一种单基因病全基因组永生基因库的构建的制作方法

本发明涉及生物医学领域的一种单基因病全基因组永生基因库的构建，主要用于遗传病全基因组的收藏和产业化制备，为临床、教学、科研、制药和诊断提供可再生利用的基因组。

背景技术：

为了更好地开展发病机制、临床治疗和实验诊断等研究，已有越来越多的国内外机构专注于各种病例样本的收藏及其样本库的构建。

在美国、英国、日本和中国都已建有各种类型的细胞库，如美国的标准细胞库（atcc）、人类遗传突变细胞库（hgmr）、细胞衰老细胞库（car）；英国的胚胎干细胞库；日本的乳牙干细胞研究库；中国的重要医学生物资源保藏库、中国不同民族永生细胞库、脐血干细胞库、肿瘤细胞库、长寿老人永生细胞库等。

近年来，世界各国开始关注各种基因库的构建，继美国的ncbi基因库、日本的ddbj基因库和欧盟的ebi基因库之后，中国经国家发改委、卫生部、财政部等部委批复，于2011年开始构建全球第四个国家基因库，并于2016年开始运营，成为目前世界上最大的基因库，该基因库采用基因信息数据库和生物样本资源库相结合的模式，建立样本资源、生物信息数据处理、存储与管理系统网络，主要存储中国特有遗传资源、生物信息和基因数据，包括头发、牙齿、精子卵子、血液、组织、尿液、细胞、干细胞、个人遗传家系、医疗数据、植物资源、动物资源、种子等生命资源，作为国家公益性创新科研及产业基础设施项目，拟为疾病的前瞻性研究提供样本资源，为疾病的诊断、预测、个性化医疗奠定基础，以提高我国生命科学研究水平和国际影响力，促进我国生物产业的发展。

但各种现有基因库的特点在于，不是永生基因库，难以可再生利用基因库中的样本资源，基因库中收藏的样本用多少就少多少，在不断利用样本的同时需要不断收藏样本。虽然从现有基因库中取出的样本可通过聚合酶链反应（pcr）扩增，从而提高相应基因资源的利用效率，但pcr扩增对象为有限长度的特定dna序列，所以从基因库中所取样本的其他dna序列通常因在本次研究中用不上而被废弃，造成了资源浪费，所以对于其他dna通常同样是不可再生性利用。而在实际工作中，各种基因病几乎都为单基因病，发病率通常为几千、几万、几十万甚至几百万、几千万分之一，病例样本很难获取，所以，必须研究一种全基因组永生基因库的构建方法，使所建基因库中收藏的样本资源可通过细胞水平的全基因组扩增，达到可再生利用。

据文献报道，1975年kohler等将具有抗体产生基因的b淋巴细胞与具有无限扩增性能的骨髓瘤细胞在体外融合，得到兼具骨髓瘤细胞无限繁殖和b淋巴细胞分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中来源于b淋巴细胞的抗体产生基因随着杂交瘤细胞株的繁殖而扩增，因被用于单克隆抗体的制备而获得诺贝尔奖。

本发明通过改造鼠sp2/0瘤细胞，并通过细胞融合将基因病细胞的全基因组移植鼠sp2/0瘤细胞，使之收藏于鼠sp2/0瘤细胞内并获得能随鼠sp2/0瘤细胞的无限繁殖而扩增以及能长期冻存于-196℃液氮的性能，以此建立一种全基因组永生基因库的构建方法，达到可再生利用遗传基因的目的。

技术实现要素：

为了解决现有基因库基因资源的不可再生利用问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种单基因病全基因组永生基因库的构建方法，以收藏和可再生利用单基因病基因组资源。

本发明的目的是这样实现的：通过构建sv40lt-plxsn重组载体并将之转染sp2/0细胞而改良sp2/0细胞的永生化特性，以及标记上新霉素抗性基因，以建立基于sp2/0细胞改良的g418和hat双筛选杂交瘤技术，用于制备单基因病基因杂交瘤，使单基因病单细胞全基因组移植并贮存于改良的sp2/0细胞内，从而使单基因病基因随sp2/0杂交瘤细胞的无限繁殖而扩增，随sp2/0杂交瘤细胞的冻存而冻存，进而建立单基因病全基因组永生基因库。

较具体地说，构建含新霉素抗性基因的逆转录病毒载体（plxsn），将之与猴肾大t抗原基因（sv40lt）在相同的条件下进行ecori/bamhi内切酶双酶切及t4dna连接酶连接，进而经聚合酶链反应（pcr）鉴定，构建重组逆转录病毒载体sv40lt-plxsn，用标准的磷酸钙沉淀法将sv40lt-plxsn转染至对数生长期的sp2/0细胞内，以g418筛选阳性克隆，获得永生化特性改良和新霉素抗性基因标记的sp2/0细胞，然后与单基因病基因突变细胞混合，在融合剂（聚乙二醇）的作用下，发生细胞融合，使基因突变细胞内的全基因组植入并贮存于sp2/0细胞内，经g418和hat联合筛选，获得同具两亲代细胞遗传物质的杂交瘤细胞，使杂交瘤细胞内的单基因病单细胞全基因组能够随着杂交瘤细胞的无限繁殖而扩增，继之通过冻存sp2/0杂交瘤细胞而建立单基因病永生基因库。

本发明基于具有无限生长特性的鼠sp2/0瘤细胞能与具有抗体产生特性的鼠免疫b细胞融合而制备同具两亲代细胞遗传特性的杂交瘤技术，其中来源于免疫b细胞的抗体产生基因随着杂交瘤细胞的无限繁殖而扩增，被用于单克隆抗体的制备，称为淋巴细胞杂交瘤技术或单克隆抗体制备技术，已得到广泛应用。本发明在将单克隆抗体制备技术转用于单基因病基因的扩增时，即将人单基因病的基因突变细胞与鼠sp2/0瘤细胞融合，制备单基因病杂交瘤细胞，以通过培养单基因病杂交瘤细胞来扩增单基因病的突变基因时，发现存在以下3个问题，第一，单基因病杂交瘤细胞边贴壁生长边漂浮死亡，总有1/2～1/3左右的细胞因死亡而漂浮在培养液中，活细胞贴壁生长的汇合度一般为30～50%，通常不会达到80～90%以上的理想汇合度；第二，单基因病杂交瘤细胞边贴壁生长边贴壁死亡，通常会有1/2～1/3左右的细胞贴壁死亡，通常不会达到80～90%以上的活细胞贴壁生长的理想汇合度；第三，人外周血分离的单个核细胞中主要含有淋巴细胞和单核细胞，前者寿命约为7天，后者寿命为数个月甚至更长，而细胞融合的结果会有以下几种细胞，即有效融合细胞（鼠sp2/0瘤细胞与人基因突变细胞融合而形成的融合细胞）、无效融合细胞（鼠sp2/0瘤细胞之间、人淋巴细胞之间、人单核细胞之间、人淋巴细胞与人单核细胞之间融合所形成的融合细胞）、未融合细胞（鼠sp2/0瘤细胞、人淋巴细胞、人单核细胞），在融合实验中，仅希望有效融合细胞生长，而无效融合细胞和未融合细胞死得越早越有利于有效融合细胞的生长，现有技术是采用hat筛选使鼠sp2/0瘤细胞及其相互融合细胞在7～14天死亡，而淋巴细胞、单核细胞及其融合细胞均采用自然死亡法，无人为的杀灭方法，即未融合的淋巴细胞、淋巴细胞之间形成的融合细胞需7天开始死亡，未融合的单核细胞、单核细胞之间形成的融合细胞及单核细胞与淋巴细胞形成的融合细胞能活数个月甚至更长时间，不利于有效融合细胞生长。

上述的第一和第二个问题与单基因病杂交瘤细胞的生长特性有关，本发明的解决方案是将具有永生化特性的sv40lt通过所构建的sv40lt-plxsn重组逆转录病毒载体转染鼠sp2/0瘤细胞，进而通过细胞融合使单基因病杂交瘤细胞dna整合有sv40lt，从而改良了单基因病杂交瘤细胞的永生化特性，减少漂浮死亡和贴壁死亡的细胞，使细胞处于对数生长状态，增加细胞生长的汇合度。

对于上述的第三个问题，本发明的解决方案是将能抵抗g418的新霉素抗性基因标记所构建的sv40lt-plxsn逆转录病毒载体，转染鼠sp2/0瘤细胞，进而通过细胞融合使单基因病杂交瘤细胞dna整合有新霉素抗性基因，当在细胞融合中采用g418筛选时，鼠sp2/0瘤细胞及其融合细胞中因带有新霉素抗性基因而不被g418杀死，但其他细胞在3～7天内被g418杀死。

所以本发明用于单基因病永生基因库构建的细胞融合特点是，构建含sv40lt和新霉素抗性基因的sv40lt-plxsn载体，经转染鼠sp2/0瘤细胞及其细胞融合而导入杂交瘤细胞，采用g418和hat联合筛选；sv40lt增强了杂交瘤细胞的永生性，新霉素抗性基因使杂交瘤细胞抵抗g418杀灭；鼠sp2/0瘤细胞及其无效融合细胞在hat筛选中死亡；人淋巴细胞、人单核细胞以及人淋巴细胞之间、人单核细胞之间、人淋巴细胞与人单核细胞之间形成的无效融合细胞在g418筛选中死亡，只有有效融合的杂交瘤细胞才能在g418和hat联合筛选中生长；由此制备的单基因病杂交瘤细胞可用于收藏、冻存和扩增单基因病基因，建立单基因病永生基因库。

附图说明

图1是本发明含有sv40lt的杂交瘤细胞的第5代细胞生长状态图。

图2是不含sv40lt的杂交瘤细胞的第5代细胞生长状态图。

图3是本发明经g418和hat联合筛选至第7天时的无效细胞死亡状态图。

图4是本发明以hat筛选至第15天时的无效细胞生长状态图。

在图1中，采用了本发明提出的经sv40lt-plxsn转染的sp2/0细胞进行细胞融合，所制备的杂交瘤细胞中因含有sv40lt基因而呈良好的生长状态，杂交瘤细胞传代培养2～3天时，贴壁细胞呈密集生长，几乎未见贴壁的死亡细胞，几乎没有漂浮的死亡细胞，杂交瘤细胞传代培养2～3天时的汇合度达到80%以上。

在图2中，采用了传统的sp2/0细胞，即采用未经sv40lt-plxsn转染的sp2/0细胞进行细胞融合，融合细胞传代培养2～3天时，可见有大量的杂交瘤细胞因死亡，细胞传代培养3天后，边长边死，图中细胞形态不良，其中变黑细胞均为死亡细胞，活细胞的汇合度总不超过30～60%。

在图3中，采用了本发明提出的以g418和hat双筛选法，筛选至第7天时，几乎所有的无效细胞（只有sp2/0细胞与人细胞融合形成的杂交细胞称为有效细胞，其余的融合细胞或未融合细胞均称为无效细胞）已转变为无反光性的细胞或为无反光性的点状，即无效细胞已经死亡，以免利用营养和占用生长空间，影响有效细胞的生长。

在图4中，采用了传统的筛选方法，即仅用hat筛选，筛选至第15天时仍有无效细胞生长，如图示中的梭形、圆形及不规则形细胞仍能在hat筛选中生长，细胞呈反光状态，仍未被hat杀死，这些无效细胞会利用培养基中的营养物质和占用生长空间，不利于有效融合细胞的生长。

具体实施方式

下面结合图1、图2、图3和图4，对本发明的实施方案作具体的描述。

一、重组逆转录病毒载体（sv40lt-plxsn）的构建

1、试剂：plxsn逆转录病毒载体购自美国clontech，sv40dna（strain776）购自美国invitrogen，pcr扩增试剂盒和磷酸钙沉淀转染试剂盒购自美国invitrogen，e.colidh5-alpha大肠埃希氏杆菌为本单位保存，endotoxin-free的质粒纯化试剂盒购自德国qigen，ecori、bamhi内切酶购自立陶宛fermentas，t4dna连接酶购自德国roche公司，新霉素衍生物g418购自美国sigma公司，胎牛血清、polybrene和dmem培养基购自美国gibcol公司。

2、sv40lt高保真pcr的扩增：以sv40dna（strain776）为模板，扩增片段长度为2400bp，50µlpcr反应体系。10mmtris（ph9.2），50mmkcl，0.01%gelatin，0.1%tritonx-100，1.5mmmgso4，0.3mmdntpmixture，20pmol上游引物sv40lt-1和下游引物sv40lt-2，去离子水补足至50ul，2.5upfxtaq酶（invitrogen）。循环参数：942min℃，9415s℃，5530s℃，683min℃，35个循环；72℃延伸10min；终止4℃。

3、感受态大肠杆菌的制备：分别用ecori/bamhi内切酶双酶切sv40lt的pcr片段和逆转录病毒载体plxsn，并经过纯化；用t4连接酶22℃连接，转化至感受态e.colidh5-alpha菌，37℃培养过夜，经氨苄抗性筛选，挑选无色菌落接种于3mllb液中，37℃培养24h，用质粒抽提试剂盒抽提重组质粒。

4、含sv40lt重组逆转录病毒载体的pcr鉴定：随机挑取8个克隆进行鉴定，应用sv40lt的p1（p1：5'-acaaatgtggtatggctgat-3'）和p2（p2：5'–gtggctatgggaactgga-3'）为引物，以单个菌落的少许菌体为模板，同时以plxsn逆转录病毒载体作为阴性对照模板，进行pcr扩增，将pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

5、含sv40lt重组逆转录病毒载体的酶切鉴定：重组逆转录病毒载体sv40lt-plxsn进行ecori/bamhi内切酶双酶切分析，酶切产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳。

6、重组逆转录病毒载体sv40lt-plxsn的dna测序：由上海生工生物工程技术有限公司完成，双向测序。正向测序引物plxsn（nt1398-1420）为：5’-cccttgaacctcctcgttcgacc-3’，反向测序引物plxsn（nt1537-1515）为：5’-gagcctggggactttccacaccc-3’。

7、sv40lt-plxsn重组质粒提取：经酶切和测序鉴定后将含有sv40lt重组质粒的大肠埃希氏菌扩大培养，用endotoxin-free的质粒抽提试剂盒抽提sv40lt-plxsn重组质粒。

二、鼠sp2/0瘤细胞性能（永生性和新霉素抗性）的改造

1、鼠sp2/0瘤细胞准备：取sp2/0细胞，37℃解冻后培养，收集生长状态良好的细胞。

2、鼠sp2/0瘤细胞重组质粒包装：取10µgsv40lt-plxsn重组质粒，用标准磷酸钙沉淀法转染至对数生长期的鼠sp2/0瘤细胞，转染24h后，用pbs冲洗培养的细胞，用2ml的10%dmso处理2分钟，弃去dmso，更换10%胎牛血清的dmem培养液，转染72h后。

3、重组质粒包装sp2/0细胞的筛选：用500µg/ml的g418进行药物压力筛选1～3周，待细胞克隆生长至1.0～2.0cm时，挑取细胞克隆，扩大培养，冻存细胞备用。

4、质粒包装sp2/0细胞的永生性观察：主要观察细胞的生长力，包括细胞培养的倍增时间、最大汇合度、漂浮死亡细胞数、贴壁死亡细胞数。因质粒包装sp2/0细胞获得了sv40lt基因，经细胞融合后，将sv40lt基因转入了融合细胞内，所以也增强了融合后的杂交瘤细胞的永生化性能，如图1和2所示/所述，含有sv40lt的杂交瘤细胞的生长状态明显改良。

5、质粒包装sp2/0细胞的新霉素抗性观察：因质粒包装sp2/0细胞获得了plxsn逆转录病毒载体中的新霉素抗性基因，所以能抵抗新霉素衍生物g418，质粒包装sp2/0细胞经细胞融合后，将新霉素抗性基因转入到融合细胞内，所以使融合后的杂交瘤细胞也带有新霉素抗性基因，对新霉素衍生物g418不敏感而不被g418杀死，而不含有新霉素抗性基因的无效细胞能被g418杀死，如图3所示，经g418和hat联合筛选后所有无效细胞均被杀死，如图4所示，经hat筛选后的无效细胞仍未被杀死。

三、人-鼠杂交瘤细胞的制备

1、单基因病细胞的准备：包括基因缺失、重复、替换等突变的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞或绒毛组织细胞；基因突变包含病因未明突变或目标致病性突变。临用前以dmem培养液（基础培养基）调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

2、sp2/0细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的重组质粒包装sp2/0细胞，立即放入热水解冻，融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加dmem培养液，置co2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将sp2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min,重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80%左右。

3、细胞融合方法：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000µl的30%peg3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25ml基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟（除去结合的抗体），立即以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mlhat培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5%co2培养箱中培养。

4、融合细胞的接种：每例融合细胞以10%胎牛血清悬浮，接种于96孔板，共8排，每排12孔，每孔100µl，37℃培养12～24h。

5、融合细胞的筛选

（1）g418和hat双筛选试剂的配方：g418贮存液：称取300mgg418加入3mlpbs溶液，完全溶解后，以0.22µm过滤器过滤，-20℃保存；hat贮存液：以dmem将hat原液配成浓度为50×的贮存液；g418和hat双筛选应用液：以10%胎牛血清配制g418浓度各为200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml而hat浓度均为1×或2×的应用液。

（2）双筛选方法：在96孔板的第1和2排、第3和4排、第5和6排、第7和8排中分别加入g418浓度为200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml而hat浓度均为1×的g418和hat双筛选应用液200µl；37℃培养4天，吸弃培养液，在各排中分别加g418浓度为200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml而hat浓度均为2×的g418和hat双筛选应用液200µl，37℃继续培养，5～7天后可见杂交瘤细胞克隆。

（3）杂交瘤细胞的扩大培养：待杂交瘤细胞生长至96孔板底面积的1/3～2/3时，转种到24孔板或12孔板，再转种至25cm培养瓶，然后冻存或做进一步的鉴定试验。

四、杂交瘤细胞的验证

（1）染色体核型的验证：对比分析sp2/0细胞和杂交瘤细胞的染色体核型，计数50个分裂象，观察杂交瘤细胞中染色体数目的变化。sp2/0细胞的染色体数目为62条，杂交瘤细胞的染色体数目约为人染色体数目与sp2/0细胞染色体数目之和（有部分人染色体在细胞融合后没有独立存在，已与sp2/0细胞的染色体发生融合）。

（2）致病基因的验证：采用荧光原位杂交（fish）技术和/或pcr技术（qf-pcr/rt-pcr/荧光定量pcr/实时pcr）扩增后dna电泳和/或测序技术（一代测序/hiseq测序/目标区域测序/深度测序/gc校正及信息对比判定cnv/滑动窗口分析测序数据/二元分割一双向节段调节阈值分析测序数据）验证致病基因并进行分类。

（3）杂交瘤细胞的稳定性：每隔3个月取1支冻存的杂交瘤细胞，进行复苏培养，观察细胞的存活率及传代培养情况，传5-10代后进行致病基因的pcr或测序验证，以发现致病基因的稳定性，稳定者继续冻存。

五、永生基因库的构建

（1）冻存杂交瘤细胞：按细胞株的常规冻存方法，将杂交瘤细胞冻存于-196℃液氮中。

（2）配置信息化平台：用于记录杂交瘤细胞株来源、基因组序列、定期验证结果等信息。

（3）单基因病单细胞全基因组移植并贮存于杂交瘤细胞内，而杂交瘤细胞冻存于-196℃液氮中，当需要使用单基因病基因时可通过提取杂交瘤细胞进行体外培养以复制细胞，进而经dna提取或pcr扩增而可再生利用单基因病基因。

六、永生基因库的应用实例

1、制备质控参考株：按dna提取试剂盒说明书，提取单基因病杂交瘤细胞株dna，测定目标单基因病基因dna的浓度，按基因检测试剂盒规定的dna用量，换算为相当的细胞数量，据目标单基因病基因dna浓度和细胞含量的关系以及目标单基因病基因的类型分别配制、分装杂交瘤细胞株，作为单基因病基因检测的校准参考株。

2、用于基因检测的室内质控：判断检测结果的准确性：选择2株校准参考株，与疑含相同目标致病基因的被测标本在相同条件下检测，如果质控参考株所含有的已知目标致病基因被全部检出，而不含有的目标致病基因不被检出，说明检测系统处于质控在控状态，同批次的同类目标致病基因检测结果可靠，可发出报告；绘制基因检测的室内质控图：将质控参考株的目标致病基因作为阳性对照，非目标致病基因的突变作为阴性对照，将每批次的阳性和阴性对照检测结果记录在室内质控图上，以监测室内检测方法的稳定性及是否在控。

3、校准基因检测平台：根据质控参考株的室内质控结果，如果发现检测系统并非处于质控在控状态，则应查找失控原因，包括校准或更换检测仪器和检测试剂、改用数据分析软件和突变基因比对数据库及其比对方法。

4、验证数据分析软件：在检测仪和检测试剂都处于质控在控的前提下，可用参考株的检测数据验证数据分析软件是否准确可靠，分析其在数据的筛选和拼接等处理中的准确性。

5、验证基因数据库：在检测仪、检测试剂和分析软件及其分析方法都处于质控在控的前提下，可用质控参考株的检测数据验证基因突变比对数据库的可靠性，分析其在参考株目标突变基因的比对和筛选中是否与所含有的已知突变基因相符。

6、佐证突变基因的检测结果：将质控参考株与被测标本在相同条件下检测所得到的检测数据同时与比对数据库进行比对，如果参考株被检出的突变基因与所含有的已知突变基因相符，则被测标本所检出的与参考株相同的突变基因应判断为可靠的结果。

7、用于基因检测的室间质评：质量管理机构可定期将质控参考株发放到各参评单位，进行基因检测的质量评价，根据回报的结果评价各参评实验室基因检测的准确性及各室检测结果的差异，以便及时发现质量问题并及时整改。

8、互认室间检测结果：根据室间质评结果，如果发现相同质控参考株因检测单位的不同而给出不同的结果，则说明室间质量有问题，应查找原因，统一改用可靠的基因检测系统，确保各单位检测结果的准确性和一致性，促使各室检测结果的互认，以免就诊者每到一家医疗单位就诊各需取样复检。

9、创建以质控参考株为比对的基因检测方法：传统的基因检测方法是通过基因芯片和测序数据与基因数据库的比对得到基因诊断或筛查结果，例如将基因检测数据与正常突变数据库比对，除去正常突变基因，再与致病突变数据库比对，得到同类致病突变基因。这种比对因被测人种和检测条件等不同，缺乏可比性，创建质控参考株替代现有基因数据库进行比对，基于被测标本与参考株具有相同检测条件的相同检测数据而推断两者具有相同的突变基因，依此作出基因诊断或筛查报告。