纯合型和cc纯合型)，1个indel位点位于序列表中序列1自5’末端起的第1902-1903位，在序列2中的相应位置缺失(图1中b用“--”表示)。由于基因组dna是由反向互补的两条单链dna分子组成双链dna分子，因此一般将编码蛋白质的dna分子，也就是具有起始密码子至终止密码子的dna分子，命名为正义dna分子；将与正义dna分子的反向互补的dna分子命名为反义dna分子。4个snp位点处的基因型均为正义dna的基因型。结果还表明，一部分小麦品种的pcr扩增产物p1的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第355-4479位所示，另一部分小麦品种的pcr扩增产物p1的核苷酸序列如序列表中序列2自5’末端起第355-4477位所示。因此，根据小麦tapph-7a基因的不同将小麦分为两种基因型：tapph-7a-a(以下简称基因型i)和tapph-7a-g(以下简称基因型ii)。基因型i小麦tapph-7a基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。基因型ii小麦tapph-7a基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。实施例2、小麦基于tapph-7a基因的基因型分型方法的建立由于tapph-7a基因的4个snp位点和1个indel位点紧密连锁，因此可以通过检测g1038asnp、a1299gsnp、c1468tsnp、a3790csnp和indel位点中的任意一个位点的核苷酸序列来判定小麦基于tapph-7a基因的基因型。本发明的发明人选择检测a1299gsnp位点的核苷酸序列来判定小麦基于tapph-7a基因的基因型。一、特异引物对的制备设计用于扩增包括a1299gsnp的靶序列的特异引物对如下：引物tapph-ecori-f：5′-aagtcttcgttggtgctcac-3′(序列表中序列5)；引物tapph-ecori-r：5′-aagaagttgtaagactgacataagaat-3′(序列表中序列6)。二、小麦基于tapph-7a基因的基因型分型方法的建立小麦基于tapph-7a基因的基因型分型方法的原理见图1中c。(1)提取待测小麦的基因组dna(2)以步骤(1)的基因组dna为模板，采用引物tapph-7a-primer-f和引物tapph-7a-primer-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p1。反应体系为20μl，由12.2μlddh2o、4μl5×fastpfubuffer、0.4μl引物tapph-7a-primer-f水溶液(浓度为10μm)、0.4μl引物tapph-7a-primer-r水溶液(浓度为10μm)、1.6μldntp(浓度为2.5mm)、0.4μlfastpfudnapolymerase和1μl小麦基因组dna(浓度为50ng/μl)组成。反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃2.5min，36个循环；72℃15min；4℃保存。(3)完成步骤(2)后，以pcr扩增产物p1的稀释液(1体积份pcr扩增产物p1和9体积份水混合而成)为模板，采用引物tapph-ecori-f和引物tapph-ecori-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物p2。反应体系为20μl，由13.4μlddh2o、2μl10×taqbuffer、1.4μlmgcl2水溶液(浓度为25mm)、1μldmso、0.2μldntp(浓度为2.5mm)、0.4μl引物tapph-ecori-f水溶液(浓度为10μm)、0.4μl引物tapph-ecori-r水溶液(浓度为10μm)、0.2μltaqdnapolymerase(浓度为5u/μl)和1μlpcr扩增产物p1的稀释液组成。taqdnapolymerase为thermofisherscientific公司的产品。10×taqbuffer为taqdnapolymerase中的组件。反应条件为：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s；35个循环；72℃5min；4℃保存。(4)将步骤(3)得到的pcr扩增产物p2用限制性内切酶ecori进行酶切消化，得到酶切产物；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行如下判断(图1中d)：如果酶切产物为带型a(显示两条带，分别为174bp和28bp)，则待测小麦a1299gsnp为aa纯合型，即待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型i；如果酶切产物为带型b(显示一条带，为202bp)，则待测小麦a1299gsnp为gg纯合型)，即待测小麦基于tapph-7a基因的基因型为基因型ii。实施例3、小麦tapph-7a基因的基因型与小麦千粒重的关联分析及验证一、自然群体1中tapph-7a基因的基因型与小麦千粒重的关联分析1、自然群体1中各个小麦tapph-7a基因的基因分型自然群体1由主要来自中国北部晚熟冬麦区和黄淮冬麦区的323份小麦种质(均为六倍体小麦)组成。种质名称和地理来源详见表2。表2注：a表示aa纯合型，g表示gg纯合型。采用实施例2中步骤二的方法对自然群体1中的各个小麦种质进行基因分型。各个小麦种质基于a1299gsnp的基因型见表2。2、千粒重性状检测将各个小麦种质分别种植于2015年北京顺义旱地(以下简称e1)、2015年北京顺义水地(以下简称e2)、2015年北京顺义旱地并进行热处理(以下简称e3)、2015年北京顺义水地并进行热处理(以下简称e4)、2016年北京昌平旱地(以下简称e5)、2016年北京昌平水地(以下简称e6)、2016年北京顺义旱地(以下简称e7)、2016年北京顺义水地(以下简称e8)、2016年北京顺义旱地并进行热处理(以下简称e9)、2016年北京顺义水地并进行热处理(以下简称e10)、2017年北京顺义旱地(以下简称e11)和2017年北京顺义水地(以下简称e12)，收获后分别统计不同种植条件下两种基因型的小麦的平均千粒重。需要指明的是，北京昌平旱地、北京昌平水地、北京顺义旱地和北京顺义水地均为中国农业科学院作物科学研究所的实验基地。所述旱地指的是小麦的整个生长期仅有自然的雨水灌溉，人为不灌溉任何水分。所述水地指的是小麦的整个生长期不仅有自然的雨水灌溉，还有人为灌溉水分(人为灌溉的具体操作为：分别在越冬期之前、抽穗期、开花期和灌浆期灌溉，每次灌溉的水量为750m3/公顷水地)。所述热胁迫为当待测小麦处于开花期，开始覆盖塑料大棚，直至小麦品种成熟。在旱地进行热胁迫，塑料大棚外温度平均为33℃，塑料大棚内温度为43℃。在水地进行热胁迫，塑料大棚外温度平均为33℃，塑料大棚内温度为41℃。统计结果见图2(tapph-7a-a即基因型i，tapph-7a-g即基因型ii)。3、关联分析利用tassel2.1软件glm模型将自然群体1中小麦tapph-7a基因的基因型与千粒重进行关联分析，结果见表3。表3注：pvalue为关联分析的显著性水平，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01。结果表明，自然群体1中，“基因型i的小麦”的千粒重>“基因型ii的小麦”的千粒重；所述“>”为在统计学上的>。二、自然群体2中tapph-7a基因的基因型与小麦千粒重的统计分析1、自然群体2中各个小麦tapph-7a基因的基因分型自然群体2由主要来自中国小麦微核心种质资源的157份小麦种质(均为六倍体小麦)组成。种质名称和地理来源详见表4。表4注：“-”表示地理来源不明，a表示aa纯合型，g表示gg纯合型。采用实施例2中步骤二的方法对自然群体2中的各个小麦种质进行基因分型。各个小麦种质基于a1299gsnp的基因型见表4。2、千粒重性状检测将各个小麦种质分别种植于2002年洛阳旱地(以下简称2002ly)、2005年洛阳旱地(以下简称2005ly)和2010年北京顺义旱地(以下简称2010sy)，收获后分别统计不同种植条件下两种基因型的小麦的平均千粒重。需要指明的是，洛阳旱地和北京顺义旱地均为中国农业科学院作物科学研究所的实验基地。旱地指的是小麦的整个生长期仅有自然的雨水灌溉，人为不灌溉任何水分。统计结果见图3(tapph-7a-a即基因型i，tapph-7a-g即基因型ii)。结果表明，自然群体2中，“基因型i的小麦”的千粒重>“基因型ii的小麦”的千粒重；所述“>”为在统计学上的>。三、自然群体3中tapph-7a基因的基因型与小麦千粒重的统计分析1、自然群体3中各个小麦tapph-7a基因的基因分型自然群体3由主要来自中国小麦核心种质资源的348份小麦种质(均为六倍体小麦)组成。种质名称和地理来源详见表5。表5注：“-”表示没有pcr扩增产物，所以等位变异情况未知，a表示aa纯合型，g表示gg纯合型。采用实施例2中步骤二的方法对自然群体3中的各个小麦种质进行基因分型。各个小麦种质基于a1299gsnp的基因型见表5。2、千粒重性状检测将各个小麦种质分别种植于2002年洛阳旱地(以下简称2002ly)、2005年洛阳旱地(以下简称2005ly)和2010年北京顺义旱地(以下简称2010sy)，收获后分别统计不同种植条件下两种基因型的小麦的平均千粒重。需要指明的是，洛阳旱地和北京顺义旱地均为中国农业科学院作物科学研究所的实验基地。旱地指的是小麦的整个生长期仅有自然的雨水灌溉，人为不灌溉任何水分。统计结果见图4(tapph-7a-a即基因型i，tapph-7a-g即基因型ii)。结果表明，自然群体3中，“基因型i的小麦”的千粒重>“基因型ii的小麦”的千粒重；所述“>”为在统计学上的>。上述结果表明，通过检测待测小麦基于tapph-7a基因的基因型可以筛选小麦千粒重性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。<110>中国农业科学院作物科学研究所山西农业大学<120>一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>4479<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atggaagtggtttcttccagtcactcttgcttggcatttcatcaaacccctaccagtgcg60cggaggtctctgggcactggtcttggtccgcggcataccaagcttgctcggccaagaaaa120agctcagttctctgtgttgggagagcttcaaatcctggtgattcaggaaagcttaatgtc180agccgcagcttcggtgtaagcgatgtcgatgctgccctccagggcatctccaagaaggta240ggccagatcgagaaagtggcgattcctggcctgccagaagggccagacagttctcaaatc300agcactggtttgtgggagtggaagccgaagctgacggtatactacgagaagtctggcacc360aagaatagcaaggcgccagcagtgctttttctaccaggttttggggtgggcacgttccat420tttgagaagcaattgatggatcttggccgtgattacaaggtgtggacgatggattttctg480ggacagggaatgtcattgccgtgtgaagaccctgctcctaaggccatggcaggggaggag540gatgaggaatcatattggggttttggacaagattcgcaaccatgggcagatgaattggtg600tactctgtagacttgtggcgtgaccaggtccagcatttcattgaagaggtaccattttgg660aatatttgttgtttcatccagtcttctttttggctttgtgctaatatgtctttcaagtta720acaaatcttcgtgtgctttgcactctctggaagtcctgaaataattagcaagttagtttt780tttagggagcaagttagctgttttactttcatcatgagtggttgttgttagatcatcaag840tggtaacggataccaagaatggatttccaggataatttgattatctaggtatttcttaat900actatacatctatacatagacttgtgaaaatgttgttatggtggtctggtcaagaatcac960atatatcatgtatattcaaactctgtcatggttgcataatcgagttcttccttactcggg1020aatgttccagttggaacgctatgtgatcatcttttttggtgcttgatggctgtgtgcgcc1080gcaatgttgcagaggccagggttcacctccttttcaaaaaaagaaagtcttcgttggtgc1140tcactattcttaatgaaagcaaaatgatgtattgattcctgtttggtgaatgtttcttgg1200tttttggtcatacgagtaagaaaggtcctgggaatataactgatctttgagttaacaggt1260tcaactttgctggctgtaaatgttaatgtgtctccaagaattgttatgtcagtcttacaa1320cttctttttttgttatcatactatttagaatcttgctattcacagccagtttggcgacat1380atatcttcaactgttggatttatgtctcatttttcttactcttaagtttataaccctctt1440gcaggttatcggtgaaccagtttatatcgtgggaaactctcttggaggttttgttgctct1500atatcttgctgcatccagtccacaccttgtaaagggggtcacgttgcttaatgcaacgcc1560attttggggtttccttcctaatcctgcaagatctcctcgtttgtcaaagatttttccatg1620ggctgggacatttcctcttccatcagttgtgaggaaacttactgaaacagtgtatgtgtt1680acttattaggtttcagaacatcgacacgcagattgcattatcttaaagttaccctgctgt1740taattattgggccttgacgttttttgttcactaagctggattcatggattgtagtttttt1800atgggattcatgccttttgcattgtatgtgcaggatttacctgaacctttaacatggaaa1860aaccatgaagtttagcaataagttgacatcttcagctcttgcaaaaaaaaaaaactcata1920taaaccatgaacttctgcctggaatttactgaaattcttgcactattatttctctccaca1980tactaggatatcatggttattatgcataattataggatcattagaattatgtttgttatc2040catgcattggatcctacaaattggatagcccattgatcccttgtgatacaggtggcagaa2100gataagcgacccaagaagtatacagaagatactcaggcaagtatatgctgatcactcaac2160aaatgttgacaaggtgttctcacgtattatagagacaacagaacacccagcagctgctgc2220atcatttgcctccattatgtttgctccaatgggccagatatcctttcaggaggcactatc2280taggtgagatggaaaacccaacttgatgaatggctctattgcttacaaatatcagtttcc2340actttaacactgatcatctgcaggtgccaaaagcaggacattcccatttcccttatgtat2400gggaaagaagatccttgggttacaccttattggggtatcagagtcaagcagcaggtgcca2460gaagcaccctattatgaaatcagccctgccggtcactgtcctcacgacgaggttcctgag2520gtaactatcgcatgctgtgtagaaattatagtcccccccttgtatttatacaatatactc2580ccattgatcgttcataaaggtacaaacatatatctagagcaaactaccatcatgctataa2640acatgtaactttaaaatcgacagttaacaatccgaaaatttgagaagatctttgctggac2700ctgtgcattatccgtcaattttttcttcaaatttaaacctaaagcgagttcgaataaata2760aaatataaaaatatgtttgtaaattttgccttttgtttttatagtaaatatcaccgaact2820acatttcttttgtcaaaactatactttaagcagccacttcaaaactatactcaagcaacc2880cattcacagaactgtactctgtaaacataatatttcatacctacacttctatatttgcaa2940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