一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞珠蛋白-人乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其应用。

背景技术：

水产品在国人的日常生活饮食中已占有重要的位置，人们对水产品的喜食程度也进一步增强，确保其新鲜品质不仅是提升人们生活品质，更是人们饮食安全的保障。其中保质期长、柔软多汁、色泽鲜红、味道鲜美的水产品，深受消费者欢迎，日益成为水产品消费的主流。由于其在0-4℃加工、流通并不能完全抑制微生物的生长繁殖，水产品品质发生变化主要是由于其自身含有的大量细菌，如链球菌书、假单胞菌属、杆菌属等，导致其货架期短且色泽易变，妨碍其水产品制备及卫生安全。采取合适的保鲜方法延长水产品的货架期及保护色泽就成为推动水产品市场发展的关键。在水产品的加工过程中添加保鲜剂，是稳定冷鲜肉品质，延长货架期最为有效的手段。然而近年来，由于化学保鲜剂（如苯甲酸钠、对羟基苯钾酸酯、亚硫酸盐等）潜在致癌、致突变、致畸的可能性，加上新型化学合成保鲜剂开发越发艰难，使得天然保鲜剂（如含硫芳香油、抗菌肽等）越发受到人们的青睐。

乳铁蛋白肽（lactoferricin,lfcin）是一种新型抗菌肽，由胃蛋白酶作用乳铁蛋白n端释放的一段多肽，其几乎具备乳铁蛋白所有生物学活性，抗菌作用强，且源于哺乳动物，不含稀有氨基酸和外源化学成分，无毒性。人源乳铁蛋白肽（humanlactoferricin,hlfcin）人乳铁蛋白n端第18到40位氨基酸组成的一段多肽，由23个氨基酸组成，对大肠杆菌和白色念珠菌都有抗菌活性，在抑菌及防腐中应用广泛，是天然保鲜剂、畜禽饲料添加剂等良好的原料。

细胞珠蛋白（cytoglobin,cygb），最早在患有肝纤维化的脊椎动物肝星状细胞中发现，定位于染色体17q25的人cygb基因含有4个外显子和3个内含子，编码190个氨基酸残基，分子量约21.4kda。研究表明cygb主要存在于细胞质中，具有抗炎、抗纤维化、抗癌等作用，能够很好的清除氧自由基和过氧化物酶活性的作用。研究还发现cygb可在大肠杆菌表达系统中高效表达，可以显著降低产物对宿主毒性、且实现高产。

细胞穿膜肽（cell-penetratingpeptide,cpp），又称为蛋白转导域或膜转导肽，是一种由20个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽，能够运载生物活性物质如肽、蛋白、反义核苷酸和脂质体等许多物质，一般来源于可穿透生物屏障的富含碱性氨基酸的多肽或蛋白质。在cpps中，富含精氨酸的cpps研究最广泛，如hiv-1中的tat（101个aa）反式激活因子，tat^47-57是最短的cpps之一，含有11个氨基酸，含有6个精氨酸残基和2个赖氨酸残基已证明通过tat的n端连接的融合蛋白能够在体外转导几乎所有检测过的细胞类型。

中国发明专利cn108794635a公开了一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白、基因及其应用，它采用基因工程的方法构建牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合重组质粒，然后在真核表达牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白。然而由于溶菌酶与抗菌肽对基因工程宿主菌具有一定的细胞毒性，通常采用融合其他蛋白的形式进行表达，以减弱该细胞毒性。中国发明专cn108660147a一种一种利用hu蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，它将组蛋白样蛋白hu与牛乳铁蛋白肽融合在大肠杆菌中表达，之后纯化融合蛋白。然而这两种方法所用的融合蛋白本身对最终的产品功能没有帮助，主要方便纯化。

技术实现要素：

鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种细胞珠蛋白-人乳铁蛋白肽融合蛋白及应用，融合蛋白属分泌型，无需经过裂解，融合蛋白即具备乳铁蛋白肽酶的抗菌活性、细胞株蛋白的抗氧化性，同时表现出更好的储存稳定性。

本发明采用的技术方案是：

一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白，所述融合蛋白是由细胞株蛋白、人源乳铁蛋白肽串联构成。

所述融合蛋白的氨基酸序列为seqno.1。

所述细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白编码基因，其核苷酸序列为seqno.2。

进一步地，将所述细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白应用于制备抗菌保鲜剂中。

所述抗菌保鲜剂为水产品保鲜剂。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

（1）通过融合表达融合蛋白减轻抗菌肽对宿主菌的抑制；cygb的抗氧化特性有利于增加抗菌肽的储存稳定性，该融合蛋白4℃放置10d后抑菌抗菌（大肠杆菌，atcc25922）活力下降3.6％，20d后抑菌抗菌活力下降6.5％，30d后抑菌抗菌活力下降10.4％。

（2）大肠杆菌表达得到tat-cygb-hlfcin融合蛋白，属分泌型蛋白，无需经过裂解纯化，通过阳离子交换柱、凝胶过滤柱即可实现纯度95%以上的纯度，纯化方便。

（3）融合表达产物比人乳铁蛋白肽抗菌作用更强、抗菌谱更广。

（4）融合蛋白大肠杆菌制品对水产品具有保鲜作用，可延长水产品货架期至少6天。

附图说明

图1重组质粒的构建示意图。

图2收集每个洗脱峰样品进行sds-page电泳图。

图3融合蛋白westernblot分析图。

图4tat-cygb-hlfcin融合蛋白的储存稳定性。

图5tat-cygb-hlfcin融合蛋白经不同ph处理后对大肠杆菌(atcc25922)抑菌活性。

图6tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的菌落总数变化图。

图7tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的tvb-n值的变化图。

图8tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的感官评价分值的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1tat-cygb-hlfcin在大肠杆菌中小量表达

（1）细胞穿膜肽tat（seqno.3）、细胞株蛋白cytoglobin（seqno.4）、人源乳铁蛋白肽（seqno.5）依次串联构成细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽杂合蛋白。通过密码子优化软件对tat-cygb-hlfcin杂合蛋白基因编码序列交由基因合成公司进行全基因合成。

（2）设计全长拼接引物，通过限制性酶切位点ndei和ecori将tat-cygb-hlfcin基因插入到表达载体pet32a(+)中(图1)，通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终分别转到大肠杆菌bl21表达菌株中，获得含tat-cygb-hlfcin融合蛋白的工程菌株。取100μl重组菌的菌液均匀涂布到lb平板上（含终浓度50ug/ml的硫酸卡那霉素、20ug/ml的氯霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。将通过pcr确认的阳性重组子tat-cygb-hlfcin在lb培养基中37℃培养24h作为种子培养液。

（3）将种子液以10％（v/v）接种量接种到lb培养基中（含终浓度50ug/ml的硫酸卡那霉素、20ug/ml的氯霉素），待培养至od600为0.8，向试管培养液中加入终浓度0.25mmiptg，置于37℃诱导表达24h。

实施例2tat-cygb-hlfcin融合蛋白的分离纯化

（1）收集发酵全菌含上清液，离心获得上清液，经20mmtris-hcl（ph8.0）重悬并离心得到蛋白上清，通过阳离子交换（cmsepharosefastflow）层析、s-100分子筛层析和sephadexg-25凝胶过滤层析脱盐得到tat-cygb蛋白，sds-page电泳检测，westernblotting定性检查cygb蛋白。

（2）cm阳离子交换柱：柱体积20ml，uv检测波长为220~280nm，流速1.5ml/min的20mmtris-hcl缓冲液（ph8.0）平衡柱子；将发酵液上清50ml上样，使用上述缓冲液再次平衡柱子，再用含500mmnacl的上述缓冲液（ph8.0）作为洗脱液进行洗脱，流速1.5ml/min。收集完所有洗脱峰样品，对所有收集的样品进行sds-page电泳检测，检测结果如图2所示。

（3）s-100凝胶过滤进一步纯化：柱体积20ml，uv检测波长为220nm-280nm，流速1.5ml/min的20mmtris-hcl（ph8.0）平衡柱子，将cm层析柱纯化后经sds-page电泳检测的样品稀释3倍上样，使用上述缓冲液再次平衡柱子，再用含200mmnacl的上述缓冲液（ph8.0）作为洗脱液进行洗脱，流速1.5ml/min。

（4）cm阳离子交换柱浓缩：柱体积10ml，uv检测波长为280nm，20mmtris-hcl缓冲液（ph8.0）平衡柱子；s-100层析柱纯化的蛋白样品上样，再用含500mmnacl的上述缓冲液（ph8.0）作为洗脱液进行洗脱收集洗脱峰，流速2ml/min。

（5）g-25凝胶过滤脱盐：柱体积5ml，uv检测波长为280nm，用pbs缓冲液（ph8.0）平衡柱子，将浓缩的蛋白样品上样，用pbs缓冲液（ph8.0）洗脱，收集洗脱峰。流速5ml/min。收集得到纯度高于95%的融合蛋白tat-cygb-hlfcin，用cygb抗体进行westernblotting定性检查cygb蛋白，检测结果如图3所示。

实施例4tat-cygb-hlfcin融合蛋白抑菌谱的研究

（1）检测实施例2步骤（5）收集的融合蛋白样品对表1中所列菌株的抑菌活力。分别将各种菌培养于5ml的液体培养基摇床培养，培养条件如表1所列。待菌体生长到对数生长期时，分别按照实施例1方法的方法进行抑菌圈的测定。测量3次取平均值。

（2）培养基（g/l）组成。①lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，nacl10g，去离子水1l，ph值自然；②察氏培养基：蔗糖30g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g，去离子水1l，ph值自然；③营养琼脂：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂20g，去离子水1l，ph7.0；④胰胨大豆琼脂：胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、nacl5g，琼脂15g，离子水1l，ph7.3。⑤mrs培养基：胰蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4，葡萄糖20g，吐温801ml，七水磷酸氢二钾2g，三水醋酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，琼脂15g，去离子水1l，ph6.2；⑥ypd培养基：酵母膏3.0g，麦芽提取物3.0g，葡萄糖10.0g，蛋白栋5.0g，琼脂20.0g，去离子水1l，ph6.2。

（3）tat-cygb-hlfcin融合蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌，和以大肠杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌为代表的革兰氏阴性菌均有抑菌效果；其中对金黄色葡萄球菌效果最为明显，对大肠杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌也有较好的抑制效果，对真核生物的白色假丝酵母也具有同样强度的抑制作用，然而对米曲霉、发酵乳杆菌未有明显的抑制作用，tat-cygb-hlfcin融合蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很好的抑菌效果（表1）。

表1不同指示菌的培养条件和tat-cygb-hlfcin融合蛋白的抑菌效果

注：++++：表示抑菌圈直径大于20mm；+++：表示抑菌圈直径在15-20mm；++：表示抑菌圈直径在10-15mm；+：表示抑菌圈直径在小于10；/：表示无抑菌效果。

实施例3tat-cygb-hlfcin融合蛋白的稳定性研究

1、tat-cygb-hlfcin融合蛋白的热稳定性研究

将实施例2步骤（5）制备的融合蛋白tat-cygb-hlfcin分别在60℃、80℃、100℃、120℃下分别处理10min，30min，60min，以大肠杆菌作为指示菌，测试抑菌活力，以未处理的样品为对照。结果由图4可知，tat-cygb-hlfcin融合蛋白经过60℃和80℃处理60min，其活力无明显下降。100℃水浴加热10min活力下降9.4％，加热60min，其活力下降较为显著达到16.6％；120℃在灭菌锅内加热10min其活力下降17.2％，与沸水中加热60min有相近的活力损失；120℃加热60min时，其活力损失达30.7％，由此可见，融合蛋白具有较好的热稳定性。

2、tat-cygb-hlfcin融合蛋白的酸碱稳定性研究

将实施例2步骤（5）制备的融合蛋白tat-cygb-hlfcin分别在ph4、5、6、7、8、9、10条件下处理1h，以大肠杆菌（atcc25922）作为指示菌，测试抑菌圈直径，以未处理的样品为对照，结果如图5所示，在ph为8.0的时候抗菌活力较强，在较酸的条件下，其活力较对照组活力下降显著，随着ph的下降，其对大肠杆菌的抑菌效果呈现下降趋势，当ph升高到11.0时，其活力下降显著。由此可见，在发酵液自然ph为7.5~8.0，其稳定性较好。

实施例4大肠杆菌高密度发酵表达获得tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品

（1）从lb平板上挑取实施例1构建的含tat-cygb-hlfcin杂合蛋白基因的重组菌单菌落接种于5mllb液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜；12h后以1:100的体积比例将菌液接种至300mllb培养基（含100mg/lamp），37℃振荡培养过夜至od600达0.8，作为接种发酵罐的种子液。

（2）50l发酵罐，加入20l的fml乳糖诱导培养基（含终浓度100mg/lamp），121℃灭菌20分钟，调节温度至37℃，用氨水调节ph至7.8。转速控制在300-800rpm之间，通过磷酸溶液和氨水进行ph调整，同时保证溶氧不低于20％。接种24h后，填加补料培养基（组成同实施例1），速度10~15ml/h。72h后待菌体量不再增加，结束发酵。发酵结束后放料，发酵液经喷雾干燥，得到融合蛋白tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品。另外也对不含有tat-cygb-hlfcin基因的bl21宿主菌进行同样的发酵。

实施例5含融合蛋白tat-cygb-hlfcin的大肠杆菌制品的水产品保鲜实验

1、实验方法：

（1）样品处理：购买鲜活鲈鱼，速运（0.5h内）至实验室，采用无菌水清洗残留污渍、血块，自然沥干。取其脊背部鱼肉，切成大小相近，重（40±0.5）g鱼肉块，pe包装袋真空包装，4℃冷藏保存。

（2）tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品的准备：取tat-cygb-hlfcin大肠杆菌干粉制品（待测制品），用无菌pbs缓冲液（ph8.0）溶解至蛋白质量浓度为10mg/ml。将抗生素（氨苄青霉素）用生理盐水稀释，至质量浓度为320μg/ml，4℃冰箱保存备用。

（3）最小抑菌浓度（mic）测定：将对数生长期的大肠杆菌（atcc25922）和金黄色葡萄球菌（atcc25923）菌液稀释后加入于96孔板中，第1孔加入126μl菌液，剩余7孔分别加入70μl菌液。第1孔加入14μl待测制品，混匀；吸出70μl到第2孔，混匀；吸出70μl到第3孔，混匀；如此依次稀释到第8孔，弃去70μl。用保鲜膜密封好，37℃静置过夜(12～16h)。对照组加入稀释的氨苄青霉素（阳性对照）14μl。观察结果，以≥50%生长受抑制者为阳性，根据出现阳性孔的最高稀释倍数计算mic。每组做3次重复，取平均值，即得到氨苄青霉素和抗菌肽的mic。

（4）tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品使用液：用无菌pbs缓冲液（ph8.0）稀释待测制品至1倍mic浓度。自制喷瓶，并设定其一次喷涂的面积。使用前以75%酒精浸泡灭菌，然后用pbs缓冲液（ph8.0）溶液冲洗。

（5）材料处理：将鲈鱼块分为2组，每组10块。用灭菌喷瓶将tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品使用液均匀喷涂于各鱼肉块表面，对照组肉样喷洒同体积的无菌pbs缓冲液。然后分别置于无菌保鲜盒中摆放均匀，用聚乙烯保鲜膜封口包好，放入（4.0±0.5）℃冰箱中冷藏。

（6）结果分析：①计算冷藏期间菌落总数的变化：从将冷藏肉放入冰箱开始计时(以0d计)，每隔1d取样一次，进行菌落总数测定。测定方法按gb/t4789.2-2010进行并作适当调整，鲈鱼的菌落总数可接受限度为≤6logcfu/g。本试验取样量为10g，37℃需氧培养36h后取出进行菌落计数。②计算抑菌率：抑菌率=［（对照组－试验组）/对照组］×100%。③以鲈鱼的色泽、气味、质地和外观作为评价指标进行感官评定，由8名成员组成评定小组，具体评分项及参考标准见表2。将评分成员的不同敏感度，调整权重分别为0.4、0.3、0.2、0.1，计算加权平均分。评分终点为2，不再适合食用。④测定挥发性盐基氮（tvb-n）值，按照gb2733－2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》的规定，一级鲜度淡水鱼tvb-n≤13mg/100g，二级鲜度淡水鱼为tvb-n≤20mg/100g。

表2鲈鱼感官评分标准

2、实验结果

（1）鲈鱼4℃贮藏过程中菌落总数变化（图6），贮藏期间tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品处理组菌落总数上升趋势显著低于对照组（p<0.01），对照组贮藏至第6d，菌落总数上升至（5.89±0.289）logcfu/g，处理组贮藏至第12d，菌落总数上升至（6.09±0.182）logcfu/g。

（2）tvb-n值是反映贮藏期间微生物及酶作用促进水产品中蛋白质分解，进而产生氨和胺类等具有挥发性的碱性含氮化合物的含量。由图7可知，0d的tvb-n值为（3.95±1.098）mg/100g；对照组tvb-n值上升趋势较快，至第6d达到（19.95±2.682）mg/100g为二级鲜度，储存至第8d超过二级鲜度。处理组在贮藏至第12d，其tvb-n值分别为（20.45±2.056）mg/100g，可以看出tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品处理显著抑制贮藏期间tvb-n值得上升，此结果与上述菌落总数结果相似，表现出显著相关性p<0.01。

（3）鲈鱼贮藏过程中的感官得分变化如图8所示，通过感官评分值和相关性分析得出，贮藏期间感官评分值变化趋势与多项理化指标值表现出显著相关性，说明和合理的感官评价能有效体现鲈鱼肉贮藏期间品质变化情况。综合各指标结果，tat-cygb-hlfcin大肠杆菌制品处理能有效保持鲈鱼片品质的同时延长货架期至少6d。

sequencelisting

<110>泉州师范学院

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