一种以蔬菜废弃物为原料制备Bt液体发酵培养基的方法与流程

本发明涉及一种制备bt液体发酵培养基的方法，具体涉及一种以蔬菜废弃物为原料制备bt液体发酵培养基的方法，属于生物农药技术领域。

背景技术：

苏云金芽孢杆菌（bacillusthuringiensis,bt）作为现今高效、用量大、安全的生物杀虫剂，由于生产成本较为昂贵，造成了其价格较高。通过选择低成本的发酵原料，并通过生物统计学的方法对其培养基进行优化，提高发酵能力达到或者接近原昂贵培养基的效果。

由于bt培养基对菌株毒力有明显的影响，因而对于bt发酵培养基的研究一直在进行，同时bt菌株的广泛使用及推广受到成本的限制，对基于保证菌株正常生长且具备较好杀虫效果的低成本培养基的研究也受到重视。

杨建州利用味精废水生产bt生物农药的研究中用预处理后味精废水的上清液配制培养基，添加玉米淀粉3%，蛋白胨1%，豆粕3%，灭菌前初始ph为8.0，在温度30℃、200rpm摇床培养。吴丽云利用啤酒废弃物为原料进行bt液态发酵的研究以1/2啤酒原废水+1/2酸化废水为溶液,添加葡萄糖0.2%、(nh4)2so40.1%、znso40.05%、吐温-800.15%、nacl0.6%、n物质0.4%、酵母液30%(v/v)、kh2po40.12%。唐凌云利用毛发水解液、沼液、城市污泥等分别合成多种培养基生产的苏云金杆菌也显著降低了工业原料成本并保证了其杀虫效果。王程辉利用酒糟废液培养bt，周学永、郭爱莲等利用工业废水生产bt，兰钊等通过玉米发酵酒精培养bt。这些研究充分说明了通过废物利用制备bt培养基的可行性，同时可以充分降低工业生产bt生物农药的成本，大大提高了bt杀虫剂的普遍性，同时也间接处理了自然环境、生活和工业生产作业中产生的废弃物，有效降低了对环境的污染。但是，在维持bt原有生物活性的同时进一步降低bt生物农药的生产成本仍然是市场经济追求的目标。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以蔬菜废弃物为原料制备bt液体发酵培养基的方法，能够将bt发酵过程中的生产成本降低，所采用的生产原料为农贸市场的蔬菜废弃物。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案。

本发明的一种以蔬菜废弃物为原料制备bt液体发酵培养基的方法，其特征在于制备步骤如下：

（1）选择蔬菜废弃物：收集农贸市场的蔬菜废弃物进行分类分拣，选择蔬菜废弃物白菜和四季豆，分别洗净后通过榨汁机压榨和过滤取得粘稠汁液，离心，取上清液，得四季豆汁液和白菜汁液；

（2）灭菌：将步骤（1）的四季豆汁液和白菜汁液，121℃灭菌；

（3）配制发酵培养基：取步骤（2）灭菌后的四季豆汁液和白菜汁液，按质量比为2∶1混合后，添加可溶性淀粉6g/l、黄豆饼粉6g/l、al³⁺0.4g/l、fe²⁺0.4g/l;

（4）优化发酵条件：ph7.0、温度35℃、通气量80ml/250ml装量。

其中，步骤（1）所述离心，离心强度为10000转/min，离心时间为10min。

步骤（1）所述离心，为重复离心5次。

步骤（2）所述的灭菌时间为20min。

本发明的优点及有益之处：

1、本发明以降低bt生物农药发酵原料成本为目的，选择合适的蔬菜废弃物替代原料，提供其正常生理代谢所需要的部分营养物质。

2、考虑到不同碳源氮源以及矿物质元素对菌株生长以及合成生物活性物质的重要性，对于添加物的选择进行了全面的分析。

3、通过对培养基进行优化来再次提高bt的发酵水平及毒力，保证其杀虫效果的前提下，为bt菌株的大量廉价培养提供技术支撑。

附图说明

图1为不同蔬菜废弃物含量对bt生长的影响的示意图；

图2为不同碳源和氮源对bt生长的影响示意图；

图3为不同金属离子对bt生长的影响示意图；

图4为正交试验直观分析示意图；

图5为ph值对bt生长的影响示意图；

图6为温度和培养基装量对bt生长的影响示意图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：不同蔬菜废弃物对bt的发酵效果

于福州农贸市场收集不同种类的蔬菜废弃物（番茄、白菜、四季豆、包菜和菠菜），进行分类分拣，分别洗净后通过榨汁机压榨和过滤取得粘稠汁液，并将其进行5次离心，离心强度为10000转/min，离心时间为10min，取得上清液，将样品进行121℃灭菌20min。取标准菌株bt8010，按2%的体积比接种于上述汁液和lb液体培养基中，于30℃,200rpm培养箱中振荡培养，间隔时间点取样镜检，直到芽孢脱落量以及伴孢晶体的含量均为50%，得到bt发酵液。图1中a)表明四季豆和白菜相对于番茄、菠菜和包菜可以更好促进bt菌株生长，并且可以明显看出包菜和菠菜的效果基本相当，结合实验现象，发现番茄效果欠佳的同时还会导致产生较多沉淀物，因此后续实验选择白菜和四季豆。通过图1中b)可知，当四季豆和白菜汁液比例为2∶1时，bt菌株生长较好，并为了使得废弃物来源更广，因此选择此比例配制培养基。

实施例2、不同碳源、氮源、金属离子添加物的筛选

在预处理的蔬菜废弃物培养基中分别加入4种碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇）和4种氮源（胰蛋白胨、玉米粉、尿素、黄豆饼粉），浓度均为6g/l，将其分别与lb培养基组进行对照。图2结果表明，对于碳源添加物，甘露醇无法明显促进菌株生长，其余三种差异相对较小，同时可溶性淀粉对于菌株生长的促进效果最佳，选择可溶性淀粉即玉米淀粉为碳源添加物；对于氮源添加物，尿素的促进作用较小，可能与其是无机氮源有关，胰蛋白胨的效果最佳，其次为黄豆饼粉，两者差距较小，均起到良好的促进菌株生长的作用，考虑到培养基成本的因素，选择黄豆饼粉为氮源添加物。此外，通过与利用lb培养基发酵的对照组的比较发现，单独添加碳源或氮源均难以起到相当或者更好的促进效果，因此，需要考虑将碳源和氮源添加物同时配合，扩大其对菌株生长的共同促进的效果。

在添加碳源和氮源的基础上，分别往预处理的蔬菜废弃物培养基中加入4种常用的金属离子（mg²⁺、fe²⁺、al³⁺、na⁺），添加量均为1.2g/l，将其分别与lb培养基组进行对照。图3结果表明：添加亚铁离子的培养基的菌株生长效果最佳，发酵水平与lb培养基接近，同时明显比其余金属离子的促进效果更佳，其次为铝离子因此，选择亚铁离子和铝添加的为金属离子。

实施例3、碳源、氮源、金属离子添加物的最佳组合（正交试验）

在初始培养基（包括外源添加物）的基础上，为了再次提高发酵水平，需要对培养基进行再次优化，利用四因素三水平的正交试验对碳源（可溶性淀粉）、氮源（黄豆饼粉）、金属离子（亚铁离子、铝离子）按照不同比例加入预处理的蔬菜废弃物培养基中，筛选出其最佳组合。

表1为碳源、氮源、金属离子的浓度水平设计，利用统计学软件spss17设计其正交试验，如表2。结果表明：方差分析表明可溶性淀粉和黄豆饼粉（sig值<0.05）的显著性明显,说明可溶性淀粉和黄豆饼粉的影响较为明显。利用邓肯氏检验，并且直观分析（图4），结果表明对四个因素筛选出的最佳组合为a3b3c2d3（葡萄糖6g/l,黄豆饼粉6g/l，亚铁离子为0.4g/l,铝离子为0.4g/l）。同时，筛选出的最佳培养基和lb培养基的发酵水平相当，并且与随机选出的其他3个培养基相比，其明显起到促进菌株生长的作用。

表1正交试验因素和水平设计

表2培养基添加物正交试验设计结果

实施例4、不同发酵条件对bt生长的影响

由于ph对微生物生长代谢有明显影响，通过调节培养基的初始ph值，在微生物本身对环境一定范围ph调节的基础上，控制培养基ph对其生长的间接影响。对实验的培养基进行不同初始ph的设置，通过其生长状况确定其最佳初始ph以便于更好促进微生物的发酵生长。图5表明，最佳初始ph范围为7.0~7.5偏酸性和偏碱性的生活环境均对其生长起到抑制作用，特别是初始ph低于6.5以及高于8.0的发酵条件下。

同时，一定范围发酵温度对微生物代谢生长的速度以及物质合成和能量产生起到决定性作用，因此对发酵温度的控制不仅可以调节其生长代谢速度，同时可以对其毒力产生影响。过低或者过高的温度不仅导致发酵水平的低下，同时可以造成微生物受损或者死亡。图6表明，35℃时，细菌生长速率最快，25-35℃相对其他温度有较为明显的促进作用。

此外，bt菌为好氧细菌，培养基的通气量可以保证其正常生长代谢，通过控制250ml锥形瓶中菌液的装量，研究通气量对菌株生长的影响。图6表明，过低的通气量对菌株生长有抑制影响，当装量为80ml/250ml后，由于存在充足的氧气，因为菌株生长较好。

实施例5、生物活性测定的结果

经生物活性测定（表3），蔬菜废弃物培养基发酵的bt8010菌株有良好的杀虫效果，48小时后结果表明原液和稀释倍数为5的菌液杀虫率达到100%，通过对比实验室用的标准培养基（胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l；ph=7.0）发酵的bt菌株毒力，两者杀虫效果相当，蔬菜废弃物培养基的菌液稀释至20倍后仍有较好杀虫效果（80%），而当稀释倍数达到50倍时死亡率达到56.7%。标准lb培养基的菌液lc50=16.783μl/ml，蔬菜废弃物的菌液lc50=17.420μl/ml，表明两者的杀虫效果接近。

表3对棉铃虫初孵幼虫的生物测定结果