一种降解六溴环十二烷的菌株筛选方法及其应用与流程

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种一种降解六溴环十二烷的菌株筛选方法及其应用。

背景技术：

溴化阻燃剂(brominatedflameretardants，bfrs)占所有阻燃剂的约80％，广泛用于生产塑料，纺织品和电子电路等多种材料，是目前全球产量最大、阻燃效率最高的有机阻燃剂之一。作为溴代阻燃剂的主要代表——六溴环十二烷(1，2，5，6，9，10-hexabromocyclododecane，简称hbcd)，主要添加于建筑材料膨胀聚苯板(eps)、挤塑聚苯板(xps)、纺织品和高抗冲聚苯乙烯(hips)中，具有持久性、迁移性、蓄积性等特点，目前六溴环十二烷被列为高产量化学品，2001年生产了约16,700吨。

随着hbcd的大量生产和广泛使用，其已成为广泛分布的环境污染物。各种陆地和海洋环境都含有六溴环十二烷，常见于海水，湖水，沉积物，鱼类，土壤和污水污泥中，浓度范围为0.1-36,000纳克/克干重。目前，由于六溴环十二烷污染的增加，六溴环十二烷毒性的风险已达到令人震惊的程度，而且在过去十年中，六溴环十二烷在脊椎动物的食物链中的残留水平有所增加。六溴环十二烷在食品中的生物积累危害不容小觑，例如，海洋生物中六溴环十二烷的浓度范围为4.1至519纳克/克脂肪重量，每年增加5％。毒理学研究表明，六溴环十二烷可能诱发癌症，在体内积累到一定浓度后可以导致血清甲状腺激素浓度下降、抑制神经递质正常吸收、引起肝组织病理学改变等生物毒性。由于其对人类健康和环境的毒性和负面影响，因此hbcd引起的环境问题受到国际社会的高度关注。2010年8月，hbcd被欧洲化学品管理局(echa)列入“高关注度化学品清单”。2013年5月，斯德哥尔摩环境大会将其正式列为持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，pops)。2014年5月，日本成为第一个全面实施禁止进口和生产hbcd的国家。我国是hbcd生产大国，年产量高达18,000吨，占全球产量的60％。高效降解环境各介质中的hbcd，消除hbcd污染，对于维护人类健康和环境保护具有重要意义。

目前修复hbcd污染的几种方法有电化学还原，光降解和微生物降解。由于光催化很容易失活并且六溴环十二烷难以分离，因此难以应用光降解。使用电化学还原降解六溴环十二烷的缺点是效率低，能量消耗大，适用范围窄。而微生物降解是利用微生物解毒或者降解有毒物质，具有降解效率高、低污染和经济环保的特点，因此被广泛的认定为最具潜力的降解方法。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种降解hbcd菌株的分离方法，寻找合适的菌株用于hbcd的降解。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种hbcd菌株的分离方法并寻找合适的降解hbcd的菌株。

为了实现上述目的，本发明了提供了一株蜡状芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017771，保藏地址为中国武汉武汉大学。

进一步地，所述菌株分类学命名为芽孢杆菌hbcd-sjtu(bacilluscereushbcd-sjtu)。

进一步地，活化菌株后，制备成休止细胞，加入终浓度0.5mmhbcd，定期取样，使用hplc检测菌株在不同时间的降解情况。

进一步地，在成功降解六溴环十二烷后，从该菌株中提取dna后进行16srrna鉴定，并构建系统发育树。进一步地，所述降解六溴环十二烷菌株通过通用引物27f(5′-agagtttgatcctggctca-3′)和1492r(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)进行16srrna检测。

进一步地，可以通过使用气相色谱-质谱联用(gc-ms)分析，在hbcd降解后鉴定降解中间体。

进一步地，所述降解六溴环十二烷菌株最适生长温度为30℃、最适生长ph为7，最适底物浓度为0.5mm，最佳转速为200r/min。

本发明还提供了一种降解六溴环十二烷菌株在消除六溴环十二烷环境污染中的应用。

在本发明的较佳实施方式中，提供了一种所述菌株降解六溴环十二烷菌株在植物抗六溴环十二烷胁迫中的应用。

本发明还提供了一种降解六溴环十二烷的菌株分离方法，所述分离方法包括以下步骤，

步骤一：取含六溴环十二烷的污染水源，加入无机盐培养基，并加入0.5-2.0mm的六溴环十二烷进行培养；

步骤二：培养3-8天后转移至新的含六溴环十二烷的无机盐培养基中，重复培养大于两次，培养液中的六溴环十二烷的浓度随着重复培养次数的增加逐步增加至4-7mm；

步骤三：将培养液进行平板涂布于以六溴环十二烷为唯一碳源的无机盐固体培养基中，挑选单菌落并培养。

步骤四：检测并确定挑选的单菌落菌株为降解六溴环十二烷菌株。分离得到的菌株即如上所述的菌株。

进一步地，所述步骤四还包括，对挑选出的单菌落进行复筛，并进行划线分离，得到降解六溴环十二烷的菌落。

进一步地，所述含六溴环十二烷的污染水源可以垃圾填埋场的废水，可以是工业废水。

进一步地，得到菌株后，制备成休止细胞，加入终浓度0.5～2.0mmhbcd，定期取样，使用高效液相色谱(hplc)检测菌株在不同时间的降解情况。

进一步地，休止细胞制备方法为：菌株活化后，将中处于对数生长中期的细胞培养液在4000～6000rpm转速下离心20～30分钟，并用0.1mpbs缓冲液洗涤2次，收集菌体，静息处理1～4h。将细胞用0.1mpbs调成600nm下od值为5个光密度，加入hbcd终浓度为0.5mm，在30℃摇床，200rpm转速振荡条件下反应，反应期间定时取样，利用hplc检测菌株在不同时间对hbcd的降解。

进一步地，所述无机盐培养基每1l无机盐培养基中包含3.7gkh2po4，5.2gk2hpo4·3h2o，1.0gna2so4，0.2gmgso4·7h2o，2.0gnh4cl，和0.5ml微量元素溶液。

进一步地，所述微量元素溶液包括0.004g/lfeso4·7h2o，0.05g/lcucl2·2h2o，0.008g/lmnso4·h2o，0.05g/lcacl2·2h2o，0.1g/lznso4，0.1g/lna2moo4·2h2o和0.05g/lna2wo4·2h2o。

进一步地，所述步骤三中的无机盐固体培养基的组成为：在无机盐液体培养基中添加15g/l的琼脂粉，高压灭菌倒平板。在涂板之后，在倒置培养的平板盖子上放含有hbcd的滤纸片。

本发明实现了hbcd的生物降解，为生物修复环境中的hbcd污染提供了操作实例，从而实现以hbcds为代表的溴代阻燃剂的矿化，具有降解效率高，成本低，无二次污染等优点。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的菌株bacilluscereushbcd-sjtu休止细胞降解hbcd情况图；

图2是菌株bacilluscereushbcd-sjtu测序比对后构建的系统发育树。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实例1，菌株的筛选：

样品的采集：在上海的废水填埋场用无菌瓶采集废水，分装后于实验室4℃保存。

降解菌株的富集培养：

(1)向250ml装有50mlmsm培养基的锥形瓶中加入2ml废水，加入hbcd使终浓度为1mm做为唯一碳源。将锥形瓶置于30℃，200rpm转速的摇床培养7d。按4％接种量转接至50ml新鲜msm培养基，加入hbcd使终浓度为2.5mm，将锥形瓶置于30℃，200rpm转速的摇床培养7d。按4％接种量转接至50ml新鲜msm培养基，加入hbcd使终浓度为5mm.。

其中，msm液体培养基含有3.7gkh2po4，5.2gk2hpo4·3h2o，1.0gna2so4，0.2gmgso4·7h2o，2.0gnh4cl，和0.5ml微量元素溶液。微量元素溶液包括0.004克feso4·7h2o，0.05克cucl2·2h2o，0.008克mnso4·h2o，0.05克cacl2·2h2o，0.1克znso4，0.1克na2moo4和0.05克na2wo4·2h2o(每升含有0.1mmhcl)。高压灭菌后，冷却至室温使用。

msm固体培养基含有3.7gkh2po4，5.2gk2hpo4·3h2o，1.0gna2so4，0.2gmgso4·7h2o，2.0gnh4cl，0.5ml微量元素溶液和15g酵母粉。微量元素溶液包括0.004克feso4·7h2o，0.05克cucl2·2h2o，0.008克mnso4·h2o，0.05克cacl2·2h2o，0.1克znso4，0.1克na2moo4和0.05克na2wo4·2h2o(每升含有0.1mmhcl)。高压灭菌后，倒板使用。

(2)将步骤(1)中所得培养液稀释104～105倍，采用平板涂布法，涂布于msm固体培养基倒置培养，将100μl5mmhbcd滴在滤纸片上，将滤纸片放入平板盖子中。平板置于30℃培养箱培养。

(3)在平板上成功生长菌落后，将来自平板的菌落转移到含有5mlmsm培养基以hbcd为唯一碳源的摇管中。

(4)成功生长后，将来自步骤(3)的样品在含有hbcd的msm琼脂平板上划线，并在30℃培养箱中培养。多次划线分得单菌落，最后挑选最终平板上的单菌落接入以hbcd为唯一碳源的msm培养基中，进行甘油管保藏。

(5)活化菌株，将甘油管的菌株转接至新鲜培养基置于30℃，200rpm摇床培养到对数生长中期。

(6)收集菌体制备休止细胞：将步骤(5)中处于对数生长中期的细胞培养液在4000～6000rpm转速下离心20～30分钟，收集菌体，并用0.1mpbs缓冲液洗涤2次4000～6000rpm离心10min收集细胞，置于30℃摇床，200rpm转速饥饿2h。

(7)将步骤(6)中细胞用0.1mpbs缓冲液调成600nm下od值为5个光密度，加入hbcd终浓度为0.5mm，在30℃摇床，200rpm转速振荡条件下反应，反应期间定时取样，利用高效液相色谱(hplc)检查菌株在不同时间对hbcd的降解情况。

其中，pbs缓冲液含有0.27gkh2po4，na2hpo41.42g，nacl8g和kcl0.2g溶解在1升水中。

hplc检测条件如下：

hplc型号：agilent1200series；色谱柱：eclipsexdb-c18column(columnsize，250×64.6mm；particlesize，5μm；agilent)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；波长：210nm；进样量：5μl。

(8)在成功降解六溴环十二烷后，从该菌株中分离出dna并送至公司进行16srrna检测，采用引物为通用引物27f(5′-agagtttgatcctggctca-3′)，1492r(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)。使用pfu聚合酶通过在94℃下变性5分钟，然后在94℃下30秒，60℃下30秒和72℃下3分钟的30个循环来扩增dna，将扩增结果送至公司进行测序。通过blast搜索纯化的pcr产物的序列分析和同源性比对。使用mega4.1的邻接(nj)方法用于基于所选物种和菌株的比对建立具有1000个引导的系统发育树。使用ncbi数据库中的核苷酸blast(blastn)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在blast中检索菌株hbcd-sjtu的16srrna序列。得到的blast返回超过35个相关菌株。相关菌株和物种的选择基于序列同一性和百分比。去除重复，并使用整合在megax(分子进化遗传分析软件)中的clustal-w进行所有序列的比对。blast结果表明该基因与蜡状芽孢杆菌菌株s2-8和l12的16srrna基因具有99％的相似性，同时构建系统发育树，见图2。鉴定后，将菌株送去进行全基因组测序以获得有关可能参与六溴环十二烷降解的基因的有用信息。据报道，迄今为止，还没有完全测序具有降解六溴环十二烷能力的芽孢杆菌种的基因组。

实例2，菌株生理特性研究：

分离的菌株bacilluscereushbcd-sjtu可以使用六溴环十二烷作为唯一碳源。当在含有六溴环十二烷的msm琼脂平板上培养时，菌株hbcd-sjtu形成小的，圆形和凸起的菌落。菌落呈现深白色，这对于hbcd降解菌株来说是特殊的。该菌株是革兰氏阳性，内生孢子形成和杆状(1×3-4μm)。菌株hbcd-sjtu可仅利用少量碳源，包括葡萄糖，果糖，核糖，麦芽糖，n-乙酰基-葡糖胺，淀粉，七叶，海藻糖和糖原。在该研究中测试的生理学，生物化学和酶学特征包括：硫代硫酸钠，h2s生成，色氨酸和色氨酸脱氨酶的阳性；o-硝基苯基-半乳糖苷和β-半乳糖苷酶反应呈阴性。对碱性磷酸酶和2-萘基磷酸酯显示出阳性酶活性；胰蛋白酶和n-苯甲酰基-dl-精氨酰-2-萘胺阴性；对于阿罗林芳香酶和l-脯氨酰-2-萘胺而言较弱。图1是菌株bacilluscereushbcd-sjtu休止细胞降解hbcd情况图。

实例3，hbcd降解产物的鉴定：

(1)通过使用气相色谱-质谱联用(gc-ms)分析，鉴定hbcd降解后产生的中间体：在休止细胞反应后，将1ml反应混合物在真空下保持在50℃并蒸发至干燥，并加入200μl乙腈以将其再溶解。将所得溶液置于小瓶中并在氮气流下干燥。为了分析样品，在140℃下使用配备有火焰离子化检测器和50-m长的j&wdb-5ms柱的gc-ms系统(gcd1800c，hewlett-packard，folsom，ca，usa)。所进行的程序为70℃，2分钟，然后15℃/min升温至240℃保持3分钟，20℃/min升温至300℃保持10分钟。

(2)gc-ms鉴定了六溴环十二烷降解过程中发现的四种代谢物。化合物的结构(hbcd，15.169分钟)，(1，5，9-环十二碳三烯，5.517分钟)；(1，5-环十二碳二烯，7.513分钟)；(环十二碳烯，7.776分钟)和(3，9-十二碳二烯13.912分钟)通过将它们的质谱和保留时间与标准gc-ms光谱库进行比较来鉴定。在0d，仅鉴定了六溴环十二烷，而在1至3d，鉴定了每种中间体的色谱图。显示新中间体形成和六溴环十二烷及其代谢物减少的色谱图提供了芽孢杆菌属菌株降解六溴环十二烷及其代谢物的证据。代谢物1，5，9-环十二碳三烯，1，5-环十二碳二烯和环十二碳烯也在先前的研究中被鉴定(ukisu等人2017)，而代谢物3，9-十二碳二烯是新发现的。报道了gc-ms谱图。测定化合物a的结构和质谱为(hbcd)和641.7，560.8，400.7，319，281，239.1，197，118.9，79和41.1；化合物b为(1，5，9-环十二碳三烯)和405.2，240.9，281，252.9，207.1，162.7，135，73和44；化合物c为(1，5-环十二碳二烯)和503.2，429.1，391.1，341，281，207.1，164.2，135，79.2和41.1；化合物d为(环十二碳烯)和562.7，400.9，318.9，239.1，197，166.3157.1，118.979.1和41.1；化合物e为(3，9-十二碳二烯)和327，281.1，253，207，177.1，166.3，135.1，103.9，73.1和44.1。通过将它们的质谱与标准gc-ms谱库进行比较来鉴定这些中间体中的每一种，从而推断出降解途径。

实例4，降解条件的优化：

(1)最适温度：将菌株活化后，以2％的接种量接至50mlph为7的msm培养基，加入终浓度0.5mmhbcd，分别置于26℃、30℃、34℃、37℃、40℃的摇床培养，转速200rpm，每隔一定时间取样用分光光度计检测od600和hplc检测hbcd降解情况。

(2)最适ph：将菌株活化后，以2％的接种量接至50mlph分别为6、7、8、9、10的msm培养基，加入终浓度0.5mmhbcd，置于30℃，转速200rpm的摇床培养，每隔一定时间取样用分光光度计检测od600和hplc检测hbcd降解情况。

(3)最适底物浓度：将菌株活化后，以2％的接种量接至50mlph为7的msm培养基，加入终浓度0.5mm、1mm、1.5mm、2mm的hbcd，置于30℃，转速200rpm的摇床培养，每隔一定时间取样用分光光度计检测od600和hplc检测hbcd降解情况。

(4)最佳转速：将菌株活化后，以2％的接种量接至50mlph为7的msm培养基，加入终浓度0.5mmhbcd，置于30℃，转速分别为0r/min、80r/min、120r/min、160r/min、200r/min的摇床培养，每隔一定时间取样用分光光度计检测od600和hplc检测hbcd降解情况。

(5)得到菌株最适生长温度为30℃、最适生长ph为7，最适底物浓度为0.5mm，最佳转速为200r/min。

实例5，降解hbcd的应用

(1)种子处理和发芽实验

用3.5％次氯酸钠(naclo)溶液洗涤和消毒1分钟后，小麦的健康、成熟的种子在70％乙醇中浸泡10分钟，最后用蒸馏水清洗以备后用。种子的萌发在含有600g土壤的预先灭菌的塑料罐(直径20cm)中通过用hoagland溶液400ml浇水进行。发芽后，选择每盆三个相同的幼苗，每株幼苗用1.0ml液体lb处理的细菌悬浮液(1.0×109cfu/ml)处理作为实验组。用1.0ml液体lb培养基处理的幼苗作为对照组。将三个塑料罐(三个植物/盆)作为重复处理。用hoagland营养液加入0，0.2，0.4和0.6mmhbcd对对照组和实验组的幼苗进行浇水，进行不同浓度的hbcd的胁迫处理。白天培养温度控制在28℃和夜晚控制在16℃，为了将水分保持在土壤的60％保水能力下，使用滴管吸取去离子水进行日常灌溉。

其中，hoagland溶液含有1.00mnh4h2po41ml，1.00mkno36ml，1.00mca(no3)24ml，1.00mmgso42ml，2.86gh3bo3，1.81gmncl2·4h2o，0.22gznso4·7h2o，0.08gcuso4·5h2o，0.02克h2moo4·h2o和0.25ml铁原料溶于1升营养液中。

(2)生理测量

为了测量包括叶面积和每株植物的叶子总数在内的生理指标和生长测量值，在60天后收获植物。通过便携式叶面积计量器(型号ymj-a，中国)测量叶面积。在将植物与盆分离后，用尺子进行生长参数如茎和根长度(cm)的测量。直接称重茎、根的鲜重(g)，之后用去离子水清洗芽后置于75℃烘箱干燥2天测量干重。

叶绿素的提取：取1g精细切割的新鲜叶子，用20-40ml80％丙酮研磨。然后将其在5000-10000rpm下离心5分钟。转移上清液并重复该过程直至残余物变为无色。溶液的吸光度在645nm处，溶剂(丙酮)空白为663nm。使用以下等式计算总叶绿素的含量：

总叶绿素＝20.2*(a645)+8.02*(a663)。

(3)菌株bacilluscereushbcd-sjtu改善了受到hbcd胁迫的小麦的生长状况。而与未用菌株bacilluscereushbcd-sjtu处理过的对照组相比，实验组的条高度发生了相当大的改善。相应地，在0.2，0.4和0.6mmhbcd处理中，茎高度的改善为56.32，55.41和71.89％。根长度显着提高58.93％，49.67％和47.47％。

(4)接种菌株的对照组的小麦的生物量增强，各种浓度的六溴环十二烷的负面影响也相应减少。与对照组相比，在用0.2，0.4和0.6mmhbcd处理的实验植物的茎鲜重中观察到1.37，1.13和1.29倍的改善。干重是对照组的1.89，1.75和1.53倍。根的干重是对照组的2.13，2.15和2.02倍。

(5)在使用0.2，0.4和0.6mm浓度的hbcd处理与对照组相比叶片数量增加至1.32倍，1.20倍和1.32倍。与未接种的植物样品相比，相应地在hbcd处理0.2，0.4和0.6mm时叶面积的增加为53.1，54.71和57.5％。

(6)叶绿素含量的测定：与未接种菌株的对照组相比，菌株bacilluscereushbcd-sjtu促进了叶绿素的形成，在0.2，0.4和0.6mm浓度的hbcd处理下，叶绿素含量提高了55.6％，57.1％和59.32％。

(7)总之，在所有评估的hbcd浓度下，菌株bacilluscereushbcd-sjtu对植物抗hbcd胁迫具有相当大的作用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>上海交通大学

<120>一种降解六溴环十二烷的菌株筛选方法及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1450

<212>dna

<213>芽孢杆菌hbcd-sjtu(bacilluscereushbcd-sjtu)

<400>1

tgactctgatcacgttaggcggctggctcaaaaggttaccccaccgacttcgggtgttac60

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caatgtatta1450