胶质母细胞瘤干细胞原代培养方法与流程

本发明涉及一种胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法。

背景技术：

胶质母细胞瘤（glioblastoma，gbm）是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，预后极差，而胶质母细胞瘤干细胞（glioblastomastemcells，gscs）是导致肿瘤进展的根本原因。研究表明gscs对常规放化疗不敏感，可能是胶质母细胞瘤易复发的潜在因素，这是由于：1)gscs的特征维持和功能发挥与其所处的壁龛微环境密切相关，gscs并不仅仅是生存在壁龛中那么简单，而是参与到壁龛微环境的构建、稳态和重塑中，与壁龛微环境进行相互作用。2)gscs能与免疫细胞相互作用，维持着一种动态调节的关系，gscs能吸引炎性细胞浸润，营造出有利于肿瘤生长的炎性微环境，后者又可以帮助gscs维持干性表型，gscs还可以分泌细胞因子募集具有免疫抑制作用的细胞来逃避免疫监视。gbm对放化疗具有抵抗性是预后不佳的重要原因，而这种放化疗抵抗的发生可能与初次治疗后gscs的比例增多有关。

因此，建立不同特征的gscs不仅能为体外基础实验提供工具细胞，更有助于深入研究gbm发生发展的分子机制。但是目前缺乏商品化的胶质母细胞瘤干细胞株。现有获取gscs的方法是通过磁珠分选cd133阳性的胶质母细胞瘤细胞。然而，这种方法目前受到质疑，已证实cd133阴性的胶质母细胞瘤干细胞的存在，这是由于胶质母细胞瘤具有明显的异质性，cd133阳性细胞比例低，肿瘤中含有异质性干细胞和前体细胞，这些都可以是潜在的肿瘤起始细胞。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，用于解决现有技术只能筛选出cd133阳性的gscs，不能表达不同干细胞标记物，无法满足现实需求这一问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种胶质母细胞瘤干细胞的原代培养方法，所述方法至少包括以下步骤：

（1）gscs原代培养：

a)提供胶质母细胞瘤组织单细胞悬液；

b)接种，去除贴壁细胞；

c)在显微镜下收集细胞悬浮球，消化，制成单细胞悬液；

d)取单个细胞接种，培养；

e)取悬浮生长的细胞球，接种，细胞直径培养至150~250微米。

进一步地，所述胶质母细胞瘤组织单细胞悬液是利用胶质母细胞瘤组织制成的。

进一步地，所述步骤a）具体为将胶质母细胞瘤组织碎化之后加入ii型胶原酶并置于co2的细胞培养箱中，并吹散，制成单细胞悬液。进一步地，所述细胞培养箱的温度为37℃、co2的体积百分数5%。更进一步地，所述步骤a）经过碎化是指将肿瘤组织制成直径不大于1mm³的颗粒。可以采用剪刀剪碎。

进一步地，所述步骤a）中肿瘤组织从细胞培养箱中取出后用250~400目滤网过滤

进一步地，所述步骤b）中接种之前还包括去除红细胞，所述去除红细胞的方法为加入红细胞裂解液，离心，弃上清。

进一步地，所述步骤b）中去除红细胞之后采用缓冲液冲洗、离心，弃上清。

进一步地，所述步骤b）用去除红细胞后用干细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度接种，换液，去除贴壁细胞，培养。更进一步地，所述培养的时间为4~9天。例如可以接种在6孔板上，每个孔10⁵个细胞，每3天换液。

进一步地，所述步骤c）在显微镜下用移液枪收集悬浮球，加入细胞消化液制成单细胞悬液。

进一步地，所述步骤d)中显微镜放大倍数为×100倍，每个视野少于5个细胞时取单个细胞，然后接种。

进一步地，所述步骤d)中培养过程中间歇性添加干细胞培养基。

进一步地，所述步骤e)取悬浮生长的细胞球的时间为细胞培养第12~16天时。

进一步地，所述方法还包括2）gscs传代培养，所述gscs传代培养是指将细胞悬液离心，去除上清，加细胞消化液，孵育，离心去除上清，加入细胞培养基培养。

进一步地，所述方法还包括3）gscs冻存，所述gscs冻存将传代培养之后的细胞依次置于3.5~4℃冰箱、-19.5~-20℃冰箱、-75~-80℃冰箱后移入液氮罐中保存。

进一步地，所述置于3种温度的冰箱保存的时间依次为10~15分钟，25~35分钟，10~13小时。

如上所述，本发明的胶质母细胞瘤干细胞培养方法，具有以下有益效果：

本方法利用gscs悬浮、成球性生长的特点，通过显微镜下挑选单个细胞克隆化培养。所获得的细胞表达不同干细胞标记物；加血清诱导分化后细胞呈贴壁生长，分化成不同类型细胞，分别表达神经胶质细胞标记物gfap、神经元标记物βiii-tubulin、少突胶质细胞标记物mbp。证实此法可获得不同特征的gscs，为体外基础实验提供工具细胞。

附图说明

图1显示为实例1中获得的胶质母细胞瘤干细胞的显微镜视图。

图2显示为实例1中获得的胶质母细胞瘤干细胞的显微镜视图。

图3显示为实例1中获得的胶质母细胞瘤干细胞表达cd133的显微镜视图。

图4显示为实例1中获得的胶质母细胞瘤干细胞表达cd44的显微镜视图。

图5显示为实例1中诱导干细胞分化的显微镜视图。

图6显示为实例1中诱导分化后的细胞表达βiii-tubulin的显微镜视图。

图7显示为实例1中诱导分化后的细胞表达mbp的显微镜视图。

图8显示为实例1中诱导分化后的细胞表达gfap的显微镜视图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

材料与来源：dmem培养液（gibco，c11995500bt），dmem/f12培养液（gibco，11330032），accutase消化液（stempro，a1110501），egf生长因子（gibco，phg0311），bfgf生长因子（gibco，phg0266），b27细胞添加剂（gibco，17504044），胎牛血清（gibco，16000-044），ii型胶原酶（gibco，17101015），红细胞裂解液（碧云天，c3702）

实施例1gscs培养及鉴定

gscs原代培养：

1.取苏州大学附属第二医院患者术后离体的肿瘤标本，用磷酸缓冲液（phosphatebuffersaline，pbs）冲洗两遍后用眼科剪剪碎。

2.加入5ml胶原酶ii，置于37℃、5%co2培养箱中20分钟，每5分钟吹打悬液，使其充分混匀并吹散。

3.将悬液用300目滤网过滤后制成单细胞悬液，加入等量的干细胞培养基（含有20ng/mlegf、20ng/mlbfgf、2%b27的dmem/f12培养基），1000转/分钟，离心5分钟后弃上清。

4.加入红细胞裂解液2ml，用移液管轻柔吹打，作用3分钟，以1000转/分钟，离心5分钟后弃上清。

5.加入2mlpbs，吹散混匀后1000转/分钟，离心5分钟后弃上清，再重复一次。

6.用干细胞培养基重悬，调整细胞浓度接种于6孔板，每孔10⁵个细胞，体积为2ml，每3天换液，去除贴壁细胞，培养7天。

7.将显微镜在超净台紫外线消毒2小时，将玻璃毛细血管针尖端加热后拉长拉丝，并灭菌处理。

8.在显微镜下用1ml移液枪收集悬浮球，加入细胞消化液在37℃下消化2分钟成单细胞悬液，调整细胞浓度至每个视野（100倍）＜5个细胞，利用事先准备的毛细血管针吸取单个细胞，将其接种于96孔板中，每孔100μl干细胞培养基，每5天加50微升新鲜干细胞培养基，显微镜下观察单个细胞生长情况，培养14天，筛选出悬浮生长的神经球，将其转至6孔板中继续培养,当神经球长至200微米时传代培养。

gscs传代：

收集细胞悬液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟，吸除上清，加入1ml干细胞消化液，置于37℃温箱孵育2分钟，1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加入干细胞培养基并轻柔吹打，分瓶悬浮培养。

gscs冻存：

收集细胞悬液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟，吸除上清，加入1ml干细胞消化液，置于37℃温箱孵育2分钟，1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加入1ml冻存液轻柔吹散，移入冻存管，置于4℃冰箱10分钟后置于-20℃冰箱30分钟，再置于-80℃冰箱保存12小时后移入液氮罐中长期保存。

冻存液配制：二甲基亚砜与干细胞培养基按1:9比例配制。

gscs复苏

将冻存的细胞置于37℃水温箱融化后移入离心管，加入2ml干细胞培养基，1000转/分钟，离心5分钟，吸除上清液，加入干细胞培养基重悬后按传代的培养方法继续培养。

诱导gscs分化：

收集细胞悬液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟，吸除上清，加入含10%胎牛血清的dmem完全培养基并轻柔吹散，移入培养瓶中继续培养，待细胞长至90%融合时传代分瓶培养。

免疫荧光法鉴定细胞标记物（cd133、cd44、gfap、βiii-tubulin、mbp）：

ia）取gscs悬液滴于多聚赖氨酸预处理过的载玻片上，静置待干。ib）贴壁细胞接种于多聚赖氨酸预处理过的小圆玻片进行细胞爬片，待长至80%融合时取出玻片，用pbs浸洗3次，每次5分钟。ii）用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，后用pbs浸洗3次，每次五分钟。iii）用0.5%tritonx-100（用pbs配制成pbst）室温通透细胞20分钟，pbs浸洗3次，每次5分钟。iv）吸去pbs，用10%山羊血清室温封闭1小时。v）用10%山羊血清配制一抗（1:100），后吸去封闭液，滴加稀释好的一抗（cd133、cd44、gfap、βiii-tubulin、mbp），4℃孵育过夜；vi）吸去一抗，用pbs浸洗3次，每次5分钟；期间用10%山羊血清配制二抗（1:100）；vii）滴加稀释好的二抗，常温孵育2小时；viii）吸去一抗，用pbs浸洗3次，每次5分钟；ix）滴加dapi避光孵育15分钟，对细胞进行染核，后用pbs浸洗3次，每次5分钟；x）用zeiss激光共聚焦显微镜拍摄记录。

结果如图3、4、6、7和8所示，表明肿瘤干细胞可以表达cd133、cd44、gfap、βiii-tubulin、mbp。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。