人绒癌耐药细胞株的制作方法

本发明涉及甲氨蝶呤诱导的人绒癌耐药细胞株。
背景技术：
：绒毛膜癌(简称绒癌，choriocarcinoma)，是一种来源于胚胎滋养细胞的恶性肿瘤，可继发于任何类型的妊娠，包括葡萄胎、流产和异位妊娠或足月妊娠。世界范围内的绒癌发生率差异明显，亚洲(约每120～200次妊娠中发生1例)和拉丁美洲的发生率明显高于欧洲和北美洲(约每2000次妊娠中发生1例)。该肿瘤恶性程度极高，发生转移早而广泛，在化疗药物问世前，其死亡率可高达90％以上。由于该肿瘤发生于育龄期妇女，且患者多渴望保留生育功能，故化疗而非手术治疗是其主要治疗手段。自从甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)、放线菌素d(dactinomycin，更生霉素，act-d)、氟尿嘧啶(fluorouracil，5-fu)、依托泊苷(etoposid，vepesid，vp16)等一系列化疗药物有效应用于治疗该肿瘤后，绒癌的治愈率目前已达80％～90％，使其成为通过化疗能治愈的首个妇科实体肿瘤。然而，仍有约20％的绒癌患者因发生耐药而达不到治愈目的。化疗耐药发生复杂，大致可分为原药耐药和多药耐药，原药耐药是指肿瘤细胞只对某种特定结构和功能的药物产生耐药，而对其他药物不产生交叉耐药。绒癌患者发生的耐药多属此类，一般更换治疗药物或化疗方案后可获得改善。多药耐药是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药后，对其他多种结构不同、作用靶位不同的药物也产生耐药的现象。难治性、复发性绒癌患者多属于此类，而这也是绒癌患者化疗失败的主要原因。甲氨蝶呤是一种叶酸类似物，对二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase)具有强大而持久的竞争性抑制作用，药物与酶结合后，使得核苷酸代谢受阻，dna合成障碍，从而起到特异性杀伤增殖期细胞的作用。甲氨蝶呤不仅可单独使用，且可与其他药物如放线菌素d、氟尿嘧啶、依托泊苷、环磷酰胺等联合使用，对于低危型和高危型的妊娠滋养细胞肿瘤均有良好的治疗作用。甲氨蝶呤作为绒癌化疗的一线用药，目前已被广泛应用于临床，研究绒癌细胞对甲氨蝶呤耐药性的产生机制对于改善绒癌患者化疗效果具有重要的意义，而建立耐药细胞株也正是此项工作开展的重要前提与工具。绒癌细胞系jar和jeg-3均来源于名为“wo”的人绒毛膜癌组织中建立的单克隆细胞株，是研究绒癌的常用细胞株。根据文献，肿瘤耐药细胞株的建立通常有两种方法，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断给药法。通过比较上述两种方法，研究者认为不同的诱导方式得到的耐药细胞株其耐药机制和耐药程度也不尽相同，而普遍观点则是持续诱导比冲击诱导更容易产生耐药性。因此本发明选择该法来诱导耐药细胞株。持续诱导法以肿瘤细胞最终能在特点浓度化疗药物中稳定生长作为诱导成功的判定标准。肿瘤细胞耐药程度判定常用耐药指数(resistantindex，ri)来表示，它是耐药细胞半数抑制浓度(50％inhibitoryconcentration，ic50)与亲代细胞半数抑制浓度的比值。snow等按耐药指数高低将耐药性分为低度(<5)、中度(5～15)和高度(>15)。技术实现要素：本发明的目的是建立绒癌耐药细胞株jar/mtx、jeg3/mtx，为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等。本发明采用如下技术方案：人绒癌耐药细胞株jar/mtx，其保藏编号为：cctccno:c2018245。分类名为：人绒癌细胞系，于2018年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉大学；进一步地，jar/mtx耐甲氨蝶呤的指数为791.50。进一步地：jar/mtx建株完成后撤药培养3个月，液氮冻存半年后复苏细胞，耐药性为原来的92.3％。人绒癌耐药细胞株jeg3/mtx，其保藏编号为：cctccno:c2018246。分类名为：人绒癌细胞系，于2018年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉大学；进一步地jeg3/mtx耐甲氨蝶呤的指数为1040.04。进一步地jeg3/mtx建株完成后撤药培养3个月，液氮冻存半年后复苏细胞，耐药性为原来的90.1％。本发明的有益效果为：jar/mtx、jeg3/mtx能在88ummtx中稳定生长、传代、复苏，对mtx的耐药指数各为791.50、1040.04，除对mtx耐药外，对vp-16、5-fu、taxol、actd有交叉耐药。且耐药细胞株建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性，两株耐药细胞株的耐药性均为原来的90％以上，耐药细胞株的耐药稳定性极好。本发明为研究肿瘤耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选和评估化疗药物、开发肿瘤耐逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药肿瘤细胞模型。附图说明图1a～d分别为为对数生长期的jar、jeg3、jar/mtx、jeg3/mtx细胞形态图；图2为jar、jar/mtx；jeg3、jeg3/mtx细胞生长曲线图。具体实施方式本发明的耐药细胞株建立步骤如下：(1)人绒癌jar细胞株，复苏后用rpmi-1640培养基(含10％胎牛血清)于5％co2、37℃的培养箱中常规培养；人绒癌jeg3细胞株，复苏后用ebss-mem培养基(含10％胎牛血清)于5％co2、37℃的培养箱中常规培养；(2)取对数生长期的jar、jeg3细胞，换新鲜培养基，加入mtx，作用浓度为11um，在5％co2、37℃的培养箱中常规培养，24h后pbs冲洗3遍，加入无mtx的培养基继续培养，待培养瓶内存活的细胞长满至80％左右传代，此时敏感细胞死亡上浮，不敏感细胞继续存活，但继续存活的细胞生长缓慢形态改变；(3)重复(2)3-5次后，细胞状态良好,再行下一浓度的mtx诱导，并增加药物浓度，每次增加mtx的药物浓度为11um；(4)直到细胞jar、jeg3能在88um的mtx中稳定生长、传代及复苏的jar/mtx、jeg3/mtx细胞株，历时1年。用光学显微镜观察细胞形态、流式细胞分析仪检测其周期分布的改变、cck-8法绘制细胞生长曲线、检测细胞耐药指数和耐药细胞株的稳定性、qrt-pcr检测多药耐药基因mdr-1的表达来进行绒癌耐药细胞株jar/mtx、jeg3/mtx的生物学特性的鉴定。我们发现，jar/mtx、jeg3/mtx细胞大小、形态不一、生长速度缓慢、对mtx的耐药指数分别为791.50、1040.04。除对mtx耐药外，对vp-16、5-fu、taxol、actd有交叉耐药。且两株耐药细胞建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性均为原来90％以上，说明他的耐药稳定性极好。可以为研究绒癌的耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供绒癌。对建立的jar/mtx、jeg3/mtx细胞学进行形态学观察及生物学特性鉴定：1.形态学观察倒置显微镜观察活细胞形态取对数生长期的jar、jeg3、jar/mtx、jeg3/mtx细胞各一瓶，换液后在倒置显微镜下观察细胞形态并照像。如图1所示，亲本细胞jar、jeg3大小、形态较一致，细胞内结构均匀；耐药细胞jar/mtx、jeg3/mtx大小、形态不一、细胞内尤其是近包膜处有较多深色物质聚集。2.测定细胞生长曲线取对数生长期的细胞jar、jar/mtx；jeg3、jeg3/mtx细胞，用0.25％含edta的胰酶消化制成单细胞悬液，每种细胞均以3000/孔种于96孔板，设3个复孔，分别在24h、48h、72h、96h检测。每孔90ul培养基，加入10ulcck-8溶液，混匀后37℃培养箱放置2.0h，以赛默飞varioskanflashmicroplatereader于450nm波长检测其吸光度。每组实验重复3次，绘制细胞的生长曲线图，如图2所示。3、耐药谱分析取对数生长期的细胞jar、jar/mtx、jeg3、jeg3/mtx细胞，用0.25％含edta的胰酶消化制成单细胞悬液，每种细胞均以4000/孔种于96孔板，24h后加不同浓度的药物刺激继续培养72h检测。每孔90ul培养基，加入10ulcck-8溶液，混匀后37℃培养箱放置2.0h，以赛默飞varioskanflashmicroplatereader于450nm波长检测其吸光度。每个浓度设置设2个复孔，每组实验重复3次。根据od值计算细胞抑制率，计算公式：细胞半数抑制浓度(ic50)＝(加药组od值/不加药组od值)*100％。根据每种药物不同浓度抑制率，利用graphpadprism6.0软件计算该药物半数抑制浓度(ic50)，从而计算每种药物的耐药指数(resistantindex,ri)，ri＝耐药细胞ic50/亲代细胞ic50，比较耐药细胞和亲代细胞的差异。分析表明jar/mtx对mtx的耐药指数(ri)为791.50，属于高度耐药，对vp-16、5-fu、taxol、actd的耐药指数(ri)分别为2.31、4.45、2.47、2.74，属于低度耐药。详见表1。jeg3/mtx对mtx的耐药指数(ri)为1040.04，属于高度耐药，对vp-16的耐药指数(ri)为22.16，属于高度耐药；对actd的耐药指数(ri)为7.11，属于中度耐药；对5-fu、taxol的耐药指数(ri)分别为2.35、2.19，属于低度耐药。详见表2。表1umol/lvp-165-futaxolmtxactdjar0.844.921.7*10^-30.4252.62*10^-3jar-mtx1.9421.94.2*10^-336.87.19*10^-3rf2.314.452.47791.502.74表24、流式细胞分析仪检测细胞周期用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞，调节细胞密度为2*10^5/孔,收取细胞；1000rpm/min，10min，弃上清；用预冷的pbs1ml重悬,1000rpm/min，10min，弃上清；用预冷的70％无水乙醇1ml重悬，-20℃固定；24h后取出离心，2000rpm/min，10min；用预冷的pbs1ml重悬，2000rpm/min，10min，再重复一遍，备用。按照bd周期试剂盒加入相应的试剂，流式细胞分析仪检测。结果显示jar的g1期、s期、g2期分别是60.53±0.50％、32.50±0.36％、6.91±0.15％；jar-mtx的g1期、s期、g2期分别是55.36±1.72％、26.80±1.42％、17.80±0.75％。jeg3的g1期、s期、g2期分别是32.76±1.76％、48.33±1.00％、18.36±0.21％；jeg3-mtx的g1期、s期、g2期分别是33.53±0.53％、44.03±0.40％、24.83±0.93％。jar与jar-mtx相比，g1期、s期的p值<0.05，g2期的p值<0.001，均存在统计学意义；jeg3与jeg3-mtx相比，g1期的p值>0.05，无统计学意义，s期的p值<0.05，g2期的p值<0.001，均存在统计学意义。说明细胞jar-mtx和jeg3-mtx在建模中经甲氨蝶呤诱导获得耐药性后，细胞阻滞发生在g2期，处于细胞损伤状态。5、耐药细胞稳定性检测jar-mtx、jeg3-mtx两株耐药细胞建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年年后复苏细胞复测其耐药性。操作步骤同3耐药谱分析，结果显示jar-mtx对mtx的耐药浓度为313.8umol/l，稳定性为93.2％；jeg3-mtx对mtx的耐药浓度为391.3umol/l，稳定性为90.1％。表明两株细胞jar-mtx、jeg3-mtx耐药性稳定。6、qrt-pcr检测多药耐药基因mdr-1的表达用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞，调节细胞密度为2*10^5/孔，收取细胞，用trizol法提取细胞rna，按照takara逆转录试剂盒说明逆转录为cdna，实时荧光定量rt-pcr检测细胞的多药耐药基因mdr-1的表达。结果显示jar-mtx中的mdr-1表达量是亲本细胞jar的43.26倍；jeg3-mtx中的mdr-1表达量是亲本细胞jeg3的30.10倍。当前第1页12