一种小麦条锈病的抗性评价方法及利用品种多样性控制小麦条锈病的方法与流程

本发明涉及作物种植技术领域，具体涉及一种小麦条锈病的抗性评价方法及利用品种多样性控制小麦条锈病的方法。

背景技术：

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(pucciniastriiformisf.sp.tririci)侵染引起的一种重要的叶部气传真菌性病害，病原菌可随气流进行远距离传播，在同一个生长季节内反复侵染小麦造成危害。

小麦条锈病的发生遍及小麦主要种植区，具有发生面积大，造成产量损失严重等特点，严重威胁小麦的生产安全。

目前种植抗性品种仍然是控制小麦条锈病最安全、经济、有效的手段。但是，大部分抗性品种在大面积推广应用3-5年后便丧失抗性，造成品种抗性丧失的主要原因是田间具有新的毒性的条锈菌菌株的产生和流行。而且大面积种植单一或少数几种小麦品种，能够对条锈菌生理小种产生定向选择压力，致使小麦品种抗性丧失，进而导致条锈病大流行。

小麦条锈病抗性评价对于抗性品种的抗性水平的评价以及抗性品种的选择至关重要。传统的抗性评价方法通常是根据病害的症状表现，记录反应型或者调查病情指数。然而，由于小麦条锈病抗性的表达能够发生在小麦的不同生长阶段，例如苗期抗性，成株期抗性和全生育期抗性，仅仅进行一次抗性评价不能代表小麦品种田间抗性表达的真实情况，因此，通常需要在整个病害发生期进行多次抗性评价工作。采用传统的病情调查方法对大量抗性材料进行评价需要耗费大量的人力、时间等成本，因此，开发准确、快速、高效的小麦抗条锈病评价方法十分必要。

小麦品种多样性种植不仅能够降低条锈病的病情，增加小麦产量，而且可以缓解寄主品种对条锈菌的选择压力，降低条锈菌的变异速率，延长品种的使用年限。然而，对于小麦条锈病的多样性控害，目前仍没有一套完整可循的有效的技术方案，小麦条锈病的多样性控害仍然停留在小面积种植的研究水平，因此，开发有效的利用小麦品种多样性种植控制条锈病的方法，对小麦条锈病的生态防控和小麦生产安全具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种小麦条锈病抗性评价方法，以及利用所述抗性评价方法建立的利用品种多样性种植控制小麦条锈病的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对小麦条锈菌侵染小麦后在小麦叶片中的生长、繁育、扩展过程及在此过程中小麦条锈菌的遗传物质的变化规律以及大量条锈病抗性小麦品种的遗传和表型分析的研究，创造性地发现在条锈菌侵染小麦的潜育期，小麦叶片dna中条锈菌dna含量与小麦dna含量的比值与小麦对于条锈菌的抗性表现明显的负相关性规律，即条锈菌dna含量与小麦dna含量比值越大，小麦表现的条锈病抗性越低，比值越小，小麦表现的条锈病抗性越高。依据此，本发明建立的利用分子生物学技术以检测遗传物质含量为靶标的抗性评价方法能够更为准确地评价小麦品种的抗性水平。在上述抗性评价方法的基础上，本发明还开发了利用不同抗性品种的品种多样性防控小麦条锈病的一套系统的方法，通过大量优化对比实验，确定了能够实现较高防控效率的品种多样性种植方法中的品种选择、品种混播等关键步骤的条件参数。

首先，本发明提供一种小麦条锈病抗性评价方法，包括：对待测小麦人工接种条锈菌，在潜育期提取小麦叶片dna，分别对条锈菌dna和小麦dna进行定量，根据小麦叶片dna中条锈菌dna与小麦dna的含量比值大小判断待测小麦的条锈病抗性水平。

本发明中，所述潜育期为人工接种条锈菌后至条锈病发病前；优选地，所述提取小麦叶片dna为在人工接种条锈菌后7-20天。

小麦条锈病的潜育期的长短与地理环境因素和潜育期阶段的天气条件有关，条锈菌在小麦叶片内扩展情况不同会影响其dna含量比例，本发明发现于人工接种条锈菌后的7-20天期间提取小麦叶片dna检测dna含量，能够更好地保证dna含量比值与小麦抗性水平的相关性，提高抗性评价的准确性。

作为本发明的一种实施方式，以四川盆地地区作为应用地，在当地气候条件下，所述提取小麦叶片dna为在人工接种条锈菌后的9-15天。优选地，在人工接菌后10天左右进行小麦叶片的采集和dna提取。

作为本发明的一种优选实施方式，上述小麦叶片的选择为每个小麦品种随机选择30～50片叶片。由于新叶刚长出来，没有接受人工条锈菌接菌，采集叶片的位置包括小麦植株下三叶，不包括最上方的新叶。

本发明中，所述对条锈菌dna和小麦dna进行定量为以所述小麦叶片dna为模板，分别对条锈菌和小麦的特异性靶标进行pcr扩增，得到条锈菌dna和小麦dna的含量比值。

上述pcr扩增可以采用本领域常用的定量pcr方法，为提高dna定量的准确性，作为优选，所述pcr为荧光定量pcr，所述荧光定量pcr的特异性引物和探针包括：

条锈菌特异性引物：

正向引物1：pst-f:ggatgttgagtgctgctgtaa；

反向引物1：pst-r:ttgaggtcttaaggttaaaattg；

探针1：pst-pro:tcacatcaaggattgtagcaatactgcca；

小麦特异性引物：

正向引物2：tag2315f：cagaaagcgagtggaaagatgaaag；

反向引物2：tag2473r:gcaaggaggacaaagatgaggaa；

探针2：tag-pro:caagcatcaaaggcaagcaagcagtagt。

上述特异性引物和探针为本发明经优化筛选获得，具有较高的特异性和扩增效率，能够提高dna定量的准确性。

为便于对利用上述抗性评价方法得到的小麦抗性水平的定量分析，作为本发明的一种实施方式，本发明将所述抗性水平的判断指标定义为分子病情指数或分子相对寄生适合度，其计算公式如下：

分子病情指数＝条锈菌dna质量/小麦叶片dna质量；

分子相对寄生适合度＝待测小麦品种的分子病情指数/感病对照品种的分子病情指数。

本领域技术人员应该理解，本发明实现准确的抗性评价的方法依赖于接种条锈菌的小麦叶片dna中条锈菌dna含量与小麦叶片dna含量的比例，上述抗性水平的判断指标的名称和计算公式只是为了方便定义和定量计算，本领域技术人员可以根据需要调整，并不会影响抗性评价方法的实现和准确性。

上述分子相对寄生适合度的计算中，所述感病对照品种可以选择小麦条锈菌的万能感病品种铭贤169或者选择待抗性检测小麦材料中感病水平最高(抗性水平最低)的品种。感病对照品种的分子病情指数评价方法的所有实验条件与待测小麦品种均应相同。

作为本发明的一种实施方式，所述感病对照品种为铭贤169。

通过对大量小麦品种的抗性水平检测和抗性表型观察，本发明确定了利用上述抗性评价方法判断抗性水平的标准：当所述分子相对寄生适合度为0时，所述小麦品种为免疫品种；当0＜分子相对寄生适合度≤0.01时，所述小麦品种为近免疫品种；当0.01＜分子相对寄生适合度≤0.1时，所述小麦品种为高抗品种；当0.1＜分子相对寄生适合度为≤0.3时，所述小麦品种为中抗品种；当0.3＜分子相对寄生适合度为≤0.6时，所述小麦品种为中感品种；当0.6＜分子相对寄生适合度为≤1.0时，所述小麦品种为高感品种。

本发明提供的上述抗性评价方法可以单独使用用于小麦条锈病抗性水平的评价，也可以与反应型、病情指数、病情进展曲线下面积audpc等传统的抗性评价方法中的一种或多种联合使用进行抗性评价。

在上述抗性评价方法的基础上，本发明提供一种利用品种多样性控制小麦条锈病的方法，包括：对应用地的小麦品种进行条锈病抗性评价，得到小麦品种的条锈病抗性水平，根据包括小麦品种的条锈病抗性水平在内的指标选择不同的抗性品种进行品种混播。

所述抗性评价的方法包括本发明提供的上述通过检测小麦叶片dna中条锈菌dna含量与小麦叶片dna含量的比例的抗性评价方法。

为进一步提高抗性评价的准确性，保证选择品种的多样性，作为优选，本发明提供的所述抗性评价的方法还包括利用病情调查方法得到包括小麦品种的反应型、病情指数以及病情进展曲线下面积audpc中的一种或多种。

利用病情调查方法进行抗性评价可以采用以下两种方法中的任意一种：

(1)在条锈病自然发生的地区，对小麦品种进行多年田间苗圃抗性检测，观察小麦条锈病的发病情况，获得反应型、病情指数数据以及病情进展曲线下面积audpc中的一种或多种，进行抗性评价；

(2)在条锈病不能自然发生的地区，通过田间人工接种小麦条锈菌，观察小麦条锈病的发病情况，获得反应型、病情指数数据以及病情进展曲线下面积audpc中的一种或多种，进行抗性评价。

本发明中，在进行田间人工接种条锈菌时，为能够更好地模拟自然条件下的田间条锈菌环境，所述人工接种条锈菌为在田间人工接种所述应用地流行的条锈菌生理小种或所述应用地流行的条锈菌的不同生理小种的混合物。

本发明中，利用上述抗性评价方法得到的抗性水平的判断标准如下：当所述分子相对寄生适合度为0时，所述小麦品种为免疫品种；当0＜分子相对寄生适合度≤0.01时，所述小麦品种为近免疫品种；当0.01＜分子相对寄生适合度≤0.1时，所述小麦品种为高抗品种；当0.1＜分子相对寄生适合度为≤0.3时，所述小麦品种为中抗品种；当0.3＜分子相对寄生适合度为≤0.6时，所述小麦品种为中感品种；当0.6＜分子相对寄生适合度为≤1.0时，所述小麦品种为高感品种。

当联合使用分子相对寄生适合度、反应型(stubbs,1985)进行抗性评价时，待测小麦品种的抗性水平判断标准如下：当所述反应型为0、所述分子相对寄生适合度为0时，所述小麦品种为免疫品种；当0＜分子相对寄生适合度≤0.01且反应型为0时，所述小麦品种为近免疫品种；当0.01＜分子相对寄生适合度≤0.1且反应型为1时，所述小麦品种为高抗品种；当0.1＜分子相对寄生适合度为≤0.3且反应型为2时，所述小麦品种为中抗品种；当0.3＜分子相对寄生适合度为≤0.6且反应型为3，所述小麦品种为中感品种；当0.6＜分子相对寄生适合度为≤1.0且反应型为4时，所述小麦品种为高感品种。

为保证用于品种混播的小麦品种的多样性，除以小麦品种的抗性水平作为品种的选择依据外，本发明还提供与抗性水平联合使用的、能够提高品种多样性选择的准确性和条锈病防控效率的其它指标。

作为优选，所述选择不同的抗性品种的选择标准包括：

(1)具有不同的抗性水平类型，至少包括一个中感品种或一个高感品种；例如可以选择如下品种组合用于品种混播：1高感品种+1中感品种或1中抗品种+1高抗品种，1高感品种+1中感品种+1中抗品种+2高抗品种，1高感品种+1中抗品种+3高抗品种，1中感品种+1中抗品种+1高抗品种；

(2)选择株高和生育期较为一致的小麦品种；

(3)选择含有丰富的有效抗性基因且所含抗性基因的差异度较大的小麦品种；

(4)选择对小麦条锈菌群体不同基因型的选择差异性较大且小麦条锈菌群体多样性水平较高的小麦品种。

上述(3)中，选择含有丰富的有效抗性基因为：选择含有多个抗性基因的小麦品种，发挥多个抗性基因联合抗性，同时所含抗性基因需为对应用地的小麦条锈菌优势生理小种有效的抗性基因，例如：全生育期抗条锈基因yr5和yr15以及成株期抗条锈病基因yr18，含有这些抗性基因的小麦品种对小麦条锈菌具有很好的抗性。

上述(4)中，选择对小麦条锈菌群体不同基因型的选择差异性较大且小麦条锈菌群体多样性水平较高的小麦品种为：通过对来源于单一种植品种上的条锈菌群体进行基因型和基因多样性分析以及群体遗传结构分析，分析不同品种对条锈菌群体的差异化选择，选取差异性大和条锈菌群体多样性水平高的品种。

作为优选，本发明用于品种混播的不同的抗性品种的数量为3～5个。

为提高品种多样性种植的条锈病防控效率，作为优选，所述品种混播为将不同品种等比例混合播种。

为提高品种多样性种植的条锈病防控效率，作为优选，所述品种混播的播种时间较所述应用地的正常播种时间晚5～7天。适时晚播5-7天，可以有效防控秋苗发病，防止造成大量的秋季菌源。

过小、过大的种植密度会影响品种多样性种植对小麦条锈病的防治效果，作为优选，所述品种混播采用中等密度种植。

小麦在不同应用地的适宜播种密度会因降雨、气候等环境因素，以及播种方式的不同存在较大差异，所述中等密度应该根据所述应用地的具体气候情况以及播种方式选择。

作为本发明的一种实施方式，在四川盆地地区采用人工播种的种植方式，所述中等密度种植为10-11公斤/亩。

大面积的连续田块能够增加了条锈菌的繁殖代数，使得品种多样性控害机制发挥的更加充分，提高品种混播的条锈病防控效果，作为优选，所述品种混播采用大面积种植。所述大面积为≥1亩。

在进行品种混播后，小麦品种多样性种植的条锈病病害监测、产量损失估计、田间水肥管理以及其它病害管理和防控方法可以按照本领域小麦种植的常规方法进行，以下仅作为示例性说明：

(1)小麦条锈病监测：对小麦条锈病的田间发生情况进行调查监测，记载小麦不同生长阶段的病害发生严重程度；

(2)产量损失估计：根据田间小麦条锈病的发生情况和对应的产量损失估计模型，对产量损失进行估计；

(3)田间水肥管理：包括冬前管理、春季管理以及中后期管理，分别采取不同的管理措施，以促进小麦健康生长为标准；

(4)其他病虫害管理：密切监测小麦其他病虫害的发生发展，包括小麦条锈病在内的小麦白粉病、赤霉病、纹枯病、蚜虫、吸浆虫和麦蜘蛛等“四病三虫”；

(5)应急化学防控：在其他非化学防治手段难以达到理想效果的年份，应采取应急化学防治；

(6)小麦条锈菌监测：及时了解全国及应用地的小麦条锈菌优势小种的变化情况，以及不同品种对条锈菌群体的选择信息。

上述步骤(1)和(2)中，应定期调查应用地不同田块小麦条锈病的病情，根据产量损失估算模型估计产量损失。

上述步骤(3)中，根据不同小麦生长区域的情况，因地制宜，合理管控水肥，尽量施有机肥，采用配方施肥，确保氮磷钾等营养元素均衡搭配，促进小麦植株的健康生产，增强植株的抗病能力。在土壤湿度大的地区及时清沟排水，以降低田间湿度，减轻发病程度；在北方麦区后期严重发病田块，适当灌水可减少产量损失。

上述步骤(4)中，在监测小麦条锈病病情发展的同时，密切监控其他小麦上的病虫害的发生情况，必要时采取措施控制其危害。为控制小麦生长期间害虫的种群数量，保障小麦的产量和品质，在小麦田田埂周边可以种植显花植物，以吸引寄生性天敌并为其持续提供蜜源，显花植物可保育天敌种群发展，增进天敌的控害功能，辅助控制害虫种群数量。

上述步骤(5)中，根据产量损失估算结果，在损失接近经济阈值时应结合其他农业、生物和化学等防治措施进行综合治理。在小麦不同生长区域，采用的防治标准可以有所不同；在使用农药时，应严格执行国家有关规定，杜绝使用高毒、高残留农药或有致癌、致畸、致突变的农药，并应符合gb4285、gb/t8321、gb4404.1、gb1351的规定，推荐使用ny/t393-2013中规定的绿色食品生产中允许使用的农药和其他植保产品。

上述步骤(6)中，通过对小麦条锈菌的监测，根据条锈菌变异的情况，及时更换混种的品种、数量或比例，可根据实际情况增加含有某个抗性基因的小麦品种，或减小某个抗性已经丧失的小麦品种。

本发明的有益效果在于，本发明提供了高效准确的小麦品种抗性评价方法，即利用分子病情指数和分子相对寄生适合度进行小麦品种的抗性评价，与传统的病情调查方法相比，检测分子病情指数和分子相对寄生适合度的抗性评价方法具有高效准确且省时省力等优势，能够显著降低小麦品种抗性评价的工作量、时间成本和人力成本，可以作为一个新的抗性评价方法单独或与其它抗性评价方法联合使用，用于小麦品种的抗性评价。

进一步地，本发明还提供了利用该抗性评价方法或联合该抗性评价方法和其它指标选择具有品种多样性的品种进行品种混播，形成小麦品种多样性种植的方法。利用本发明提供的品种多样性种植控制小麦条锈病的方法，在位于四川省绵阳市的小麦田进行的2016-2017、2017-2018年的试验中，与单一品种种植相比，绵农4号、川麦51和川育21组合进行品种混播对小麦条锈病的相对防控效率分别为81.93％和71.93％，小麦产量分别增加19.16％和5.57％，条锈菌群体优势遗传群组的比例分别从绵农4号的84.91％和85.71％，降为30.14％和57.5％。此外，在位于河南开封的小麦田进行的试验中，与单一品种种植相比，利用本发明提供的品种多样性种植方法的小麦条锈病的相对防控效率和小麦产量也显著提高。本发明提供的品种多样性种植方法显著降低了小麦条锈病的病情和病害，能够实现高效的小麦条锈病控制，有效提高了小麦的产量，延长品种的使用年限，且更有利于条锈菌群体遗传结构的稳定，对于小麦条锈病的生态防控具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中用于小麦品种抗性评价的小麦种植苗圃的高空航拍实物图。

图2为本发明实验例1中对小麦品种的audpc-di-2014、audpc-di-2016、adjust-mdi-2014和adjust-mdi-2016数据集进行聚类分析的结果。

图3为本发明实施例3中利用小麦品种组合绵农4号、川麦51和川育21在2016-2017年在四川绵阳进行田间小麦品种多样性种植(实验组)和单一品种绵农4号种植(对照组)的小麦条锈病发病情况对比图，其中a为单一品种种植(对照组)的小麦条锈病发病情况；b为小麦品种多样性种植(实验组)的小麦条锈病发病情况。

图4为本发明实施例3中利用组合绵农4号、川麦51和川育21在2017-2018年在四川绵阳进行田间小麦品种多样性种植(实验组)和单一品种绵农4号种植(对照组)的小麦条锈病发病情况对比图，其中a为单一品种种植(对照组)的小麦条锈病发病情况；b为小麦品种多样性种植(实验组)的小麦条锈病发病情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1利用分子病情指数和分子相对寄生适合度进行小麦品种的条锈病抗性评价的方法

本实施例提供一种小麦条锈病的抗性评价方法，通过对待测小麦人工接种条锈菌，在潜育期提取小麦叶片dna，分别对条锈菌dna和小麦dna进行定量，计算条锈菌dna与小麦dna的比值，根据条锈菌dna与小麦dna的比值大小判断待测小麦的条锈病抗性水平。以选自四川省小麦推广品种和后备品种中的100个小麦品种对于四川地区流行的条锈菌生理小种：条锈菌cyr32、cyr33和致病类型g22-83的抗性评价为例，于2014-2015年和2016-2017年在小麦条锈病不能自然发生地区——河南开封分别进行两次抗性评价实验，上述方法具体如下：

1、播种：选取100个待测小麦品种，在小麦条锈病不能自然发生地区进行播种，播种方式为每个品种1米行长，行间距0.25米，每个品种3个重复，同时种植对照品种铭贤169。用于小麦品种抗性评价的小麦种植苗圃的高空航拍图如图1所示。

2、室内繁菌：将铭贤169小麦浸泡在水中约10h后，留少许水并盖上纱布保持湿润进行催芽，待其发芽后将种子种在10×10×10cm的花盆中，覆盖薄层土后转移至气候室中，气候室温度设置为10-15℃，湿度为60-70％相对湿度，14/10h的昼夜光照(10,000lux)。当7-10天后第一片小麦叶片完全展开后开始接种小麦条锈菌：首先将小麦叶片表面的蜡质层去掉，均匀喷上适量的水，再将浓度为0.02％的tween-80溶液分别与小麦条锈菌cyr32、cyr33和致病类型g22-83配置成孢子悬浮液，均匀喷在小麦叶片上。接菌后为保持湿度以促进条锈菌的萌发，首先将小麦苗放置到黑暗的泡沫箱中，再放置于气候室中，24-48h后扣上玻璃罩子并置于气候室中，以避免不同菌株间的交叉污染。接菌后7-10天当看到条锈菌潜育斑时，剪去小麦新叶，再培养3-5天后开始产生夏孢子，待夏孢子成熟后收集夏孢子，可重复收集3-4次。如此重复室内繁菌步骤直至获得足够的田间人工接菌量。

3、田间人工接种条锈菌：于春季温度低温为5℃，高温为15℃左右时，进行田间条锈菌人工接种。将上述步骤2获得的小麦条锈菌生理小种cyr32、cyr33和致病类型g22-83等比例混合，用浓度为0.02％的tween-80溶液配置成80mg/l的孢子悬浮液，每1m行长接种20ml的孢悬液，接种后覆盖保鲜膜过夜以促进条锈菌萌发侵染，次日揭去保鲜膜。

4、采样：分别于人工接菌后第9天、第14天和第15天进行用于dna含量检测的小麦叶片样品采集，在每个品种的1m行长上随机采集30个小麦叶片作为一个样品(因接菌时最上方新叶尚未长出导致最上方新叶没有条锈菌的潜伏侵染，因此，不能采集最上方的新叶)，每个品种采集的30个叶片均被随机选取一段，用于dna的提取。

5、dna提取：采用ctab法提取接种条锈菌的小麦叶片的基因组dna。用分光光度计(ds-11spectrophotometer)检测基因组dna的质量。将得到的dna样品统一进行20倍稀释，用于后续荧光定量pcr检测。

6、荧光定量pcr：以步骤5提取的小麦叶片的基因组dna为模板，采用检测条锈菌和小麦的特异性引物和探针，进行荧光定量pcr检测，计算小麦叶片基因组dna中条锈菌dna和小麦dna的含量比值，特异性引物和探针的序列如下：

条锈菌的特异性引物序列如下：

pst-f:ggatgttgagtgctgctgtaa；

pst-r:ttgaggtcttaaggttaaaattg；

探针pst-pro:tcacatcaaggattgtagcaatactgcca小麦的特异性引物

序列如下：

tag2315f:cagaaagcgagtggaaagatgaaag；

tag2473r:gcaaggaggacaaagatgaggaa；

探针tag-pro:caagcatcaaaggcaagcaagcagtagt。

荧光定量pcr的反应体系为20μl：2.0μlbuffer(10×，mg²⁺free)，4.0μlmgcl2(25mmol/l)，2.0μldntp(2.5mmol/l)，0.4μl正向引物(10μmol/l)，0.4μl反向引物(10μmol/l)，0.3μl探针(10μmol/l)，0.4μltaqdna聚合酶(5u/μl)，2.0μl模板dna，7.6μlddh2o。

荧光定量pcr的反应条件：94℃，3min；94℃，20s；57℃，30s；72℃，20s；第2-4步循环40次；4℃保存。

为分别定量小麦叶片dna中条锈菌dna和小麦dna的含量，建立条锈菌和小麦dna的标准曲线。采用ctab法分别提取条锈菌夏孢子和未感病的小麦叶片的dna，并用分光光度计(ds-11spectrophotometer)测定其浓度，将提取的条锈菌dna和小麦dna分别进行10倍梯度稀释，分别得到6个条锈菌和和5个小麦dna标准品，采用上述荧光定量pcr的方法对各梯度稀释的dna标准品进行定量，每个dna标准品重复5次，分别记录相应的ct值。以ct值为横坐标，以相应的dna标准品的浓度的log值作为纵坐标分别建立小麦和条锈菌dna定量的标准曲线。

对于每一次定量检测，都以条锈菌dna和未感病的小麦叶片dna分别作为两个阳性对照，以ddh2o作为阴性对照，每个接种条锈菌的待测小麦的叶片dna样品重复定量三次，分别计算条锈菌dna和小麦dna的平均ct值，根据上述建立的标准曲线，分别计算得到接种条锈菌的待测小麦的叶片dna中条锈菌dna和小麦dna的浓度。根据计算得到的每个品种3个重复的平均条锈菌dna和小麦dna的浓度，分别计算分子病情指数和分子相对寄生适合度，以分子病情指数或分子相对寄生为抗性评价指标评价待测小麦对于条锈菌的抗性水平：

分子病情指数(mdi)＝条锈菌dna的量/小麦dna的量；

分子相对寄生适合度(mrpf)＝待测小麦品种的mdi值/待测小麦品种中抗性水平最低的小麦品种的mdi值。

实施例2采用传统的病害调查方法进行抗性评价

本实施例提供一种小麦条锈病的抗性评价方法，为采用传统的病害调查方法进行抗性评价，小麦品种的播种、室内繁菌和田间人工接种条锈菌同实施例1的步骤1、2和3所述，与实施例不同的是不进行实施例1的步骤4、5和6，在步骤3(田间人工接种条锈菌)后进行如下病情调查：

病害调查：病害调查在铭贤169显示症状后开始，总共调查5次，每次间隔3-5天，2014-2015和2016-2017的两次试验的第一次调查病情的时间分别为2015年4月7日和2017年4月1日。每个品种随机选取25个植株的共100个小麦叶片记录发病的严重度。严重度评估标准根据条锈菌占叶片面积的比例，分别为1％、5％、10％、20％、40％、60％、80％和100％(商鸿生等,1990)。病情指数(diseaseindex,di)＝普遍率(％)×平均严重度(％)×100

普遍率(％)＝病叶数/调查总叶数×100％

平均严重度(％)＝∑(各严重度值×各严重度值对应的病叶数)/调查总叶数×100％

进一步跟进病情指数di计算病情进展曲线下面积audpc，计算公式如下：

其中，n是调查的总次数，xi和xi+1分别是第i和i+1次调查的病情指数di，ti和ti+1分别是第i和i+1次调查的日期。

实验例1不同抗性评价方法对于小麦抗性水平评价效果的比较

数据分析：为与实施例2中的传统的采用病情调查方法进行抗性评价的方法进行比较，分析采用实施例1的分子病情指数mdi和分子相对寄生适合度(mrpf)进行小麦品种抗性评价的准确性，将2014-2015和2016-2017的两次实验中在人工接菌后的14天采集小麦叶片计算得到的mdi(mdi-14dai)和15天采集小麦叶片计算得到的mdi(mdi-15dai)分别乘以一个系数(adjust-mdi-2014,adjust-mdi-2016)，使其最大值分别与2014-2015和2016-2017的两次实验获得的audpc-di(audpc-di-2014,audpc-di-2016)的最大值相等，以便于进行聚类分析。使用r语言(rstudio×643.4.1)对audpc-di-2014、audpc-di-2016、adjust-mdi-2014和adjust-mdi-2016数据集进行聚类分析，其中，类与类之间的距离采用类平均法计算方法，距离采用欧式距离，比较采用audpc-di和mdi两种方法的品种抗性评价方法的准确性的差异。

对于四川省小麦推广品种和后备品种中的100个小麦品种的抗性评价结果如表1所示；对100个小麦品种的audpc-di-2014、audpc-di-2016、adjust-mdi-2014和adjust-mdi-2016数据集进行聚类分析的结果如图2所示，结果表明，采用实施例1的分子病情指数(分子相对寄生适合度)进行小麦品种的抗性评价与采用传统的病情调查方法得到的audpc-di抗性评价结果具有很好的一致性，分子病情指数和分子相对寄生适合度可以作为一个新的、准确有效的抗性评价方法。

表1小麦品种的分子相对寄生适合度(mrpf)和audpc-di的评价结果

综合抗性评价和聚类分析结果，根据分子相对寄生适合度将小麦品种进行抗性分型：分子相对寄生适合度为0，小麦品种为免疫品种；0＜分子相对寄生适合度≤0.01，小麦品种为近免疫品种；0.01＜分子相对寄生适合度≤0.1，小麦品种为高抗品种；0.1＜分子相对寄生适合度为≤0.3，小麦品种为中抗品种；0.3＜分子相对寄生适合度为≤0.6，小麦品种为中感品种；0.6＜分子相对寄生适合度为≤1.0时，小麦品种为高感品种。

实施例3利用品种多样性种植控制小麦条锈病

本实施例以四川省小麦种植为例，提供一种利用品种多样性种植控制小麦条锈病的方法，具体如下：

1、小麦品种的抗性评价

(1)利用分子相对寄生适合度(mrpf)进行抗性评价：100个四川省小麦推广品种和后备品种的分子相对寄生适合度(mrpf)的检测方法及检测结果如实施例1所示。

(2)利用病情调查方法进行抗性评价：在上述实施例1的人工接菌小麦的生长过程中，同时采用实施例2的方法进行病情调查。病情调查在对照品种铭贤169表现症状后开始，总共调查5次，每次间隔3-5天，每次调查均记录每个品种小麦的生长阶段、株高，同时调查获得每个品种的生育期长短，每个品种随机选取25个植株的共100个小麦叶片记录发病的严重度，严重度评估标准根据条锈菌占叶片面积的比例，分别为1％、5％、10％、20％、40％、60％、80％和100％(商鸿生等，1990)计算得到病情指数。病情指数(diseaseindex,di)＝普遍率(％)×平均严重度(％)×100。

其中，n是调查的总次数，xi和xi+1分别是第i和i+1次调查的病情指数di,ti和ti+1分别是第i和i+1次调查的日期。

100个小麦品种的抗性评价结果如实验例1所示，根据mrpf和audpc将所有小麦品种进行抗性水平分型：当所述分子相对寄生适合度为0，所述小麦品种为免疫品种；当0＜分子相对寄生适合度≤0.01时，所述小麦品种为近免疫品种；当0.01＜分子相对寄生适合度≤0.1，且audpc≤6时，所述小麦品种为高抗品种；当0.1＜分子相对寄生适合度为≤0.3，且6<audpc≤30时，所述小麦品种为中抗品种；当0.3＜分子相对寄生适合度为≤0.6且30<audpc≤60时，所述小麦品种为中感品种；当0.6＜分子相对寄生适合度为≤1.0且audpc＞60时，所述小麦品种为高感品种。

2、抗性品种选择：

(1)根据上述步骤1获得的小麦品种抗性水平分型信息以及株高、生育期的小麦品种信息，同时结合各小麦品种已知的抗性基因信息，选择不同的小麦抗性品种用于品种混播，选择标准如下：(1)具有不同抗性水平类型，至少包括一个中感或高感品种；(2)株高相近且生育期长短相近；(3)含有丰富的有效抗性基因且所含抗性基因的差异度较大；此外，为满足市场需求，同时考虑受市场欢迎程度的因素，选择受市场欢迎程度较高的品种。

综合上述所有选择标准，从100个品种中剔除了大部分小麦品种，筛选得到5个备选品种，分别为高感品种绵农4号、中感品种内麦9号、中抗品种川麦51、高抗品种川育21和高抗品种川麦55。

(4)在上述筛选得到的5个备选品种中选择对小麦条锈菌群体不同基因型的选择差异性较大且小麦条锈菌群体多样性水平较高的小麦品种，具体方法如下：

于2015-2016年对上述筛选得到的5个品种进行小麦条锈菌选择差异性分析，筛选具有较大的条锈菌选择差异性的抗性品种，具体方法如下：将上述5个小麦品种种植于品种来源地四川省梓潼县试验田，因四川盆地地区常年发生小麦条锈病，因此，在3月份小麦条锈病发病盛期，分别采集来源于不同品种上的小麦病叶，在室内进行单胞挑取，获得单胞系，对不同小麦品种上的条锈菌样品进行基因型和基因多样性分析以及群体遗传结构分析，采用如表2所示的10对已经发表的小麦条锈菌ssr引物对来源不同小麦品种上的条锈菌样品进行pcr扩增，根据其目标条带的多态性，统计不同条锈菌群体的基因型，利用vat软件评价不同条锈菌群体的基因多样性水平，利用ntsys对所有个体进行聚类分析，分析不同群体条锈菌个体的聚类分组。选择对小麦条锈菌的选择差异性较大且条锈菌群体多样性高的品种作为混播的品种。

表2序列表用于ssr扩增的引物序列

上述5个备选小麦品种的小麦条锈菌群体多样性分析结果如表3所示，基因型多样性显示高抗品种川育21(d)的基因型多样性最高，为0.683，明显高于其他四个品种，同样，川育21(d)的最大基因型频率也明显低于其他四个品种。基因多样性有三个衡量指标，分别为kosman多样性(kw)，nei多样性(hs)和香农标准系数(sh)，综合三个指标显示，高抗品种川育21(d)的基因多样性最高。差异性选择分析结果如表4所示，结果表明，绵农4号的优势遗传分组为第7组，频率是84.91％，内麦9号的优势遗传分组为第1组，频率是77.61％，川麦51的优势遗传分组为第3组，频率是56.72％，川育21的优势遗传分组为第1组，频率是38.33％，川麦55的优势遗传分组为第6组，频率是49.09％。

表35个不同小麦品种的条锈菌群体多样性分析

表45个不同小麦品种的条锈菌群体遗传分组分析

根据上述分析结果，选取高抗品种川育21，中抗品种川麦51和高感品种绵农4号进行品种多样性种植。

3、品种混播：选取四川省绵阳市梓潼县常年发生严重条锈病的小麦田作为种植试验田，分别于2016-2017年和2017-2018年的两年间进行两次实验：分别称取高抗品种川育21，中抗品种川麦51和高感品种绵农4号这3个小麦品种的种子各85g，混合均匀；均匀播种于4米长，4米宽的小麦田中，行间距0.25米，共16行，共设置三个重复。

4、小麦条锈病监测和产量损失估计：对步骤3的品种混播小麦田的小麦条锈病的田间发生情况进行定期调查监测，记载小麦不同生长阶段的病害发生严重程度。

根据田间小麦条锈病的发生情况和对应的产量损失估计模型，对产量进行损失估计，具体的产量损失估计模型如下：

小麦灌浆期病情产量损失模型：l＝5.3092+0.5108x

小麦扬花期病情产量损失模型：l＝0.24599+0.63148x

式中：

l——产量损失率(％)；

x——关键期病情指数。

5、田间水肥管理：在整个小麦生长阶段定期观察小麦生长情况、土地情况，结合当时的气候条件，决定是否和何时灌溉，以促进小麦健康生长。

6、其他病虫害管理：密切监测小麦其他病虫害的发生发展，在必要时从采取防控手段，降低其危害水平。

上述品种混播实验分别于2016-2017年和2017-2018年的两年间进行两次实验，2016-2017年和2017-2018年的两次实验的小麦条锈病发病情况对比分别如图3和图4所示，结果表明，品种混种能够明显的降低小麦条锈病的发生以利用上述品种多样性控制方法种植的小麦田为实验组，以上述三个品种各品种单种为对照组(与实验组的区别仅在于播种的品种的不同)，根据公式c＝(a2-a1)/a2×100％计算小麦条锈病的相对防控效率(其中，a1是实验组的病情进展曲线下面积audpc，a2是三个品种各品种单种的病情进展曲线下面积audpc的平均值)；统计实验组和对照组小麦田的产量，根据公式c＝(a2-a1)/a2×100％计算品种多样性种植的相对产量增加(其中，a1是实验组的产量,a2是三个品种各品种单种的产量的平均值)；同时通过分别采集来自单种和混种的发病叶片，分离纯化条锈菌，采用如表2所示的10对引物对其进行ssr扩增，统计不同条锈菌群体的基因型，利用ntsys对所有个体进行聚类分析，分析不同群体条锈菌个体的优势遗传分组比例。结果显示，在2016-2017年和2017-2018年的实验中，绵农4号、川麦51和川育21这三个品种进行品种混播对小麦条锈病的相对防控效率分别为81.93％和71.93％，小麦产量分别增加19.16％和5.57％，条锈菌群体优势遗传分组的比例分别从对照组绵农4号的84.91％和85.71％，降为30.14％和57.5％。

由此可见，本发明实施例3提供的利用品种多样性控制小麦条锈病的方法能够大大降低小麦条锈病的病情和病害，有效提高小麦种植的产量，同时能够有效促进条锈菌群体遗传结构的稳定，对于小麦条锈病的生态防控具有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序列表

<110>中国农业大学

<120>一种小麦条锈病的抗性评价方法及利用品种多样性控制小麦条锈病的方法

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