肿瘤靶向的诊疗联用单分子先导化合物的制备方法和应用与流程

本发明涉及一种肿瘤靶向的诊疗联用单分子先导化合物的制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术：

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，当前尚无满意的防治措施。虽然临床对肿瘤诊治技术的不断增加，手段也在不断更新，而肿瘤的治疗却日渐成为“持久战”，为肿瘤患者带来经济上的极大负担和思想包袱。因而，作为临床肿瘤治疗中发展最快和最为重要的药物化疗，如何从分子设计层面出发，研发高效、安全和经济适用的具有靶向性准确肿瘤诊断、分级、预后评价及治疗于一体的诊治联用的肿瘤化疗药物，对于改善肿瘤治疗效果，减轻患者经济负担、提高患者生存质量具有十分重要意义，是未来肿瘤个性化治疗策略的巨大挑战和发展方向，蕴藏着巨大的应用研究价值。

能在组织、细胞乃至细胞器富集的可视化诊断精确靶向治疗先导化合物是当前生物医药的重大新药创制方向。因此探寻具有靶向富集药物于肿瘤组织，并能可视化诊断与双治疗功能偶联先导化合物的开发具有重要意义。

线粒体是双层膜包被的细胞器，其较大的跨膜电位和线粒体蛋白的进入机制是其被用来靶向输送药物的两个基本特性。线粒体靶向属于细胞器水平的靶向，与正常细胞相比，肿瘤细胞线粒体膜电位要高出60mv，且还有更高水平的活性氧自由基水平。离域亲脂阳离子如三苯基膦和地喹氯铵基团等可在线粒体膜电位的驱动下,选择性靶向至线粒体并杀死癌细胞,其作为线粒体靶向载体得到了广泛的应用(刘爱赟,侯晓双,丁娅.基于线粒体靶向机制的抗肿瘤制剂的研究进展[j].药学学报,2017,52(6):879-887)。研究者们还发现，一些含叔氮盐的基团也被作为线粒体靶向剂(ruiguo,junlingyin,yanyanma,etal.anovelmitochondria-targetedrhodamineanaloguefordetectionofviscositychangesinlivingcells,zebrafishesandlivingmice[j].j.mater.chem.b,2018,6,2894-2900.)。此外，一些物质如光敏剂在特定波长的激光照射下，激发态的光敏剂把能量传递给组织周围的氧生成活性氧(ros)。借助线粒体膜电位靶向至线粒体后,在近红外光转化的紫外光照射下,产生大量ros,最终促进桥连线粒体内、外膜的非特异性通道持续性开放，开启线粒体途径的凋亡，有效抑制肿瘤的生长。

光学分子成像具有低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为成为分子成像中研究热点，尤其是近红外荧光(near-infraredfluorescent，nirf)成像能动态标记特定组织及病理状态下特殊物质在细胞内的时空分布，实现在活细胞、组织中“靶向性”示踪，使其在肿瘤早期诊断、术中导航、预后分析和监测复发诊断方面显示出其他技术手段不可替代的优势。与可见光相比，近红外荧光可穿透更深层的组织，据报道最大可穿透12cm的乳腺或肺组织，6cm的肌肉组织，5cm的成人脑组织。因此，基于近红外荧光成像具有好的组织穿透性而成为分子影像肿瘤诊断的研究热点。

研究者们基于上述需求和特点，已经开展了诸多的靶向诊疗系统，如北京大学戴志飞等构件了近红外荧光成像及化疗光热治疗于一体的多功能纳米胶囊(戴志飞,高闯,梁晓龙.一种集近红外荧光成像及化疗光热治疗于一体的多功能纳米胶囊[p].2017,201710731080.1)；苏州大学刘庄教授课题组也基于多模态成像在肿瘤精准治疗中的巨大优势构建了一个具有碳酸钙-多巴胺-m(fe,mn,zn,co)和二氢卟吩的具有光声成像(pa)、mri成像介导下的光动力治疗系统(dongz.l.,fengl.z.,haoy.,etal.synthesisofhollowbiomineralizedcaco3-polydopaminenanoparticlesformultimodalimaging-guidedcancerphotodynamictherapywithreducedskinphotosensitivity[j].j.am.chem.soc.,2018,140(6),2165-2178)。较纳米载药系统而言，有机药物分子作为化学治疗药物因其容易重复制备、物理化学性质确定、容易生物降解与代谢等优点一直被临床药物治疗所应用和了解。因此，集成像诊断、靶向药物递送、光动力治疗和化学治疗协同的多功能有机小分子先导化合物具有十分重要的意义和良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的主要技术问题是针对现有临床对未来个性化医疗需求靶向药物、诊疗联用药物，以克服目前恶性肿瘤诊治领域出现的成像与治疗模式单一、诊治效果差、单一疗法对肿瘤的不敏感性等缺点，实现针对恶性肿瘤早期的近红外荧光成像诊断以及原位光动力治疗与化疗协同治疗和治疗过程疗效评估。

本发明的目的是提供一种集肿瘤线粒体靶向、近红外荧光成像诊断、近红外光动力治疗协同化学治疗的肿瘤靶向的诊疗联用单分子先导化合物的制备方法和应用。

肿瘤靶向的诊疗联用单分子先导化合物的制备方法，包括以下步骤：1)3-二乙氨基酚与邻苯二甲酸酐于甲苯中110℃反应制得中间体1；2)将中间体1与环己酮在浓硫酸下反应制备得到中间体2；3)将中间体2与n,n-二(2-氯乙基)-4-氨基-苯甲醛在正丁醇和环己烷(7:3)混合溶液中，135℃下反应制得先导化合物；见以下反应路线：

本发明的目的在于提供上述单分子先导化合物在肿瘤靶向诊断协调光动力治疗和化学治疗联合治疗中的应用。

所述肿瘤为肝癌hepg2和黑色素瘤b10f16。体外靶向能靶向于肝癌hepg2细胞和黑色素瘤b10f16细胞线粒体。

所述诊断为分子影像学中的荧光成像诊断，尤其是近红外荧光成像诊断。

所述联合治疗是以芳香氮芥共轭偶联到光敏剂的组合方式，产生化疗与光动力治疗协同肿瘤治疗。

所述光动力治疗是以萜咕共轭芳香环形成新的光敏剂，其具有近红外光吸收，激发波长为625nm，荧光发射波长为714nm。所述先导化合物能够在肝癌hepg2细胞或黑色素b10f16细胞或小鼠黑色素瘤b10f16动物模型中进行近红外荧光成像体外诊断。

所述先导化合物在避光下对肝癌hepg2细胞和黑色素瘤b10f16细胞具有一定的化学治疗作用。在625nm激光照射下对肝癌hepg2和小鼠黑色素瘤b10f16细胞具有良好的光毒性，产生化学治疗和光动力治疗协同作用。

所述先导化合物能在黑色素瘤b10f16肿瘤动物模型中进行肿瘤组织近红外荧光成像诊断，且荧光成像诊断时间长达24h。

所述先导化合物能在黑色素瘤b10f16肿瘤动物模型中进行肿瘤组织近红外光动力治疗协同化学治疗治愈肿瘤，给药量为2.0μmol/kg。

所述先导化合物的近红外荧光成像诊断，能在肿瘤部位或尾静脉注射近红外对肿瘤组织24h内荧光成像。

所述先导化合物的肿瘤组织近红外光动力治疗协同化学治疗治愈肿瘤，能在肿瘤部位或尾静脉注射具有治愈肿瘤。且先导化合物的体内靶向性，能在尾静脉注射后经线粒体靶向化合物于肿瘤部位。

采用上述技术方案的有益效果是：

本发明所述的单分子多功能诊疗联用先导化合物能够通过荧光成像,对肿瘤进行近红外定位且可以通过活体荧光成像监测本发明所述先到化合物的靶向肿瘤富集,并于肿瘤病灶引导精准的光动力产生大量ros,达到光动力治疗和化学治疗协同治疗,有效改善了疗效。

附图说明

图1为本发明所述的单分子多功能诊疗联用先导化合物合成路线。

图2本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的1hnmr。

图3本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的13cnmr。

图4本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的高分辨质谱图。

图5本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的吸收光谱图。

图6本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的荧光激发光谱图。

图7本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物光辐射产生单线态氧。

图8本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对hepg2细胞暗毒性和光毒性(λirr＝660nm,n＝3)。

图9本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16细胞暗毒性和光毒性(λirr＝660nm,n＝3)。

图10本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16细胞线粒体靶向性及荧光成像诊断。

图11本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对hepg2细胞线粒体靶向性。

图12本发明所述分子多功能诊疗联用先导化合物进入b16f10细胞后2min,5min,10min,30min成像。

图13本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16细胞光辐射产生ros。

图14本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对hepg2细胞光辐射产生ros。

图15本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠肿瘤近红外荧光诊断。

图16本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠肿瘤未光照和光照治疗效果图。

图17本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠在未光照和光照后小鼠体重变化(n＝4)。

图18本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠在未光照和光照后小鼠肿瘤组织体积变化(n＝4)。

图19本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠肿瘤近红外荧光诊断。

图20本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠肿瘤未光照和光照治疗效果图。

图21本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠在未光照和光照后小鼠肿瘤组织体积变化。

图22本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b10f16小鼠在未光照和光照后小鼠体重变化。

图23本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物与生理盐水对照对b10f16小鼠在未光照和光照后7天肿瘤变化。

图24本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物与生理盐水对照对b10f16小鼠在未光照和光照后7天肿瘤经he染色后的组织学切片。

图25本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物与生理盐水对照对b10f16小鼠在未光照和光照后7天主要脏器经he染色后的组织学切片。

图26本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物与生理盐水对照对健康小鼠尾静脉给药7天后肝功能和肾功能变化情况。

具体实施方式

下文将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下文所述是对本发明的解释而不是限定。

1、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的合成：

本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的合成路线如图1所示，合成方法主要参照文献(i:chunyanwang,keithman-chungwong.selectivehg²⁺sensingbehaviorsofrhodaminederivativeswithextendedconjugationbasedontwosuccessivering-openingprocesses[j].inorg.chem.,2013,52,13432-13441；ii:keyinliu,huimingshang,xiuqikong,etal.anovelnear-infraredfluorescentprobeforh2o2inalkalineenvironmentandtheapplicationforh2o2imaginginvitroandinvivo[j].biomaterials,2016,100,162-171；iii:shilishen,xiaofanzhang,yanqingge,etal.anear-infraredlysosomalphprobebasedonrhodaminederivative[j].sensorsandactuab,2018,256,261-267)改进合成，并增加芳香氮芥共轭偶联以实现本发明之近红外荧光成像诊断协调光动力治疗和化学治疗的生物医药应用。

2、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在经改造后吸收波长为663nm，荧发射波谱长为716nm，为近红外吸收区。本发明所述的单分子多功能诊疗联用先导化合物是由n,n-二乙基叔氮基团、萜咕母核、芳香氮芥构成，实现同一分子具有线粒体靶向、近红外荧光成像诊断、近红外光动力治疗和化学治疗协同的多个功能为一体。

将本发明所述的单分子多功能诊疗联用先导化合物用乙醇溶解后得配成2×10^-5mol/l，在紫外-可见分光光度计测其吸光度值，结果见图5；在varyeclipse荧光分光光度计上测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，结果见图6，其激发波长为645nm，发射波长为716nm,符合650～900nm近红外荧光染料的光学特征。

3、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物光辐射产生单线态氧：

本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物光辐射产生单线态氧是用1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)漂白法测试。dpbf与单线态氧可发生定量反应，反应后其在410nm处的吸光度下降。该测试法中采用50μmdpbf为单线态氧捕获剂，20μm先导化合物在650nm的二极管激光灯以功率密度为200mw/cm²的条件下进行不同时间段的光辐射，用紫外-可见分光光度计测其不同时间照射后在410nm处的吸光度，然后用0rigin8对测得的数据进行整理。

4、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的细胞暗毒性和光毒性：

本发明采用mtt法考察所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对b16f10(鼠源黑色素瘤细胞和hepg2(人源肝癌细胞)的生长活性的影响。具体步骤如下：取处于对数生长期的肿瘤细胞，接种于96孔板中(5×10⁴个/ml)，放置5％co2、饱和湿度及37℃的培养箱中培养24h后，加入0,0.5,1,1.5,2,2.5,和3μm的受试化合物，暗室孵育20h，用光功率为200mw·cm-²的650nm二极管激光灯光辐射15min，孵育4h，然后每孔加入10μl(5mg/ml)的mtt溶液和90μl培养基，暗室37℃孵育4h，将孔内液体吸弃，每孔加入100uldmso，室温下振摇5分钟，用酶联免疫检测仪测490nmod值。细胞存活率公式为：存活率＝[od(样品)-od(空白)]/[(od细胞对照-od空白)]×100％。暗毒性考察不需灯照，其他条件同上。

5、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的线粒体靶向性：

本发明将b16f10或者hepg2细胞以5×10⁴每孔接种于培养皿中，孵育24h，然后换成含有2μm单分子多功能诊疗联用先导化合物培养液，孵育8h后换成含1μm线粒体靶向剂mito-trackergreen培养液，再次孵育半小时后用pbs清洗培养皿3次，加入1ml的pbs置于倒置荧光显微镜进行荧光成像拍摄，绿色荧光通道下拍摄先导化合物荧光，蓝色通道激发mito-trackergreen荧光，用imagej软件处理荧光图片。

6、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的细胞近红外荧光成像：

本发明将b16f10细胞5×10⁴每孔接种于6孔板中，孵育24h，然后换成含2μm的培养基，分别在孵育2min,5min,10min,30min时，弃去培养基，用pbs清洗3次，再加入1mlpbs置于倒置荧光显微镜下于绿色通道激发下拍摄先导化合物的荧光。7、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在细胞光辐射产生活性氧：

本发明测试细胞内的ros的产生采用2,7-二氯二氢荧光素-3,6-二乙酸酯(dcfh-da)为染料，通过检测细胞内dcf荧光来判断是否有ros产生。本发明将b16f10细胞5×10⁴每孔接种于6孔板中，孵育24h，然后换成含2μm的培养基，孵育8h，然后换含有2μm的dcfh-da的培养基孵育30min，用光功率为200mw·cm-²的650nm二极管激光灯光辐射15min，用pbs清洗3次，于荧光倒置显微镜下在蓝色通道激发下拍摄荧光。

8、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物体内近红外荧光成像：

本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在建有b16f10的c57小鼠模型上进行近红外荧光拍摄。(1)肿瘤部位注射荧光成像，将建有b16f10的肿瘤的c57置于小鼠活体成像仪下进行拍摄，然后肿瘤部位注射2μmol/kg先导化合物的乙醇溶液，分别在注射后0.5,1,2,4,6,24h时间点于小动物活体成像仪拍摄其体内近红外荧光成像。(2)尾静脉注射荧光成像，将建有b16f10的肿瘤的c57置于小鼠活体成像仪下进行拍摄，然后尾静脉注射1μmol/kg先导化合物的乙醇溶液，分别在注射后0,4,8,24h时间点于小动物活体成像仪拍摄其体内近红外荧光成像。

9、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物体内暗毒性和光毒性：

本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在建有b16f10的c57小鼠模型上考察体内暗毒性和光毒性。在b16f10肿瘤模型c57小鼠中挑选肿瘤大小在4～5mm大小的模型鼠，尾静脉注射2.0μmol/kg先导化合物的乙醇溶液，分别在注射药物前及注射后的每一天称小鼠体重及量其瘤子体积。所得数据用origin8进行处理。于第8天取出瘤子称重，并行h&e染色，与同期开展的生理盐水组进行比较。

10、本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物体内安全性：本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在c57小鼠体内安全性，在正常c57小鼠尾静脉注射先导化合物7天后，小鼠眼球取血，测定其天冬氨酸转胺酶(ast)、丙氨酸转移酶(alt)、肌酐(urea)及尿素(ucrea)并与给pbs小鼠进行比较先导化合物的肝功能和肾功能血清指标改变。同时取出小鼠心、肝、脾、肺及肾主要器官行h&e染色，考察尾静脉注射给先导化合物后对小鼠主要脏器的损伤。

本发明虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。