一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法与流程

本发明涉及生物医学领域的检测方法，具体涉及一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法。

背景技术：

近年来，多重核酸检测(nucleicacidsdetection,nat)由于成本低、时间短、操作便捷等优势在很多领域得到了广泛的应用，如临床诊断、转基因检测、微生物监测、法医检验领域等，特别是对于现场实时检测(pocts)发挥了很大的作用(yager,p.,etal.,2008,annu.rev.biomed.eng.,10,107-144；guo,j.,etal.,2011,anal.chem.,83(5),1579-1586；sciancalepore,a.g.,etal.,2013,foodmicrobial.,35(1),10-14；estes,m.d.,etal.,2012,analyst,137(23),5510-5519；niemz,a.,etal.,2011,trendsbiotechnol.,29(5),240-250)。

在核酸扩增分析中，环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)因其灵敏度高、特异性强、效率高，对专业设备要求低等特点而被广泛应用(notomi,t.,etal.,2000,nucleicacidsres.,28(12),e63-e63)，在过去的十年中，lamp方法与不同系统比如微流控和毛细管等系统整合在一起，为开发多重检测平台提供了巨大的潜力，与常规检测方法相比，微流控技术或毛细管技术可以结合核酸扩增分析、免疫分析和细胞操作的过程，并将反应过程整合在很小的芯片或毛细管中。这种微型反应系统有助于开发更加智能化、自动化的分析系统，并且密封性良好，以减少交叉污染的机会及手动步骤，以此来实现一个快速、多元化并易于操作的分析系统(mccalla,s.e.,etal.,2011,annu.rev.biomed.eng.,13,321-343；asiello,p.j.,etal.,2011,labchip,11(8):1420)。

基于微流控芯片的多重lamp技术已经被用于开发现场实时检测(poc)的设备，2010年，fang等人开发了微型lamp(μlamp)系统，该系统将lamp扩增和八通道微流控芯片结合在一起进行病原体检测(fang,x.,etal.,2010,anal.chem.,82(7),3002-3006)。为了改善μlamp方法，该课题组又开发了一种章鱼形状的多重微流控lamp(mμlamp)系统(10个微反应室)用于区分三种人类a型流感亚型并鉴定八种重要的猪流感病毒(fang,x.,etal.,2010,anal.chem.,83(3),690-695)。在μlamp和mμlamp多重核酸检测平台的基础上，开发出便携式集成微芯片系统即集成化微型lamp体系(iμlamp)对细菌(结核杆菌、转基因大肠杆菌)进行单重、多重检测，并且能够实现“样品进-结果出”的一体化检测模式(fang,x.,etal.,2012,labchip,12(8),1495-1499)。另外，开发了一种微流控芯片对多种病原体用lamp方法进行定量分析，其中包含15个互连反应孔阵列，并且整个过程一次加样即可(tourlousse,d.m.,etal.,2012,biomed.microdevices,14(4),769-778)。基于类似的微流控芯片系统，一个基于智能手机的现场测试设备gene-z被生产用于快速定量检测多个遗传标记，具有高灵敏度和特异性(stedtfeld,r.d.,etal.,2012,labchip,12(8),1454-1462)。除此之外，macro平台是另一种高通量系统，可以在一次测试中同时检测100多个靶标(shao,n.,etal.,2014,anal.chem.,86(2),1269-1276)，然而，对于微流控芯片系统来说，仍有一些不足的地方，比如芯片的制作工艺繁琐复杂，引物固定也相对困难。

与微流控芯片的复杂操作和高成本制造相比，毛细管成本低廉，其虹吸特性易于反应样品自动载入，而且可方便集成为毛细管阵列用于多重反应及检测，基于上述的种种优势，毛细管通道的系统近年来也逐渐运用到了多重核酸检测中。2013年，liu等报道了第一个结合环介导等温扩增(lamp)方法的高通量毛细管阵列微系统(10个样品并行)，该系统通过微滴技术与磁珠(mb)的使用，将dna提取、lamp和在线荧光检测的整个分析过程整合在毛细管阵列中。它可以在50分钟内自动完成，并且可以同时检测10种细菌(liu,d.,etal.,2013,anal.chem.,85(9),4698-4704)。2014年，zhang等人建立了一种高效、多重并且能够实现现场检测的基于毛细管的环介导等温扩增(clamp)的体系，该体系能够从多个血浆样品同时检测人类免疫缺陷病毒(hiv)的两个rna靶标，并且能够检测到两个拷贝的标准质粒(zhang,y.,etal.,2014,anal.chem.,86(14),7057-7062)。另外，整合的基于微毛细管的环介导等温扩增(iclamp)系统通过提前固定试剂和dna提取卡的可以在150分钟内实现未处理的血液样品“样品进-结果出”的一体化检测模式，并且能够实现现场核酸检测(zhang,l.,etal.,2014,anal.chem.,86(20),10461-10466)，先前研究也报道了一种基于毛细管阵列的多重可视化检测体系(calm平台)，该平台能够同时检测七种常用的转基因元件和五种植物内源参考基因，具有高特异性和高灵敏度(shao,n.,etal.,2017,labchip,17(3),521-529)。然而，易于提高检测通量、操作方便、成本低廉的多重检测方法仍然还有待开发。

基于calm平台的前期工作，为了进一步简化毛细管阵列的制作及加样过程，本发明建立了一种新型、快速、简便的圆盘状毛细管芯片平台(rcc)，该平台将环介导等温扩增(lamp)方法与圆盘状毛细管阵列结合在一起用于转基因作物的检测。该轮盘式毛细管芯片在聚二甲基硅氧烷(pdms)微通道的中心圆孔中加入反应液进行lamp反应，最后通过简易的紫外装置进行结果观察。以6或10通道的rcc平台的性能测试结果为基础，以常见转基因元件分析为例，验证了rcc平台在核酸检测中具有高特异性、高灵敏度、高产能和高可行性等优点。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法，具体是一种提高检测通量和检测效率、降低检测成本和样品耗费的基于毛细管微阵列的核酸高通量检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明涉及一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

第一步、将毛细管固定于pdms基座微阵列中，经过疏水处理后，将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中，再放置烘箱中干燥；

第二步、预制含有样品核酸的除引物外的其他核酸扩增反应组分，形成核酸扩增体系；

第三步、将反应预混液从圆盘状毛细管微阵列中心圆孔加入，并将圆盘状毛细管微阵列密封好置于控温条件下进行扩增反应；

第四步、通过简易的紫外检测装置对毛细管中的荧光信号进行检测和观察。

优选地，第一步中，所述干燥的作用是为了将核酸扩增引物附于毛细管内壁。

优选地，第一步中，所述核酸扩增引物包括但不限于：普通pcr引物、实时定量pcr引物、环介导等温扩增引物、滚环扩增引物、重组酶聚合酶扩增引物；

其中，当所述核酸扩增引物为实时定量pcr引物时，引物是同相应探针一并加入毛细管中的。

优选地，第一步中，所述毛细管微阵列的获得方式包括通过模具一次性加工成型；进一步地，所述加工成型是用制模浇铸。

进一步优选地，所述基底的材质包括塑料、玻璃、金属及其它高分子材料；其中，所述其它高分子材料如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、橡胶等；微管道为亲水性毛细管，所述基于圆盘状毛细管微阵列的毛细管的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面，毛细管通道内部为亲水性面。

优选地，第一步中，所述加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入毛细管通道中；其中，所述交联剂为：质量百分比为0.1-1％的壳聚糖的乙酸水溶液，ph为4.5-6.0；

优选地，第三步中，所述加入具体指通过虹吸作用将核酸扩增反应组分引入各微管道中；

优选地，第三步中，所述的基于圆盘状毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，所述加入具体指通过圆盘状毛细管阵列的中心圆孔加入。

优选地，第四步中，所述测量可以是借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测，也可以是通过肉眼辨别颜色或亮度差异；具体是指：每次测量前需用相应发射波长的光源照射微管道内反应物，再进行测量。

优选地，第四步得到的可回收产物可用于后续其它检测，具体是指：可单独回收特定毛细管内的产物或一次性回收所有毛细管内产物，进一步用于包括琼脂糖凝胶电泳、核酸杂交、dna芯片、dna测序等方法的检测。

优选地，所述方法中，第三步的温控的装置及第四步的所述测量可集成于一个自动化装置，由软件程序控制其自动运行。

优选地，所述方法既可以在单个反应管中单独实现，也可以在6通道、10通道甚至更多通道中实现。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、该圆盘状毛细管微阵列只需要通过pdms在模具上浇铸，烘干2～4小时即可，制作过程简单，省时省力，并且能够节约成本，提高阵列制作效率。

2、利用圆盘状毛细管微阵列和亲疏水特性，通过从中心圆孔加样可快速便捷地将反应液一次性加入多个微管道中，从而提高了一次检测的通量和检测效率。

3、采用微管道作为反应空间也大大减小了试剂样品用量，从而降低了检测成本。

4、本发明可适用于各种核酸高通量快速检测领域，如传染病快速检测、出入境检验检疫、食品安全和转基因检测、刑侦鉴定等。

附图说明

下面是结合附图和实例对本发明进一步说明：

图1为本发明以实施例1为例的工作流程图；

图2为毛细管微阵列；

图3为加样原理示意图；

图4为实施例1和实施例2中引物排列模式图；

图5为实施例1结果示意图；

图6为实施例2结果示意图；

图中：1.p-camv35s、2.p-fmv35s、3.pat、4.nptii、5.adh1、6.空白对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：利用环介导等温扩增(lamp)对成分已知转基因材料的多重检测

针对目前转基因产品中常检出的4种转基因元件和玉米的内源参照基因，查询相关文献，找到针对这些基因的lamp引物组，用含钙黄绿素染料的常规lamp反应对所有引物进行验证筛选，每种基因筛选出一套可以成功检出的lamp引物组。引物具体信息如下表1所示：

表1

将实验室已有的转基因玉米事件mon863的种子粉末，利用商业化的dna提取试剂盒进行基因组dna的提取和纯化，再利用nanodrop1000验证dna的浓度，作为待测样品。

利用毛细管微阵列平台进行多重lamp反应。即事先用移液器将5组lamp引物(微阵列中微管道1-5分别为：p-camv35s、p-fmv35s、pat、nptii、adh1、空白对照)分别加入阵列中的各毛细管中并干燥固定，通过虹吸作用加入含dna模板的lamp反应体系，进行多重lamp反应。每个反应体系仅有1.6μl。

具体加样过程见图3，通过圆盘状毛细管阵列的中心圆孔加样，通过虹吸作用自动分散到周围的毛细管中。

其他未明确给出的反应条件均为常规核酸扩增条件。

结果检测和分析。待反应结束后用发射波长为365nm的手持式紫外灯从反应管侧面照射，激发微管道内反应物发出荧光，再用数码相机从反应管顶部朝下拍照记录微阵列中各个毛细管内的荧光信号。用photoshop7.0(adobesystemsinc.,usa)将照片格式转换为16bittiff格式，再使用genepixpro6.1(moleculardevices,usa)读取每根毛细管的具体荧光强度。

由图5，并结合模式图4可知，结果图中阳性信号分别是序号：1、4、5，其对应的靶标名称分别是：p-camv35s、nptii以及玉米内源基因adh1，查找相关数据库和文献得出，理论上该转基因玉米所含转基因元件和玉米內源基因在毛细管微阵列多重lamp反应中一次性全部检出，对于同一样品的两次重复，检测结果完全一致，且都与预期相符。

实施例2：对成分未知转基因材料的多重检测

利用上述实验过程对由美国农业部(usda)的下属机构，gipsa(谷物检验、批发及畜牧场管理局)提供的样品c4.2进行检测，检测结果如附图6，由图6并结合模式图4可知，结果图中阳性信号分别是序号：1、2、5，其对应的靶标名称分别是：p-camv35s、fmv-35s及玉米内源基因adh1。将此结果与独立进行的real-timepcr实验结果进行比较，所检出靶标完全一致，故可以认为该检测方法具有很高的特异性和准确性，real-timepcr实验结果如下：

表2

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。